apelin干预骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的生存和血管再生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.002

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (1): 6-12.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.002

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apelin干预骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的生存和血管再生

侯婧瑛，汪蕾，钟婷婷，周长青，郭天柱，龙会宝，伍权华，郑韶欣，吴浩，王彤

中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120

修回日期:2016-11-28 出版日期:2017-01-08 发布日期:2017-03-15
通讯作者: 王彤，博士，博士生导师，教授，主任医师，研究员，中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120
作者简介:侯婧瑛，女，1985年生，安徽省庐江县人，汉族，2012年中山大学孙逸仙纪念医院毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞与心血管疾病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81070125)；国家自然科学基金(81270213)；国家自然科学基金(81670306)；广东省科技计划项目(2014A020211002)；广东省科技计划项目(2010B031600032)；高校基本科研业务费中山大学青年教师重点培育项目(13ykzd16)；广东省医学科研基金(A2016264)

Influence of apelin on survival and vascularization potential of bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxic and ischemic conditions

Hou Jing-ying, Wang Lei, Zhong Ting-ting, Zhou Chang-qing, Guo Tian-zhu, Long Hui-bao, Wu Quan-hua, Zheng Shao-xin, Wu Hao, Wang Tong

Department of Emergency, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Revised:2016-11-28 Online:2017-01-08 Published:2017-03-15
Contact: Wang Tong, M.D., Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Researcher, Department of Emergency, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Hou Jing-ying, Master, Attending physician, Department of Emergency, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070125, 81270213, 81670306; the Scientific Plan Projects of Guangdong Province, No. 2014A020211002, 2010B031600032; Fundamental Research Funds for the Universities for Young Teachers Cultivation in Sun Yat-sen University, No. 13ykzd16; the Medical Science Research Fund of Guangdong Province, No. A2016264

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白内源性配体(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1 endogenous ligand, apelin)：血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1, APJ)是G蛋白耦联大家族中的一种跨膜蛋白，apelin作为APJ的内源性配体，与APJ构成apelin/APJ系统。apelin在不同组织的血管内皮细胞中均有表达，在血管平滑肌细胞和心肌细胞中也有一定的表达，在参与血管功能的维持和调控中具有重要作用。
血管内皮生长因子：也称血管通透性因子或促血管素，最初是由多种培养的肿瘤细胞系中发现的一种新型的生长因子，它能增加微血管与小静脉血管的通透性。后来发现，该因子特异性地作用于血管内皮细胞，并促进血管内皮细胞的增殖，所以定名为血管内皮生长因子。

摘要
背景：课题组前期研究发现骨髓间充质干细胞移植能够改善大鼠心肌梗死后心功能，但整体效果并不太理想，骨髓间充质干细胞在心肌梗死组织局部的生存力和新生血管密度低下。
目的：观察血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白内源性配体(apelin)对骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的生存和血管形成能力的影响并探讨相关机制。
方法：体外培养的骨髓间充质干细胞分为骨髓间充质干细胞组和骨髓间充质干细胞+apelin组，分别于正常条件(完全培养基，体积分数为20%O₂)和缺血缺氧条件(无血清，体积分数为1%O₂)下培养24 h，其中骨髓间充质干细胞+apelin组在培养同时加入apelin-13(5 μmol/L)刺激骨髓间充质干细胞。MTS法检测细胞增殖能力，TUNEL法检测细胞凋亡情况。取细胞培养液分别刺激人脐静脉内皮细胞，观察骨髓间充质干细胞血管形成能力。Western blot检测骨髓间充质干细胞中血管内皮生长因子的表达。 结果与结论：与骨髓间充质干细胞组相比较，骨髓间充质干细胞+apelin组正常条件和缺血缺氧条件下扩增能力显著增强，凋亡减少，血管管腔样结构明显增多，血管内皮生长因子的表达明显增高。以上结果提示apelin能够增强骨髓间充质干细胞在缺血缺氧环境下的生存和血管形成能力，此效应可能与其上调血管内皮生长因子的表达相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0492-2216(侯婧瑛)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白, 骨髓间充质干细胞, 缺血缺氧, 血管形成, 血管内皮生长因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Our previous work demonstrated that bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) transplantation could improve cardiac function in rats with myocardial infarction. However, the overall efficacy was not satisfactory. The implanted cells presented a low survival rate and newly formed vascular-like structures were sparse in the local infarct tissues.
OBJECTIVE: To observe the influence of putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1 endogenous ligand (apelin) on the survival and vascularization potential of BMSCs in hypoxic and ischemic conditions and to investigate relevant mechanisms.
METHODS: The bone marrow mesenchymal stem cells were obtained and cultured in vitro with or without apelin-13
(5 μmol/L) stimulation under hypoxic-ischemic condition (serum-free medium, 1% O₂) for 24 hours, or cultured under normoxia (complete culture medium, 20% O₂) as a negative control during the whole process. All the experimental groups were further co-cultured with human umbilical vein endothelial cells to promote vascular differentiation for another 6 hours. Cell proliferation, apoptosis, and vascular density were assessed and the expression of vascular endothelial growth factor was detected using western blot assay thereafter.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the BMSCs group, BMSCs+apelin group presented more rapid cell growth, higher proliferation rate, and lower apoptosis percentage under normoxic and hypoxic conditions. In the BMSCs+apelin group, a larger number of vascular branches formed on matrigel under normoxic and hypoxic-ischemic conditions; and the expression of vascular endothelial growth factor was significantly enhanced. These findings suggest that apelin could effectively promote BMSCs survival and vascularization under hypoxic-ischemic conditions in vitro. It might function via upregulating the expression of vascular endothelial growth factor.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Receptor, Angiotensin, Type 1, Ligands, Cell Proliferation, Apoptosis, Cardiovascular Physiological Processes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

侯婧瑛，汪蕾，钟婷婷，周长青，郭天柱，龙会宝，伍权华，郑韶欣，吴浩，王彤. apelin干预骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 6-12.

Hou Jing-ying, Wang Lei, Zhong Ting-ting, Zhou Chang-qing, Guo Tian-zhu, Long Hui-bao, Wu Quan-hua, Zheng Shao-xin, Wu Hao, Wang Tong. Influence of apelin on survival and vascularization potential of bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxic and ischemic conditions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 6-12.

图/表（结果） 2

2.1 apelin对骨髓间充质干细胞增殖的影响 MTS检测结果显示，骨髓间充质干细胞+apelin组在缺血缺氧后24，48，72 h的A₄₉₀值均高于骨髓间充质干细胞组(P < 0.01，图1A)，细胞增殖率明显高于骨髓间充质干细胞组(P < 0.01，图1B)，而抑制率则较骨髓间充质干细胞组明显降低(P < 0.01)，差异均有显著性意义(图1C)，表明apelin促进骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的增殖。

2.2 apelin对骨髓间充质干细胞凋亡的影响 TUNEL检测结果显示，骨髓间充质干细胞组和骨髓间充质干细胞+ apelin组正常情况下的凋亡比例分别为0.046±0.005和0.016±0.004，而缺血缺氧条件下的凋亡比例分别为0.090±0.010和0.029±0.003，与骨髓间充质干细胞组相比较，骨髓间充质干细胞+apelin组的凋亡率明显减少，差异有显著性意义(P < 0.01，图2)。

2.3 血管形成能力 人脐静脉内皮细胞分别与各组骨髓间充质干细胞培养液上清共培养后，在matrigel 中均形成血管腔样结构(图3A)。与骨髓间充质干细胞组相比较，在正常条件和缺血缺氧条件下，骨髓间充质干细胞+apelin组对人脐静脉内皮细胞形成血管腔样结构有更加明显的促进作用，其在正常条件和缺血缺氧条件下管腔样结构数量分别为(21.40±2.33)和(21.2±1.96) 个，骨髓间充质干细胞组分别为(13.90±1.76)和(13.60±1.68)个，前者较后者显著增多(P < 0.01，图3B)。2.4 各组骨髓间充质干细胞中血管内皮生长因子的表达骨髓间充质干细胞+apelin组血管内皮生长因子的表达在正常条件和缺血缺氧条件均显著高于骨髓间充质干细胞组，差异有显著性意义(P < 0.01，图4)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2016年1至6月在中山大学孙逸仙纪念医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级雄性C57BL/6小鼠10只，3周龄，体质量10 g，由中山大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤)2014-0011，用于骨髓间充质干细胞分离、培养、鉴定和血管形成实验。

1.3.2 主要试剂及仪器 原代人脐静脉内皮细胞(广州奕源生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM培养基、双抗、胰蛋白酶、PBS(Hyclone公司)；cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂盒、TUNEL试剂盒(美国Promega公司)；6孔细胞培养板、24孔细胞培养板、48孔细胞培养板(美国CORNING公司)；12孔细胞培养板、96孔细胞培养板(美国NEST公司)；BCA 法蛋白含量检测试剂盒(Abcam，美国)；PVDF膜、发光液(Millpore，美国)；VEGFA兔多克隆抗体(Abcam，美国)；一抗及二抗稀释液(Millipore，美国)；辣根过氧化物酶连接的二抗(Southern Biotech，美国)；apelin-13(Abcam，美国)；Matrigel(美国BD公司)。超净工作台、恒温CO₂培养箱、酶标仪(Thermo，美国)；台式常温高速离心机、微量移液器(Eppendorff，德国)；电热恒温水槽(上海深信实验仪器有限公司)；高温灭菌器(樱花牌NSS-20，日本)；缺氧培养箱(Eppendorf/ Galaxy^®48 R)(美国Eppendorf/Galaxy公司)；普通培养箱(HERACELL150i) (美国Thermo Scientific公司)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)；巴氏吸管(美国JET BIOFIL公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养 课题组已形成成熟的培养方法^[4-6]，即采用全骨髓法分离培养骨髓间充质干细胞。小鼠脱颈处死，收集双侧股骨全骨髓，用注射器反复冲打骨髓液，制成单细胞悬液。将单细胞悬液离心(1 500 r/min，10 min)，弃上清，加入DMEM完全培养基，吹打散细胞，计数细胞并以1×10¹⁰ L^-¹的细胞浓度接种于培养瓶，置37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养。利用差异贴壁培养法纯化细胞。于接种后48 h首次换培养液，以后每3 d更换培养液，以除去不贴壁的细胞，细胞长满至80%-90%进行传代：去除培养液，加骨髓间充质干细胞消化液(0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA)至刚好盖过瓶底，在倒置显微镜下观察细胞间隙增大，细胞变圆并开始脱落，加入等量完全培养基终止消化，轻轻吹打瓶底，将细胞吹打下来，转移至离心管，离心(1 500 r/min，10 min)，去上清，加入培养基，吹打散细胞，按1∶2传代，消化细胞时间为1-3 min，采用第3代细胞用于后续实验研究。

1.4.2 细胞分组和缺血缺氧培养 上述细胞分为骨髓间充质干细胞组和骨髓间充质干细胞+apelin组(apelin-13，5 μmol/L进行刺激)，分别于正常条件(完全培养基，体积分数为20% O₂)和缺血缺氧条件下培养24 h。缺血缺氧处理：缺血缺氧前1 d对细胞株进行传代，接种第3代细胞于25 cm²培养瓶培养至90%-95%铺满后，更换为无血清低糖培养基，置于体积分数为1%O₂、5%CO₂、94%N₂ Galaxy^® 48R培养箱中缺血缺氧培养24 h，然后收集细胞及培养上清以备后续实验用。

1.4.3 MTS检测细胞增殖 缺血缺氧培养24 h，消化细胞后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，接种到96孔板，每孔100 μL，即每孔细胞为1×10⁴个，待细胞贴壁后，收集各个时间点的细胞(0，24，48，72 h)加入cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂，比例为1/10，即100 μL培养液加入10 μL检测液。孵育4 h后，multiscan MK3酶标仪读板，MTS检测读取A₄₉₀值。

1.4.4 TUNEL法检测细胞凋亡 缺血缺氧培养24 h，取出爬片24 h后采用TUNEL法检测细胞凋亡情况。培养好的细胞用PBS洗去培养液，体积分数为4%甲醛溶液4 ℃固定25 min；PBS洗涤5 min，2次；0.2% Triton X-100室温孵育5 min；PBS洗涤5 min，2次；加100 μL Equilibration Buffer室温平衡10 min；加入50 μL TdT工作液37 ℃湿盒避光孵育60 min。在高倍镜下随机选择5个视野进行凋亡细胞计数，每个实验组计数至少重复3遍。

1.4.5 血管形成实验^[7] 缺血缺氧培养24 h后进行血管形成实验。48孔板中每孔加入200 μL Matrigel 37 ℃包被2 h。取2×10⁴人脐静脉内皮细胞重悬于200 μL条件培养基中(骨髓间充质干细胞培养上清液)，加入到已经包被的48孔板中，常氧条件下培养6 h，普通光镜下观察并拍照，分别在×100倍镜下随机选取5个管型分布均匀的视野，计数管腔数，取均值。

1.4.6 Western blot检测骨髓间充质干细胞中血管内皮生长因子表达 缺血缺氧培养24 h后检测血管内皮生长因子表达。按1 mL裂解液加10 μL PMSF(100 mmol/L)和10 μL Cocktail，摇匀置于冰上，每管骨髓间充质干细胞加100 μL含PMSF和Cocktail的裂解液，于冰上裂解30 min，裂解后4 ℃下14 000 r/min离心10 min，提取上清液中总蛋白。采用BCA法测定各样品蛋白浓度，常规SDS-PAGE电泳及蛋白电转，转膜后的PVDF膜，用5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h或4 ℃过夜；TBST洗膜5 min，3次；滴加相应的一抗稀释液4 ℃过夜或37 ℃孵育2 h；TBST洗膜5 min，3次；滴加相应二抗稀释液37 ℃孵育1 h；TBST洗膜5 min，3次；蒸馏水漂洗膜2 min，弃去液体，共洗3次；将总体积为0.125 mL/cm²膜面积的发光液均匀加到膜的表面，室温孵育5 min，小心吸去膜表面多余的发光液，放至暗盒后显影。

1.5 主要观察指标 各组骨髓间充质干细胞扩增、凋亡和血管形成情况以及血管内皮生长因子的表达。

1.6 统计学分析 所有数据均以x(_)±s来表示，采用SPSS 16.0 for windows软件处理，多组间比较采用单因素方差分析，两独立样本的资料采用Student’s 双尾t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、容易扩增、较强的自我复制能力和多向分化潜能、低免疫原性、易进行基因修饰、能分化为心肌细胞和血管内皮细胞等优势，且不存在伦理问题，已成为心血管疾病细胞移植治疗的理想种子细胞^[1^，^12-14]。尽管如此，骨髓间充质干细胞移植的效果仍难以令人满意，其中一个重要的因素就是细胞移植后的生存力低下，新生血管密度较低^[7^，^15-17]。骨髓间充质干细胞对缺血缺氧十分敏感，心肌梗死后局部组织缺血缺氧微环境导致移植的骨髓间充质干细胞生存困难并直接影响了其修复作用的发挥。因此，加强骨髓间充质干细胞对缺血缺氧的耐受性，促进骨髓间充质干细胞在心肌梗死后缺血缺氧微环境中的生存和血管再生，对于提高骨髓间充质干细胞移植治疗的效率具有重要意义。现阶段已有一些策略用于增强骨髓间充质干细胞的生存力和血管再生能力，但仍达不到理想水平^[18-21]，因此，迫切需要寻找到新的干预因素以进一步促进骨髓间充质干细胞在缺血缺氧状态下的生存和血管再生，从而显著改善其移植治疗心肌梗死后心力衰竭的疗效。

apelin是血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白的内源性配体^[22-23]，其在不同组织的血管内皮细胞中均有表达，在血管平滑肌细胞和心肌细胞中也有一定的表达，在参与血管功能维持和调控中具有重要作用^[24-25]。近年来研究发现apelin与骨髓间充质干细胞在缺血缺氧环境中的增殖、生存和凋亡密切相关。体外研究显示apelin促进骨髓间充质干细胞在缺氧条件下的扩增^[8^，^26]，其可经浓度依赖的方式减少骨髓间充质干细胞的凋亡；而体内实验同样表明apelin能够促进移植后的骨髓间充质干细胞在局部缺血组织微环境中的生存^[9^，^27]。作者采用apelin在缺血缺氧条件下刺激骨髓间充质干细胞并观察骨髓间充质干细胞的生存情况，结果亦显示骨髓间充质干细胞的增殖能力提高，凋亡减少，表明apelin能够显著提高骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的生存和对抗其发生凋亡。

除参与调节骨髓间充质干细胞增殖、生存和凋亡外，apelin亦被证实与血管再生密切相关^[28-29]。apelin是血管形成中一个重要调节因子，其对心肌梗死后血管形成具有促进作用^[30-31]。不仅如此，apelin 也能够促进干细胞进行血管再生，它通过诱导血管祖细胞向梗死区域归巢进而显著增强新生血管形成、减少心肌细胞凋亡和纤维化并改善心功能，且此作用与激活AKT和增强血管内皮生长因子的表达有关^[10]。另有报道在心肌梗死区域灌注apelin后能够通过招募循环血和心脏组织内APJ表达阳性的前体祖细胞在梗死区域聚集并上调血管内皮生长因子的表达促进边缘区新生血管的形成^[11]。以上充分说明了apelin在调节血管形成和促进干细胞血管再生中具有关键作用。作者在体外缺血缺氧条件下观察apelin对骨髓间充质干细胞血管再生能力的影响，结果显示在apelin刺激下骨髓间充质干细胞对人脐静脉内皮细胞形成血管腔样结构有更加明显地促进作用，表明apelin能够在缺血缺氧条件下显著提高骨髓间充质干细胞的血管形成能力。

因apelin能够促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成，故对其作用的具体机制进行了进一步的探索。研究表明血管内皮生长因子在促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生中扮演了十分重要的角色，他人的研究和作者的前期研究也均证实了促进血管内皮生长因子的表达能够显著提高骨髓间充质干细胞的生存力和血管形成能力^[32^-34]。证据表明apelin调节血管形成和促进干细胞血管再生与其上调血管内皮生长因子的表达密切相关^[10-11^，^35]，不仅如此，其还能够与血管内皮生长因子产生协同作用诱导骨髓间充质干细胞进行血管再生^[36]。最近有报道采用血管内皮生长因子包被的负载apelin的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒转染人骨髓间充质干细胞能够在体外促进其向血管内皮细胞分化和血管形成，并且这些细胞植入肢端缺血动物模型后能够在体内分化为血管内皮细胞和显著促进血管再生^[36]。鉴于此，作者检测了各组骨髓间充质干细胞的血管内皮生长因子的表达，结果显示在正常条件和缺血缺氧条件下，骨髓间充质干细胞+ apelin组血管内皮生长因子的蛋白表达水平均较骨髓间充质干细胞组明显增高，说明apelin增强骨髓间充质干细胞的生存和血管再生能力可能与其上调血管内皮生长因子的表达密切相关。

综上所述，apelin能够在体外缺血缺氧环境中促进骨髓间充质干细胞的生存和血管再生，并且此效应可能与其上调血管内皮生长因子的表达相关。此研究为阐明调控骨髓间充质干细胞生存和血管再生的相关分子机制提供了一个新的思路，同时也为进一步寻找提高骨髓间充质干细胞移植治疗疗效的新策略提供了一定的理论和实验依据。

apelin干预骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的生存和血管再生

Influence of apelin on survival and vascularization potential of bone marrow mesenchymal stem cells under hypoxic and ischemic conditions

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