黄精多糖不依赖于LRP5激活信号通路调控成骨细胞分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.04.001

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (4): 493-498.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.04.001

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黄精多糖不依赖于LRP5激活信号通路调控成骨细胞分化

彭小明1，宗少晖2，曾高峰3，农梦妮3，杜力1，李珂珂1，何基琛1，施雄智1，吴云乐1

广西医科大学，1研究生学院，3公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2016-12-22 出版日期:2017-02-08 发布日期:2017-03-13
通讯作者: 通讯作者：宗少晖，教授，博士生导师，广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西壮族自治区南宁市 530021 并列通讯作者：曾高峰，教授，硕士生导师，广西医科大学公共卫生学院，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:彭小明，男，1990年生，湖南省道县人，汉族，广西医科大学在读硕士，主要从事脊柱外科学方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81360279)

Polygonatum sibiricum polysaccharide promotes osteogenesis by signaling pathway activation after LRP5 silencing

Peng Xiao-ming1, Zong Shao-hui2, Zeng Gao-feng3, Nong Meng-ni3, Du Li1, Li Ke-ke1, He Ji-chen1, Shi Xiong-zhi1, Wu Yun-le1

1Graduate School, 3School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Spine and Bone Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2016-12-22 Online:2017-02-08 Published:2017-03-13
Contact: Corresponding author: Zong Shao-hui, Professor, Doctoral supervisor, Department of Spine and Bone Surgery, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Corresponding author: Zeng Gao-feng, Professor, Master’s supervisor, School of Public Health, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Peng Xiao-ming, Studying for master’s degree, Graduate School, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81360279

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
LPR5蛋白：1996年在Gene 报道，LRP5低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因突变导致骨质疏松-假神经胶质瘤综合征( OPPG)导致严重骨质疏松和视力障碍。LRP5是一种细胞膜表面蛋白，是低密度脂蛋白受体(LDLreceptor)家族成员中一员，其基因被定位于染色体11q12-q13。LRP5蛋白作为Wnt细胞信号分子家族成员之一，必须结合LRP5/6和Frizzled形成一种功能性的配体受体复合物，通过典型的Wnt-β-catenin通道发挥作用。

摘要
背景：前期研究发现，黄精多糖通过Wnt/β-catenin信号通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化，但是其促进骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及分子机制尚不明确。
目的：探讨黄精多糖LRP5激活Wnt信号通路促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究。
方法：培养C57BL/6小鼠骨髓骨髓间充干细胞，构建LRP5干扰载体，转染C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞，转染后在荧光倒置显微镜下计算细胞荧光转染效率及Western Blot 检测LRP5蛋白的表达。碱性磷酸酶、茜素红染色和Western Blot分析转染LRP5-siRNA病毒后小鼠骨髓间充质干细胞成骨能力的改变；RT-PCR及双荧光素酶检测黄精多糖对沉默LRP5的小鼠骨髓间充干细胞的成骨分化作用。
结果与结论：①与对照组相比，LRP5转染组细胞显著降低细胞的矿化能力(P < 0.05)，明显降低Osterix、Runx2基因及LRP5蛋白的表达(P < 0.05)；②黄精多糖能促进转染LRP5-siRNA病毒的小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，能显著上调β-catenin及Osterix基因的表达(P < 0.05)，促使含有 TCF 结合位点的荧光素酶报告基因(TOPFlash)的高表达(P < 0.05)；③结果说明，LRP5在小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中有重要作用。黄精多糖不依赖于LRP5激活 Wnt/β-catenin 信号通路促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0174-1356(彭小明)

关键词: 组织构建, 骨细胞, 黄精多糖, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, Wnt/β-catenin通路, 病毒转染, 国家自然科学基金

Abstract:

Abstract
BACKGROUND: Our previous studies have found that polygonatum sibiricum polysaccharide (PSP) promotes osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) by Wnt/β-catenin signaling pathway, but the molecular mechanism is unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of PSP promoting the osteogenic differentiation via Wnt signaling pathways in BMSCs after LRP5 silencing.
METHODS: LRP5 interference vectors were constructed and then transfected into C57BL/6 mouse BMSCs cultured in vitro. The transfection efficiency of cells was calculated under fluorescence inverted microscope and the expression of LRP5 protein was detected by western blot assay. The osteogenic potential of BMSCs after LRP5-siRNA transfection was analyzed by alkaline phosphatase staining, alizarin red staining and western blot assay. Effect of PSP on the osteogenic differentiation of LIRP5-silenced mouse BMSCs was detected by real-time PCR and dual luciferase assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the mineralization ability, the mRNA expressions of Runx2 and Osterix, and the protein expression of LRP5 were significantly decreased in the LRP5-siRNA group (P < 0.05). PSP could promote LRP5-siRNA transfected mouse BMSCs differentiating into osteoblasts and significantly upregulated the expressions of β-catenin and Osterixin, and also induced the high expression of luciferase reporter gene (TOPFlash) containing wild type TCF binding sites (P < 0.05). To conclude, LRP5 plays an important role in the process of mouse BMSCs differentiating into osteoblasts. PSP can promote the osteogenic differentiation of mouse BMSCs by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway independent on LRP5.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Polygonatum, Membrane Proteins, Cell Differentiation, Osteoporosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

彭小明，宗少晖，曾高峰，农梦妮，杜力，李珂珂，何基琛，施雄智，吴云乐. 黄精多糖不依赖于LRP5激活信号通路调控成骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(4): 493-498.

Peng Xiao-ming1, Zong Shao-hui2, Zeng Gao-feng3, Nong Meng-ni3, Du Li1, Li Ke-ke1, He Ji-chen1, Shi Xiong-zhi1, Wu Yun-le1. Polygonatum sibiricum polysaccharide promotes osteogenesis by signaling pathway activation after LRP5 silencing[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(4): 493-498.

图/表（结果） 3

2.1 小鼠骨髓间充质干细胞生长情况及形态学变化消化传代培养24 h，细胞已开始贴壁，胞体呈圆形或多边形。培养3 d，贴壁细胞胞体明显增大并开始分裂增殖，此时细胞形态渐变为梭形，呈成纤维细胞样生长，形成大小不一的集落。贴壁的间充质干细胞逐渐呈脊梁状、鱼群状、漩涡状、网状或辐射状排列，细胞分裂增殖十分明显，胞浆丰富，核大，呈椭圆形。在4-8 d，培养的细胞长满培养瓶底的80%-90%并融合。传代培养的骨髓间充质干细胞在形态学上更加趋于一致，为排列更加有序的成纤维细胞样细胞，生长旺盛，胞核明显。培养6 d左右即可长满培养瓶底。骨髓间充质干细胞成骨夜诱导4 d后，细胞体积逐渐变大，呈

短梭形，诱导6 d细胞长满，大多呈多角形，细胞胞质内颗粒增多。继续诱导逐渐向多层生长，高密度区逐渐向成骨细胞方向转化，细胞外基质分泌多，并包裹细胞。

2.2 荧光转染效率的计算转染小鼠骨髓间充干细胞后48 h，加入嘌呤霉素筛选15 d后，分别统计各组(阴性转染组，shRNA-1组，shRNA-2组及shRNA-3组)不同视野下发荧光的细胞数，并计算转染效率，结果见表1，转染效率约为85%(大于70%)可用于下一步实验。由表1可知，各阳性转染组的转染效率与阴性组相比，差异无显著性意义。因此得出，各组荧光转染效率无差异。这也为后续实验筛选靶点提供基础。

2.3 筛选LRP5转染组靶点转染小鼠骨髓间充干细胞 48 h后，Western blot检测小鼠骨髓间充干细胞的LRP5蛋表达水平，未转染组为对照，对LRP5蛋白定量分析。各LRP5-shRNA转染组LRP5 蛋白表达水平有不同程度的下调，以LRP5-shRNA-1转染组最为明显，对照组内LRP5蛋白表达水平无明显改变。Image J软件分析表明，小鼠骨髓间充干细胞中各LRP5-shRNA转染组LRP5蛋白表达水平可下调70%-90%(图1)，LRP5-shRNA-1组为最佳LRP5-shRNA组，后续实验选取LRP5-shRNA-1转染组。

2.4 LRP5基因缺失抑制小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化为了进一步验证LRP5在小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的调控作用，实验构建了小鼠的LRP5慢病毒表达载体。通过感染原代人骨髓间充质干细胞来抑制LRP5。将稳定表达LRP5-shRNA-1的细胞成骨诱导7 d和21 d，碱性磷酸酶和茜素红染色观察人骨髓间充质干细胞成骨分化能力。结果发现，LRP5抑制组(LRP5-shRNA-1组)小鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性降低，茜素红染色分析显示矿化能力明显减弱(图2A)。

为了进一步确定LRP5基因缺失对成骨分化的抑制作用，小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导14 d后提取蛋白，检测成骨特异性基因Runx2和Osterix的蛋白表达。结果显示LRP5缺失能够显著降低Runx2，Osterix的蛋白表达(图2B)。以上结果证明，LRP5- siRNA-1组减弱小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化能力。

2.5 黄精多糖对LRP5-shRNA小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响前期的研究在小鼠骨髓间充质干细胞证实沉默LRP5，对成骨细胞具有抑制作用。将稳定表达LRP5-shRNA-1的细胞成骨诱导14 d，加入黄精多糖25 mg/L或者加入PBS。通过qRT-PCR方法检测Wnt通路重要因子β-catenin和成骨特异性基因Osterix的表达。结果显示黄精多糖能够显著逆转LRP5缺失导致的β-catenin，Osterix的基因下降(图3)。以上结果证明，黄精多糖不依赖于LRP5激活Wnt信号通路中的重要因子β-catenin，促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。

2.6 黄精多糖对LRP5-shRNA骨髓间充质干细胞TOP/ FOP Flash荧光活性的影响与对照组相比，阴性转染组与LRP5-shRNA-1组加入黄精多糖(25 mg/L)后， TOPFlash报告基因的荧光素酶活性显著增强，各组FOPFlash报告基因没有显著变化(表2)。结果说明黄精多糖可不依赖于LRP5增强β-catenin/TCF的转录活性，激活Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因的表达。

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引言

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计以细胞为观察对象的体外平行对照实验。

1.2 时间及地点实验于2015年10月至2016年8月在广西医科大学医学实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(P6)，购自广州赛业生物科技有限公司。

主要试剂：黄精多糖，纯度98%(陕西慈缘生物技术有限公司)；LRP5、Runx2、Osterix及β-actin抗体(美国abcam公司)；Trizol试剂(日本TaKaRa公司)；反转录试剂盒(美国TaKaRa公司)；荧光定量试剂盒(日本TaKaRa公司)；LRP5-siRNA病毒(上海吉凯公司)；海肾荧光素酶载体 pRL-TK、双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega 公司)；茜素红染液、碱性磷酸酶检测试剂盒和成骨诱导液(广州赛业公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充干细胞培养小鼠骨髓间充干细胞培养于L-DMEM培养液(含体积分数10%澳洲胎牛血清，青霉素 100 mg/L，链霉素100 mg/L)中，37 ℃，体积分数5%CO₂孵箱内培养，待细胞贴壁融合达80%-90%时(一般需 5-8 d)，弃培养基，PBS清洗，加入胰酶消化液37 ℃消化2-5 min，倒置相差显微镜观察大部分细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，加入完全培养基终止消化，以1∶4的比例传代培养得到下一代细胞，每隔2 d换液。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，直至贴壁细胞融合，依据前述方法再次传代。以此反复贴壁法。传代后用于续实验，实验用细胞均处于对数生长期。

1.4.2 LRP5 shRNA慢病毒载体的构建 siRNA的设计与合成根据GenBank中LRP5基因已知序列(CON077，NM_ 008513)，按siRNA序列设计原则，应用Genepharma siRNA designer设计siRNA。并将选出的siRNA序列进行BLAST搜索作同源性分析，以保证序列的特异性。siRNA 由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。针对LRP5基因构建的3条siRNA，分别为siRNAl：TGA CTC AAT ATA GCG ATT A；siRNA2：GAC CTA AAG CGA ATC GAA A； siRNA3：GAC CTG ATG GGA CTCA AA。阴性组siRNA：TTC TCC GAA CGT GTC ACG T。将针对LRP5基因的3个siRNA的DNA Oligo，经退火形成双链DNA，通过T₄ DNA 连接酶插入到经Age I和Eco R双酶切后的载体hU6-MCS-CMV-EGFP (GV115)中，连接产物转化感受态细胞 DH5a，2 mg/L嘌呤霉素的培养基培养，提取阳性重组载体的克隆通过PCR测序鉴定。慢病毒包装质粒操作严格按照吉凯基因慢病毒包装系统说明书，由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。

1.4.3 重组 shRNA 慢病毒感染转染前24 h，胰酶消化处于对数生长期的细胞并计数，将细胞接种至6孔细胞培养板，每孔接种5×10⁵个细胞。置于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱培养。培养1 d后，按照感染复数(MOI)5，10，20，50，100分别感染C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞，应用无血清培养基培养8 h后，然后加入L-DMEM培养液继续培养72 h后，通过荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况，以评估慢病毒的感染效果，未转染组不加入病毒，其他与转染组处理相同。　

1.4.4 荧光显微镜检测转染效率转染荧光素标记的LRP5-shRNA的单克隆稳定株骨髓间充干细胞，避光孵育 48 h后，用4 ℃的PBS洗3次，消化收集细胞，涂片，荧光显微镜下观察绿色荧光细胞。每组均设3个复管，并重复3次。

1.4.5 Western blot分析转染72 h后，收集不同处理组细胞，预冷PBS洗3次，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂PMSF，提取蛋白质，测定浓度。取样品40 μg以10%的 SDS-PAGE 电泳，分离胶上的目的蛋白在，电转液中以恒压100 V、90 min条件下转移至0.45 μm硝酸纤维素膜(NC膜)，5%脱脂奶，常规转膜，脱脂奶粉封闭，加一抗(LRP5、Runx2及Osterix)，4 ℃孵育过夜，TBST洗脱5 min ×3次，避光孵育Dylight 680标记的荧光二抗(1∶500) 2 h， TBST洗脱10 min×3次，ECL化学发光显像，Image J软件测定灰度值。以β-actin作为内参照，每个样本重复3次。

1.4.6 Real-time PCR分析将转染72 h细胞，稳定表达LRP5-shRNA-1组、阴性转染组及空白组细胞，成骨诱导14 d，同时加入PBS或者黄精多糖25 mg/L(前期研究中获得最佳浓度)^[11]。检测按Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，用酶标仪(Thermo Multiskan GO，USA)进行浓度和纯度的测定。

按照反转录试剂盒(Thermo fisher)说明书将2.5 μg总RNA反转录合成cDNA。使用SYBR PrimeScrip RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录反应。反应体系的配制在冰上进行。然后根据ROCHE公司荧光定量试剂盒说明书将cDNA加入PCR反应体系(20 μL)，在冰上避光进行配制，根据ABI PRISM 7500 Fast Real- TimeSystem中进行反应行qRT-PCR反应。每个样品做3个复孔，重复3次实验，PCR扩增反应完成后，系统自动绘制扩增曲线和熔解曲线，并采集CT值。首先根据采集到的每个样本的各个基因的CT值来计算其?Ct值：?Ct=CT目的基因-CT内参。再根据阳性对照组及实验组样本和阴性对照组样本©的?Ct 值计算??Ct值：??Ct=?Ct 实验组-?Ct对照组。然后计算2^-??Ct的值。所有引物均由TaKaRa公司设计并合成。引物序列(5’-3’)：β-catenin上游引物：GCG TGG ACA ATG GCT ACT CAA G；下游引物：GTC ATT GCA TAC TGC CCG TCA A；Osterix上游引物：GAG TAG GAT TGT AGG ATT GG；下游引物：ATG GCG TCC TCC CTG CTT GAG GAG GAA G。

1.4.7 碱性磷酸酶活性检测将稳定表达LRP5-shRNA-1组、阴性转染组及空白组细胞分别种在24孔板，连续成骨液(加入PBS或者黄精多糖25 mg/L)诱导干预14 d后，用预冷的PBS洗涤3遍，取碱性磷酸酶检测试剂盒(广州赛业公司)中新鲜配制的底物100 μL，加细胞裂解产物，37 ℃温箱内孵育30 min，加氢氧化钠终止反应，免疫酶联仪检测，波长为410 nm。除特殊说明用量外，0.4 mol/L氢氧化钠用 100 μL，细胞裂解产物用40 μL。空白对照为底物加入细胞裂解产物后用氢氧化钠终止，以此调零。根据酶活性定义，计算出样品中的碱性磷酸酶活性。

1.4.8 茜素红染色定量检测将稳定表达LRP5-shRNA-1组、阴性转染组及空白组细胞种在12孔板中成骨诱导(加入PBS或者黄精多糖25 mg/L)干预28 d后，PBS冲洗3次，体积分数70%冰乙醇固定1 h，去离子水洗3次，加入茜素红染液于37 ℃染色10 min，去离子水洗3次，PBS孵育20 min，倒置相差显微镜下观察矿化结节计数，每孔细胞随机计数3个视野。计算矿化结节面积比。

1.4.9 双荧光素酶报告基因的检测转染质粒前48 h，将稳定表达LRP5- shRNA-1组、阴性转染组及空白组细胞以 1×10⁴孔密度接种至96孔板中，根据lipofectamine 2000 (Invitrogen)操作说明书向每孔中共转染100 ng TOPFlash (荧火虫荧光素酶)或FOPFlash(对照肾素荧光素酶)和 20 ng pRL-TK质粒。

转染8 h后，按前述实验分组更换诱导液(加入PBS或者黄精多糖25 mg/L)，继续培养48 h，收集培养液后，用1×PBS(pH 7.4)清洗细胞，每孔加入100 μL双荧光素酶检测试剂盒中的细胞裂解液，进行细胞裂解收集。取20 μL细胞裂解产物，进行目的报告基因荧火虫荧光素酶及内对照海肾素荧光素酶检测，计算荧火虫荧光素酶的表达值与对照肾素荧光素酶表达值的比值。每实验组每种质粒平行做3个复孔，取平均值，重复3次实验。

1.5 主要观察指标小鼠骨髓间充质干细胞生长情况及形态学变化，成骨指标碱性磷酸酶、茜素红染色定量分析，成骨相关基因Runx2和Osterix的表达。双荧光素酶报告基因(TOPFlash和FOPFlash)的表达。

1.6 统计学分析所有实验数据使用x(_)±s表示，多样本均数采用SPSS 16.0 统计软件进行单因素方差分析，LDS检验进行两组间比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

骨重建是一个动态的、持续的过程，保持一个稳态的骨量，骨质疏松症是以骨吸收和骨形成的不平衡导致骨变性疾病，它是受成骨细胞和破骨细胞介导的新旧骨之间的平衡^[12-13]。随着人口的逐渐老龄化，骨质疏松症已逐渐成长为一个全球性的健康问题，尤其50岁以上的妇女，由于其脆性下降和骨密度下降容易导致骨折，骨质疏松性骨折可以增加患者的致残率，能导致髋关节和脊椎骨折，有较高的死亡率^[14]。目前由于骨质疏松症并没有受到太多的关注，而且药物不良反应大和对治疗的依从性差，骨质疏松的治疗仍然面临巨大挑战^[15]。骨髓间充质干细胞是多能性干细胞，能够自我更新和分化成各种类型的细胞，包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。植入骨髓间充质干细胞能有效地增加局部骨量，增加骨密度，改善局部骨质疏松，纠正骨代谢不平衡，减少骨量丢失，增加骨，为局限性骨质疏松症的治疗提供了新的方法^[16-17]。

在过去的几十年研究中，Wnt信号通路调节骨生物学和疾病引发了极大的兴趣^[18]。Wnt信号通路可分为经典Wnt信号通路，即Wnt/β-catenin依赖途径和不规范β-catenin依赖Wnt信号通路，这反过来又可以分为平面细胞极(平面细胞极性，PCP)和Wnt/Ca^[19]。Wnt信号通路的规范主要影响骨髓间充质干细胞分化发展阶段之间的信号，骨髓间充质干细胞成骨细胞系的过程中，经典Wnt信号通路促进干细胞在促进成骨细胞分化方向^[20]。Wnt信号通路在调节中扮演着重要的角色，它的监管机制已成为骨组织工程研究的热点，但也提供了一种新的方法用于治疗骨代谢疾病和手段^[21]。LRP5作为Wnt受体和β-catenin上游基因在骨代谢中起着重要的作用。LRP5功能与蛋白质的共受体Frizzled结合细胞外Wnt蛋白导致细胞内β-连环蛋白的稳定。稳定的β-catenin转运到细胞核，与淋巴增强子结合因子/T细胞因子(LEF1/TCF)调节转录Wnt反应基因^[22]。小干扰RNA (siRNA)是一个强大的工具，特别是有效地沉默靶基因通过解除一个单链基因表达调节^[23]。

黄精多糖可能在骨质疏松症中发挥重要作用，已有的研究报道，黄精多糖可以直接通过Wnt/β-catenin促进成骨分化的MSCs连环蛋白依赖的途径，但具体的分子机制尚不清楚^[24]。由于这些以前的研究结果，推测，黄精多糖是一种有效的激活Wnt/β- catenin促进骨髓间充质干细胞成骨分化的药物，评估了黄精多糖对体外培养的骨髓间充干细胞成骨分化的影响，在这项研究中，黄精多糖可促进成骨髓间充质干细胞成骨细胞分化和经典Wnt/β-catenin信号，OPG/RANKL信号通路等多个信号通路在成骨细胞的增殖和分化过程中起重要作用^{[11, 25]}。结果发现，黄精多糖可以明显提高成骨转录因子Runx2、碱性磷酸酶和骨钙蛋白。转染沉默LRP5的siRNA小鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性降低，茜素红染色分析显示矿化能力明显减弱，检测成骨特异性基因Runx2和Osterix的蛋白表达下降(图2)，证明LRP5对小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化具有重要作用。研究表明，黄精多糖对骨形成的促进作用不是由参与Wnt信号级联的初始步骤因子介导的。此外，转染沉默的LRP5-siRNA小鼠骨髓间充干细胞明显降低β-catenin基因水平。黄精多糖不依赖于LRP5可激活β-catenin，并且反转录LRP5导致的特异成骨因子Osterix基因下降(图3)，黄精多糖可以激活β-catenin进入细胞核与Runx2基因启动转录因子的激活作用，基因突变分析表明，可以通过Runx2 tcf1基因区域的监管场所，直接促进Runx2基因的表达，从而促进成骨。进一步证实了黄精多糖可以通过不依赖于LRP5激活Wnt信号通路下游的β-catenin促进转录因子Runx2(主要成骨细胞向成骨细胞分化的一个分子开关)表达(表2)，进一步分析黄精多糖对LRP5干扰载体载体细胞的β-catenin基因和下游TCF转录因子的影响和控制表面的稳定性的作用。这些结果进一步支持黄精多糖可以通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化的可能性。然而，需要进一步的体内实验研究证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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黄精多糖不依赖于LRP5激活信号通路调控成骨细胞分化

Polygonatum sibiricum polysaccharide promotes osteogenesis by signaling pathway activation after LRP5 silencing

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