miR-21慢病毒载体构建及对骨髓间充质干细胞凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.001

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
慢病毒载体：是指人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)来源的一种病毒载体，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
MOI：即感染复数，一般认为MOI是一个比值，没有单位，用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值。每种细胞对慢病毒的敏感性不一样，因此通常以不同浓度的病毒液感染靶细胞并观察转染效果，以确定细胞对该病毒载体的最适感染复数。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞移植后凋亡成为治疗化疗性卵巢早衰效果欠佳的主要原因。miR-21参与细胞增殖与凋亡的调控，有重要的抗凋亡作用。
目的：构建miR-21慢病毒载体并感染骨髓间充质干细胞，观察其对化疗药物磷酰胺氮芥诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的影响。
方法：构建携带miR-21基因慢病毒表达载体LVX-shRNA2-rno-miR-21-5p，双酶切及基因测序鉴定证实载体构建成功。对载体进行包装、测定病毒滴度。将慢病毒颗粒以不同感染复数(20和40)感染骨髓间充质干细胞，检测感染效率，使用real-time PCR法检测骨髓间充质干细胞中miR-21的表达。流式细胞仪、Hoechst33342染色检测骨髓间充质干细胞在磷酰胺氮芥模拟的化疗微环境中的凋亡率。
结果与结论：①成功构建miR-21慢病毒载体，病毒滴度约为6×10¹¹ CFU/L；②载体转染骨髓间充质干细胞效率达90%以上；③miR-21组1(感染复数为20)、miR-21组2(感染复数为40)miR-21表达量明显高于骨髓间充质干细胞组及空载组(P=0.000)；④转染组骨髓间充质干细胞的凋亡率、凋亡指数均低于空载组及骨髓间充质干细胞组(P=0.001)；⑤实验成功构建大鼠miR-21慢病毒载体系统，miR-21上调能抑制骨髓间充质干细胞凋亡，促进细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0344-7620(付霞霏)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 载体构建, miR-21, 慢病毒, 骨髓间充质干细胞, 基因转染, MicroRNAs, 细胞凋亡, 化疗性卵巢早衰, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Apoptosis in bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) occurs after transplantation, which is mainly responsible for unsatisfactory therapeutic effects on premature ovarian failure
induced by chemotherapy. miR-21 participates in the regulation of cell proliferation and apoptosis, and has important anti-apoptotic effect.
OBJECTIVE: To construct a lentiviral vector for rat miR-21 and observe its effects on apoptosis of BMSCs induced by phosphoramide nitrogen mustard.
METHODS: Rat miR-21 gene was synthesized, amplified, and connected with the lentiviral plasmid pLVX-shRNA2. Both double enzyme digestion and gene sequencing were done to identify the successful construction of the vector pLVX-shRNA2-rno-miR-21-5p. The vector was packaged, and the titer was examined. BMSCs were transfected by the vector with different multiplicities of infection (MOI=20 or 40), and the efficiency was observed. miR-21 expression in the transfected cells was detected using real-time PCR. Phosphoramide nitrogen mustard was added into the cell culture media of BMSCs, then the apoptotic rate of BMSCs was detected by flow cytometry, and apoptotic index was examined by Hoechst33342 staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The target gene was successfully connected with the lentiviral vector. The viral titer was 6×10¹¹ CFU/L. The vector transfected BMSCs had a high efficiency above 90%. Real-time PCR results showed the expression levels of miR-21 in miR-21 group 1 (MOI=20) and miR-21 group2 (MOI=40) were higher than that in BMSCs group and blank vector group (P=0.000). Flow cytometry and Hoechst33342 staining results showed the apoptotic rate and apoptotic index of miR-21 transfected groups were lower than those of blank vector group and BMSCs group (P=0.001). Overall, we successfully established rat miR-21 lentivirus vector pLVX-shRNA2-rno-miR-21-5p and transfected it into the BMSCs. Upregulation of miR-21 could reduce BMSCs apoptosis, and enhance cell proliferation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Ovarian Diseases, MicroRNAs, Transfection, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

付霞霏，何援利，王雪峰，陈小莹. miR-21慢病毒载体构建及对骨髓间充质干细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 1-5.

Fu Xia-fei, He Yuan-li, Wang Xue-feng, Chen Xiao-ying. Establishment of a lentiviral vector carrying rat miR-21 gene and its effect on apoptosis of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 1-5.

图/表（结果） 1

2.1 rno-miR-21-5p的扩增和序列测定 设计引物按照既定程序进行PCR扩增，所得到的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增反应产物。电泳结果显示，PCR成功特异性扩增出miR-21，得到大小为117 bp的特异性片段(图1)，没有非特异性杂带，且表达量较高，光信号较强，无拖尾及弥散。

2.2 慢病毒载体pLVX-shRNA2-rno-miR-21-5p的构建与鉴定 经EcoRⅠ及BamHⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小分别为7 888 bp和117 bp的片段(图2)。阳性克隆的测序结果显示重组质粒中插入的rno-miR-21-5p序列与目标序列完全一致。因此，可以证明成功构建了miR-21慢病毒载体系统。

2.3 慢病毒载体pLVX-shRNA2-rno-miR-21-5p包装与滴度测定结果 将构建的慢病毒载体pLVX-shRNA2-rno- miR-21-5p及包装质粒载体，以磷酸钙共沉淀法转染包装细胞(293FT)，收集培养上清液中的慢病毒液，采用抗性克隆法测得病毒滴度为6×10¹¹ CFU/L。

2.4 慢病毒载体pLVX-shRNA2-rno-miR-21-5p转染骨髓间充质干细胞 携带miR-21基因的慢病毒液以MOI为20和40感染骨髓间充质干细胞，荧光显微镜下均可见到绿色荧光蛋白的表达(图3)，转染效率分别为(93.13±1.93)%、(94.57±1.75)%，两组相比差异无显著性意义(t=-1.236，P=0.251)。

2.5 骨髓间充质干细胞转染载体后miR-21的表达 实时定量PCR结果显示：骨髓间充质干细胞组、空载组、miR-21组1(MOI为20)、miR-21组2(MOI为40)miR-21的表达量分别为1.07±0.05，1.12±0.05，4.05±0.07，4.06±0.04，经单向方差分析，4组间差异有显著性意义(F=3 014.962，P=0.000)。采用SNK法进行两组间比较，骨髓间充质干细胞组与空载组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，miR-21组1与miR-21组2的表达量高于骨髓间充质干细胞组及空载组(P < 0.05)，但miR-21组1与miR-21组2相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

2.6 骨髓间充质干细胞的凋亡 流式细胞仪结果显示，骨髓间充质干细胞组、空载组、转染组的凋亡率分别为(33.33±3.42)%，(31.74±2.93)%，(29.78±3.06)%。经单向方差分析，3组间差异有显著性意义(F=11.777，P=0.001)。采用SNK法进行两组间比较，骨髓间充质干细胞组与空载组相比，差异无显著性意义，转染组的凋亡率低于骨髓间充质干细胞组及空载组，见图5。

Hoechst33342染色结果显示：骨髓间充质干细胞组、空载组、转染组的凋亡指数分别为：(34.36±4.24)%，(35.73± 3.6)%，(24.48±3.17)%，经单向方差分析，3组间差异有显著性意义(F=13.144，P=0.001)。采用SNK法进行两组间比较，骨髓间充质干细胞组与空载组相比，差异无显著性意义，转染组的凋亡指数低于骨髓间充质干细胞组及空载组，与流式细胞仪凋亡结果一致。表明在加入化疗药物诱导模拟卵巢局部微环境，骨髓间充质干细胞转染miR-21慢病毒载体后，其凋亡受到抑制，从而促进细胞的增殖，提高细胞的存活率，有利于骨髓间充质干细胞功能的持续发挥与作用。

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引言

间充质干细胞是近年来引人注目的一种成体干细胞，其有自我更新、诱导分化、来源广泛、自体移植避免免疫排斥等特点^[1]，在多种损伤性疾病的治疗上有着广阔的前景^[2-3]。作者前期研究证实了间充质干细胞在体内外能抑制化疗药物诱导的卵巢颗粒细胞凋亡，修复化疗所致卵巢损伤，部分改善卵巢内分泌功能，但距离正常的卵巢功能还有一定差距^[4]。移植后间充质干细胞的迅速凋亡流失是导致治疗效果不佳的主要因素^[5]。MicroRNAs(miRNAs)是存在于真核生物中的由18-25个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA，其功能是参与基因转录后水平的调控，通过与靶mRNA的碱基配对，导致靶mRNA的降解或翻译抑制，从而进行基因表达的调控^[6-7]。研究证实miRNAs参与细胞增殖与凋亡、器官发育、分化等重要生物学事件，发挥着巨大的调控作用^[8-9]，其中miR-21发现较早，存在相对广泛，全长22个核苷酸，位于17号染色体的TMEM49基因编码区域内^[10]。miR-21的靶基因包括PTEN、TPM1、PDCD4、TIMP3等，具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用^[11-12]。慢病毒载体作为应用最广泛的转基因载体之一，具有下列优点：①可实现目的基因高效转染靶细胞并能长期稳定表达；②慢病毒包装工艺相对简单；③慢病毒载体经改构后，不在宿主细胞繁殖，不易诱发免疫反应，不会导致宿主细胞死亡，被它感染的细胞能连续传代，生物安全性高^[13]。大量研究证实以慢病毒为基因转染载体，将外源基因导入骨髓间充质干细胞中是一种可靠有效的方法^[14-15]。如能利用miR-21的抗凋亡作用提高移植间充质干细胞的存活率将显著提高疗效。因此，实验构建miR-21的慢病毒表达载体系统，并感染间充质干细胞，获得稳定转染的间充质干细胞系，加入化疗药物模拟体内卵巢微环境，检测间充质干细胞的凋亡情况，为进一步研究miR-21的生物学特性奠定实验基础。

材料方法

1.1 设计 细胞对照观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年9月至2014年3月在南方医科大学珠江医院中心实验室完成。

1.3 材料 慢病毒表达载体pLVX-shRNA2(Clontech公司)；Lip2000脂质体转染试剂盒(Invitrogen公司)；限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ(NEB公司)；质粒提取试剂盒(Omega公司)；miR-21定量qPCR检测试剂盒(百奥迈科生物技术有限公司)；293FT细胞、Wistar大鼠骨髓间充质干细胞及其完全培养基(广州赛业生物科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 引物的设计与合成 根据大鼠miR-21序列(rno-miR-21-5p，MIMAT0000790，UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A)，结合pLVX-shRNA2质粒载体特点，并引入酶切位点，进行设计引物。序列如下：rno-mir-21-F：5’-CGG GAT CCA GCC ACT ACC AAG GCA TGT T-3’；rno-mir-21-R：5'-CGG AAT TCA ACC ACG ACT AGA GGC TGA C-3’。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4.2 PCR扩增 以含有rno-miR-21-5p序列的DNA为模板进行PCR反应。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性20 s，67 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃延长3 min，4 ℃保存。将扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化，并回收得到目的片段。

1.4.3 慢病毒表达载体pLVX-shRNA2-rno-miR-21-5p的构建与鉴定 纯化后的PCR扩增产物经BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切后，再次纯化得到rno-miR-21-5p片段。pLVX-shRNA2空载体用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切后，回收线性化空载体。将线性化载体与纯化的PCR产物在T₄DNA连接酶作用下置于16 ℃条件下连接过夜，转化E.coliDH5α感受态细胞，均匀涂在含氨苄青霉素的LB平板上，置于37 ℃条件下培养过夜。挑取少许菌落溶于LB培养液中，取1 μL为模板，进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性20 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次，最后72 ℃延伸6 min。得到的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳法进行初步鉴定；培养阳性克隆，提取质粒，送上海英骏生物技术有限公司进行测序。

1.4.4 miR-21慢病毒载体的包装与滴度测定 转染前消化293FT细胞，重悬后接种，细胞长满70%-80%时进行转染。转染时，制备质粒混合物，加入待转染293FT细胞中，轻轻摇动混匀，37 ℃孵育5 h后弃掉培养基，PBS洗涤3次，再加入新鲜培养基，置37 ℃继续孵育至48 h。收集病毒液，过滤后分装置于-80 ℃保存。取其中1管进行滴度测定。测定前1 d，将NIH3T3细胞传代置于6孔板中，细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，每孔2 mL。待细胞生长到大部分融合时，选2孔，分别更换为1 mL含有10 μL和100 μL病毒上清的完全培养基，培养箱中温育4 h，再加入不含病毒液的完全培养液3 mL继续培养48 h，将细胞按1︰4传代。加入嘌呤霉素(puromycin，1.5 mg/L)进行筛选14 d，结晶紫染色后计数克隆数。病毒滴度(CFU/mL)=克隆数/病毒原液体积(mL)×稀释度。

1.4.5 慢病毒载体pLVX-shRNA2-rno-miR-21-5p感染骨髓间充质干细胞及miR-21表达的检测 将携带miR-21基因的慢病毒液以不同MOI(分别为20和40)加入至骨髓间充质干细胞培养液中，感染24-48 h后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，计算感染效率，比较两组感染效率的差异。

miR-21检测实验分4组：骨髓间充质干细胞组(不转染病毒液)、空载组(转染空载病毒液)、miR-21组1(miR-21慢病毒载体以MOI=20转染骨髓间充质干细胞)、miR-21组2(miR-21慢病毒载体以MOI=40转染骨髓间充质干细胞)。采用实时荧光定量RT-PCR方法检测各组骨髓间充质干细胞中miR-21的表达量。实验步骤严格按试剂盒说明书进行，按RNA提取试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA。取2 ng细胞总RNA作为起始模板进行反转录反应，反应体系为10 μL，每个指标重复3个复孔。按说明书设置反应条件，分析最终数据。

1.4.6 骨髓间充质干细胞凋亡的检测 实验分3组进行：骨髓间充质干细胞组(不转染病毒液)、空载组(转染空载病毒液)、转染组(miR-21慢病毒载体以MOI=20转染骨髓间充质干细胞)。转染24 h后，更换完全培养基进行培养，并在培养基中加入浓度为30 μmol/L的磷酰胺氮芥(PM)，作用24 h后，收集骨髓间充质干细胞，采用流式细胞仪Annexin-V法检测凋亡率。Hoechst33342染色检测凋亡指数：骨髓间充质干细胞于37 ℃中与Hoechst 33342(5 mg/L)孵育15 min，离心，PBS漂洗2次，荧光显微镜观察。每个样本随机选取300个细胞进行统计，每组重复5个样本，取平均值。凋亡细胞表现为有蓝染细胞核，染色质凝聚呈多个亮点，凋亡指数=凋亡细胞数目/细胞总数。

1.5 主要观察指标 ①miR-21慢病毒载体滴度；②慢病毒转染骨髓间充质干细胞的效率；③RT-PCR检测转染后间充质干细胞内miR-21的表达；④转染后间充质干细胞的凋亡情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料用x(_)±s表示，两组间比较用t 检验，多组间比较采用单向方差(One-way ANOVA)分析法，使用多重比较SNK法比较组间差异。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

miR-21是一类重要的miRNA分子，存在广泛，具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用^[16]。miR-21在多种肿瘤如胶质瘤、乳腺癌、结肠癌、肝癌等组织中高表达^[11^，^17]。由于miRNA与靶mRNA的不完全互补性，使得一个miRNA可以调控成百上千个靶基因的表达，构成一个相互联系、相互影响的复杂调控网络。因此，以miRNA为靶点的治疗效率远高于针对单一靶基因，而另一方面使得靶基因的验证变得异常困难。纽约大学比较功能基因组中心预测可能受miR-21调控的靶标约190个之多^[18]。目前研究得较多的是PDCD4、PTEN、TPM1，它们在细胞凋亡与增殖中发挥重要作用^[16^，^19]。

病毒载体的选择有多种，包括慢病毒载体、腺病毒载体、反转录病毒等。慢病毒载体的最大特点在于可以同时感染分裂期和非分裂期的细胞，感染细胞谱广，感染效率高，能在体内长期、稳定、高效表达，且安全性良好，应用范围较其他病毒载体更广泛，在基因治疗中有着广阔的应用前景^[20]，因此实验选择慢病毒载体系统。

实验成功构建了miR-21慢病毒载体系统pLVX- shRNA2-rno-miR-21-5p，并感染骨髓间充质干细胞，获得稳定转染miR-21的细胞系(miR-21-MSCs)。首先，以rno- miR-21-5p序列为模板，设计合成引物，采用PCR法扩增目的基因后，连接到慢病毒表达质粒pLVX-shRNA2中，对重组质粒进行双酶切鉴定及测序，证实成功构建了rno-miR- 21-5p慢病毒表达载体，命名为pLVX-shRNA2- rno-miR- 21-5p。获得的载体滴度高，成功感染骨髓间充质干细胞，转染效率达90%以上。经real time PCR检测，转染骨髓间充质干细胞后，miR-21的表达量增加，差异有显著性意义。

作者前期研究证实了骨髓间充质干细胞在体内外能抑制化疗药物诱导的卵巢颗粒细胞凋亡，修复化疗所致卵巢损伤，部分改善卵巢内分泌功能，但不能达到完全修复的效果，其主要因素是移植后的骨髓间充质干细胞迅速大量凋亡^[4]。因此实施预处理提高移植细胞的存活率是提高疗效的关键所在。在实验中，转染miR-21慢病毒载体预处理，在培养基中加入环磷酰胺的活性代谢产物磷酰胺氮芥(PM)模拟化疗性卵巢早衰的局部微环境，检测转染后骨髓间充质干细胞凋亡情况，结果发现骨髓间充质干细胞凋亡率显著下降，表明miR-21表达上调能抑制骨髓间充质干细胞的凋亡，增强其存活能力。miR-21抑制骨髓间充质干细胞凋亡与其调控的靶基因密切相关^[21]。研究表明，PTEN的脂质磷酸酶活性使细胞周期停滞，同时可影响PI3K活性、控制Akt磷酸化，激活其下游信号，影响细胞黏附、分化及转移，从而抑制细胞凋亡，促进细胞增生^[22]。miR-21可能通过调控PTEN等靶基因抑制骨髓间充质干细胞凋亡，但其具体机制有待进一步研究。