干细胞诱导、细胞系诱导和原代分离3种提取成骨细胞的方法比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.017

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2729-2934.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.017

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

干细胞诱导、细胞系诱导和原代分离3种提取成骨细胞的方法比较

邓享誉，陈胜，邵增务，郑东

华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北省武汉市 430000

修回日期:2017-05-05 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 郑东，博士，副教授，副主任医师，华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北省武汉市 430000
作者简介:Deng Xiang-yu, Department of Orthopedics, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huangzhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, Hubei Province, China
基金资助:
国家自然科学基金资助(81472134)

Three methods to isolate osteoblasts: stem cell induction, cell line induction and primary isolation

Deng Xiang-yu, Chen Sheng, Shao Zeng-wu, Zheng Dong

Department of Orthopedics, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huangzhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, Hubei Province, China

Revised:2017-05-05 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Zheng Dong, M.D., Associate professor, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huangzhong University of Science and Technology, Wuhan 430000, Hubei Province, China
About author:邓享誉，女，1993年生，四川省自贡市人，汉族，2016年华中科技大学毕业，主要从事椎间盘退变机制和椎间盘组织工程研究。
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81472134

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。也指可长期连续传代的培养细胞。由此便引申出了后来的有限细胞系、无限细胞系，因此，细胞系狭义是指可连续传代的细胞，广义是指可传代的细胞。
诱导分化：细胞分化是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程。细胞分化的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达，通过不同基因表达的开启或关闭，最终产生标志性蛋白质。诱导分化即人为干预或外在因素作用下，使得细胞向特定方向成熟的过程。

摘要
背景：成骨细胞是骨组织构建的重要组织细胞之一。成骨细胞取材困难，不同方法获得的成骨细胞纯度及钙化能力不尽相同。
目的：比较小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导、细胞系MC3T3-E1成骨诱导和小鼠颅骨原代细胞培养3种方法获得的成骨细胞的纯度及钙化能力。
方法：采用贴壁纯化法分离出小鼠骨髓间充质干细胞，传至3代后用成骨诱导培养基诱导21 d；将前成骨细胞系MC3T3分别用成骨诱导培养液1和成骨诱导培养液2诱导21 d；使用Ⅰ型胶原酶消化法取得乳鼠颅骨原代成骨细胞。对3种方法获得的成骨细胞进行茜素红钙结节染色，观察其成骨特性。
结果与结论：①骨髓间充质干细胞诱导后钙结节平均为16.3个/低倍镜视野；②前成骨细胞系MC3T3诱导培养液1组可观察到稀疏的钙结节，平均为1.7个/低倍镜视野，诱导培养液2组可观察到密集的钙结节，平均为44.6个/低倍镜视野，两种诱导液相比钙结节形成能力差异有显著性意义(P < 0.01)；③原代成骨细胞钙结节平均为0.6个/低倍镜视野；④除MC3T3诱导液1组与原代成骨细胞相比差异无显著性意义外，其余两两相比成骨能力差异均有显著性意义(P < 0.01)；⑤由于骨髓间充质干细胞分离培养具有更多不可控因素，因此MC3T3细胞用含有地塞米松的诱导培养液2进行成骨诱导方法较好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-3250-2833(郑东)

关键词: 干细胞, 分化, 骨髓间充质干细胞, MC3T3, 成骨细胞, 成骨诱导, 钙结节染色, 吉姆萨染色, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Osteoblasts have become a kind of important seed cells in bone tissue engineering. However, it is difficult to harvest osteoblasts, and the purity and calcification ability of osteoblasts isolated by different methods are inconsistent.
OBJECTIVE: To compare the purity and calcification ability of osteoblasts induced from mouse bone marrow mesenchymal stem cells, MC3T3 cell lines, and cultured primarily from the neonatal mouse cranium.
METHODS: Mouse bone marrow mesenchymal stem cells were isolated by differential adhesion method, and after passaing, passage 3 cells were cultured in osteogenic induction medium for 21 days. MC3T3 cell lines were cultured in osteogenic induction media 1 and 2 for 21 days. Osteoblasts were cultured primarily from neonatal mouse cranium by type I collagenase digestion method. Calcium nodules of osteoblasts obtained by three methods were observed by Alizarin red staining to detect osteogenic activity of cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) There were average 16.3 calcium nodules per low-power field after osteogenic induction of bone marrow mesenchymal stem cells. (2) There were sparsely distributed calcium nodules in MC3T3 cells after induction with osteogenic induction medium 1, accounting for 1.7 calcium nodules per low-power field, while there were dense calcium nodules in MC3T3 cells after induction with osteogenic induction medium 2, accounting for 44.6 calcium nodules per low-power field. There was a significant difference in the calcium nodule formation ability between the two groups (P < 0.01). (3) After primary culture, there was only 0.6 calcium nodule per low-power field. (4) Except for the insignificant difference between osteogenic induction medium 1 and primary culture groups, there were significant differences in pair-wise comparison of any other two groups. Except the insignificant difference between group I of MC3T3 inducing conditional media and primary culture osteoblasts, there were significant differences in the osteogenic ability between groups (P < 0.01). In conclusion, it is a better method to culture MC3T3 cells in osteogenic induction medium 2 containing dexamethasone, because many uncontrollable factors are involved in the isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells.

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Osteoblasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

邓享誉，陈胜，邵增务，郑东. 干细胞诱导、细胞系诱导和原代分离3种提取成骨细胞的方法比较[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2729-2934.

Deng Xiang-yu, Chen Sheng, Shao Zeng-wu, Zheng Dong. Three methods to isolate osteoblasts: stem cell induction, cell line induction and primary isolation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2729-2934.

图/表（结果） 1

2.1 小鼠骨髓间充质干细胞形态及成骨诱导结果 接种第2天细胞开始贴壁，细胞发亮，折光性强，此时细胞呈长椭圆形，两端有小角，培养至第3代时，细胞呈长梭形，细胞体积较大，核明显(图1A)。以C57小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基培养至第21天时，细胞形态变大，形状不规则，可见细胞核多个，行钙结节茜素红染色，可见大颗粒状红色钙结节，分布较密集，形态不典型(图1B，C)，选取6个孔行钙结节数量统计，平均为16.3个/低倍镜视野。

2.2 MC3T3细胞形态及成骨诱导结果 倒置显微镜下可见MC3T3细胞呈长梭形，细胞发亮，折光性强，核明显。细胞接种至24孔板后，以诱导培养基1和诱导培养基2分别培养，至第21天时，细胞呈层状排列生长，茜素红染色后出现红色钙结节，形态各异，大小不一，存在于细胞群中，周围细胞辐射状排列。选取6个孔行钙结节数量统计，诱导培养液1培养后钙结节数量平均为1.7个/低倍镜视野(图2)，诱导培养液2培养后钙结节数量平均为44.6个/低倍镜视野(图3)。两种诱导液相比钙结节形成能力差异有显著性意义(P < 0.01)。

2.3 成骨细胞原代培养及成骨特性 小鼠成骨细胞进行吉姆萨染色后倒置显微镜观察，可见细胞折光性强，胞质染淡紫色，细胞胞核染蓝紫色，细胞形态各异，触角多，向四周延伸(图4)。钙结节染色后可见稀疏钙结节形成，选取6个孔行钙结节数量统计，平均为0.6个/低倍镜视野(图5)。

2.4 各种方法钙结节形成能力比较 3种培养或诱导方法均可得到具有成骨特性的成骨细胞，除MC3T3诱导液1诱导组与原代成骨细胞之间相比无显著差异外，其余两两相比成骨能力差异均有显著性意义(P < 0.01)，3种操作方法实践可行，见图6。

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引言

成骨细胞是组织工程的重要种子细胞，很多疾病如骨质疏松、骨缺损、骨折不愈合以及一些成骨相关的肿瘤等，其发生发展过程都与成骨细胞、破骨细胞的生理病理活动密不可分^[1-2]。现在的前沿研究大多集中在成骨、破骨相关通路的分子机制，以及成骨细胞或骨髓间充质干细胞负载相关生物材料对骨缺损或软骨缺损进行修复的研究上，这些都离不开成骨细胞的培养和干预。成骨能力和成骨过程受多因素、多通路的调控^[3-9]，成骨细胞作为骨形成的主要功能细胞，在分化成熟过程中会逐步表达如碱性磷酸酶、骨钙素、血清Ⅰ型前胶原C端肽等特异性标志物。同时，在此过程中也会受到一系列转录因子的调控，如Runt 相关转录因子2(Runx2)、Osterix/Sp7、β-catenin、转录激活因子4、核转录因子激活蛋白1、Smads等，它们彼此协同作用，共同参与调节成骨细胞分化及骨形成。其中BMP-Smads 信号通路是参与调控间充质干细胞向成骨细胞分化及骨形成的关键信号通路之一，同时其自身也受到多种细胞因子的调节，从而在生物体内形成了复杂调控网络。Wnt/β-catenin信号通路在调节间充质干细胞向成骨细胞分化及骨形成方面也具有重要作用。总之，成骨细胞负责骨基质的合成、分泌、矿化^[10]，在骨组织修复、生长发育、骨量平衡中起着重要作用，是骨质疏松、骨折等骨病研究的热点之一^[11-13]。成骨细胞也是生物学材料研究的重点，如材料对于成骨细胞的促进或抑制作用^[14-17]，材料与成骨细胞的生物相容性等^[1^，^18-20]，MC3T3是C57BL/6乳鼠源性的成骨细胞，E1指的是他的亚属，属于前成骨细胞系，因其来源方便，可连续传代，细胞性质稳定，也成为骨科科学及组织工程研究热点^[21-24]，另外有研究发现，某些骨恶性肿瘤的发生、发展以及转移的过程，也与成骨细胞有着密切关系^[25]。

在成骨分化过程中，骨基质的合成与分泌是其最为基本的特征，骨基质形成的钙结节是成骨细胞分化成熟并且具有成骨能力的重要标志及形态学表现^[26-28]。Wittrant等^[29]发现骨髓基质细胞可分泌并释放骨保护素和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)来调节破骨细胞的发生、骨吸收活性和凋亡等。实验用小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导、细胞系MC3T3成骨诱导和小鼠颅骨原代细胞培养3种方法获得成骨细胞，比较3种不同方法获得成骨细胞的纯度及钙化能力，以期为后期有关成骨细胞研究提供指导意义。

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 2015年10月至2016年3月在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室及湖北大学材料科学与工程学院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 出生1-5 d的新生C57BL/6乳鼠6只，雄性，体质量2-4 g，出生2-4周的C57BL/6小鼠6只，雄性，体质量10-20 g，均由华中科技大学同济医学院动物中心提供，审批号：SCXK(鄂)2016-0009。

1.3.2 试剂及仪器 MC3T3细胞系为华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室颜欣欣博士馈赠。胎牛血清(美国Gibco公司)；双抗、胰酶、磷酸盐缓冲液、F12-DMEM标准培养基、H-DMEM标准培养基、α-DMEM标准培养基、C57小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基(美国Sigma 公司)；CKX41 倒置相差显微镜(日本Olympus 公司)；LEICA-DMI4000B 倒置荧光显微镜(德国LEICA 公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠骨髓间充质干细胞的培养及成骨诱导 出生2-4周的C57BL/6小鼠6只，在符合动物伦理的情况下行颈椎离断处死，然后浸泡于体积分数为75%乙醇中15 min，在无菌条件下从小鼠后肢踝关节处剪开皮肤，并向髋部分离直至到达骶尾椎，取两侧股骨和胫腓骨，剔除多余组织，浸泡于体积分数为75%乙醇10 min后剪开干骺端，用5 mL无菌注射器，反复抽取F12-DMEM培养基轻柔冲洗髓腔至少5次，100 μm细胞过滤器过滤后1 200 r/min离心5 min，弃上清；加入10倍细胞体积(约3 mL)的无菌1×红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，在冰上裂解10 min，再1 000 r/min离心5 min，弃淡红色上清以去除红细胞；用F12-DMEM培养液重悬沉淀洗涤1次。用含体积分数10%的胎牛血清、1% PS的F12-DMEM培养液5 mL重悬骨髓细胞，接种于25 cm²塑料培养瓶中，于37 ℃、体积分数5%CO₂培育箱静置培养过夜(约16 h)，用F12-DMEM培养液轻轻清洗培养瓶底部细胞3次，以便将悬浮细胞去除，注意动作轻柔，再加入4 mL F12-DMEM新鲜培养基继续培养细胞。3 d后，弃上清换液，直至细胞增殖至合适密度。取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于24孔板，使用C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基培养，每两三天换液1次，诱导21 d后行茜素红钙结节染色。

1.4.2 MC3T3细胞系的成骨诱导 取生长状态良好的第3代MC3T3细胞，以1×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种于24孔板中，分别用2种成骨诱导液培养，诱导液1的配置：α-DMEM+体积分数为10%胎牛血清+0.2 mmol/L抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸钠，诱导液2的配置：α-DMEM+体积分数为10%胎牛血清+0.2 mmol/L抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+100 nmol/L地塞米松。以上2种诱导培养均每两三天换液1次，诱导21 d后用PBS清洗细胞，体积分数为95%乙醇固定，茜素红染液室温染色30 min后光镜观察。

1.4.3 成骨细胞原代获取及成骨特性^[30] 无菌条件下取出新生1周内的C57BL/6小鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织，PBS清洗3次，将其置入盛有H-DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，加入血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶 10 mL，置于孵箱中消化60 min，取上清以1 000 r/min离心10 min，使细胞沉淀，剩余骨片以同样方法用1.0 g/L Ⅰ型胶原酶消化60 min，取上清以1 000 r/min离心10 min，使细胞沉淀，收集两次消化所得细胞，PBS洗涤2次，以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至2个25 cm²培养瓶，于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱培养，48 h后换液，以后隔日换液1次，直至细胞融合至90%左右。取原代成骨细胞行吉姆萨染色和茜素红钙结节染色。

以上实验在相同条件下重复3次。

1.5 主要观察指标 钙结节形成能力。

1.6 统计学分析 以Prism6统计学软件进行统计分析，使用one-way ANOVA统计学方法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

成骨细胞是组织工程的重要种子细胞，诸多疾病研究涉及到成骨细胞的培养和干预过程^[7^，⁹^，²¹^，^31]，不同方法获得的成骨细胞值得比较，以期为其他实验研究提供指导。实验以茜素红染色钙结节。茜素红是一种阴离子染料，很容易与多种金属离子络合生成红色络合物，常作为光度分析显色剂用于无机离子分析。茜素红染色原理就是茜素红和钙发生显示反应，产生一种深红色的带色化合物，这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色，在光学显微就下可被观察和统计。课题实验使用3种方法获得成骨细胞，且都观察到了具有典型形态的钙结节，说明这3种方法获得的成骨细胞均具有相应的成骨能力。

骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子来支持造血，同时具有强大的多项分化能力，目前常用的分离骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞在低血清培养基中有贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化及扩增间充质干细胞的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分密度的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。随着对骨髓间充质干细胞表面抗原认识的深入，又有人利用流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化。但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之成本较高和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。实验使用的是全骨髓法并进行了相应的改进，获得的骨髓间充质干细胞纯度较高，数量可观，总的来说，骨髓间充质干细胞诱导培养成本较高，获得的钙结节形态不够典型，数量平均为16.3个/视野，与原代成骨细胞相比，成骨能力有显著提高(P < 0.01)，但其钙结节形态不够典型，体积偏大，形态不规则，其获得的成骨细胞形态呈多边形，有触角，这可能与长时间的诱导过程有关。

在细胞系MC3T3的诱导过程中，实验采用了2种诱导液，即诱导液1为α-DMEM+体积分数为10%胎牛血清+ 0.2 mmol/L抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸钠，诱导液2为α-DMEM+体积分数为10%胎牛血清+0.2 mmol/L抗坏血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+100 nmol/L地塞米松，其区别在于诱导液2加入了激素地塞米松，因现在各个实验室所使用的诱导培养液的配方有所差别，地塞米松是否需要添加以及添加的量无统一标准，故而课题组设计此2种不同的诱导培养液，以探讨地塞米松对于细胞系MC3T3-E1成骨诱导过程的必要性和意义。所得到的结果也是大相径庭：未加入地塞米松组与原代成骨细胞相比，钙结节数量差异无显著性意义(P > 0.05)，加入地塞米松组与原代成骨细胞相比，钙结节数量有显著增加(P < 0.01)，而这2组不同诱导液之间，钙结节数量差异也有显著性意义(P < 0.01)，这个结果证明了地塞米松在成骨细胞系MC3T3的诱导过程中起着重要的作用，它可以促进细胞系的分化和成熟，并形成具有典型形态的钙结节，地塞米松是细胞系在成骨诱导过程中不可或缺的，当然，地塞米松在使用的剂量和持续作用时间上仍值得进一步探究，除了地塞米松之外，其他的激素类物质是否也具有同样或者更好的诱导效果也值得进一步探究。

作者在提取原代成骨细胞过程中，总结出以下经验：应将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mL PBS中，PBS不要放太多，否则延长剪碎时间，用剪刀剪成1 mm×1 mm大小组织块时，越小越好(越小越能消化完全)，1只乳鼠的头盖骨加胰酶2 mL，37 ℃水浴中消化30 min(目的是消化掉附着骨片上的结缔组织)，离心去酶，加入2 mL胶原酶Ⅱ，水浴中继续消化过程中，应该间隔晃动，使消化下来的胶原离开团块溶于液体中。如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以加适量的PBS，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。离心后去掉上清液，用PBS悬浮细胞，如果发现还有很多的骨片，将骨片单独取出继续用胶原酶Ⅱ做第二次消化，第一次胶原酶Ⅱ消化的细胞悬液和第二次胶原酶Ⅱ消化的细胞悬液混匀。如果担心胶原酶Ⅱ会影响细胞的生长，可以将2次的细胞悬液离心，去掉上清液后，用培养基重悬。实验将原代成骨细胞均匀铺板至6孔板中用培养基培养21 d后进行吉姆萨染色可以清楚地看到成骨细胞染蓝紫色的细胞核和染淡紫色的细胞质，细胞形态典型，茜素红钙结节染色可见散在稀疏的小钙结节，染色结果不理想，可能与细胞生长时间较短，较易老化有关。如何延缓成骨细胞的老化，药物实验中怎样使用药物干预使得成骨细胞可以在进入老化状态之前真实可靠地反映出药物对它的作用，也将成为接下来需要进一步探究的要点。

比较3种诱导方式或分离提取方式可以看出，原代成骨细胞的分离提取是生物细胞实验的基础，MC3T3细胞系以成骨诱导液2的诱导，是比较稳定的可以获得成骨细胞的方法，MC3T3细胞系以成骨诱导液1的诱导无明显成骨作用，骨髓间充质干细胞也可得到具有成骨能力的成骨细胞，但诱导培养液费用高，易污染，相比于MC3T3细胞系的诱导具有更多不可控因素，如骨髓间充质干细胞的提纯，诱导时间和不同厂家诱导培养液配置的不同，相比之下，MC3T3细胞用诱导培养液2进行成骨诱导可以得到较多具有成骨能力的成骨细胞。

干细胞诱导、细胞系诱导和原代分离3种提取成骨细胞的方法比较

Three methods to isolate osteoblasts: stem cell induction, cell line induction and primary isolation

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