大鼠骨髓胚胎样干细胞生物学特性和分化潜能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.01.008

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
胚胎干细胞：自1981年Evans和Kaufman首次成功分离小鼠胚胎干细胞，中国外研究人员已在仓鼠、大鼠、兔、猪、牛、绵羊、山羊、水貂、恒河猴、美洲长尾猴以及人类都分离获得了胚胎干细胞，而且已经证明小鼠胚胎干细胞可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、黑色素细胞、神经细胞、神经胶质细胞、少突胶质细胞、淋巴细胞、胰岛细胞、滋养层细胞等。人类胚胎干细胞也可以分化为滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。胚胎干细胞不仅可以作为体外研究细胞分化和发育调控机制的模型，而且还可以作为一种载体，将通过同源重组产生的基因组的定点突变导入个体。
心脑血管疾病：心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。

摘要
背景：大鼠骨髓胚胎样干细胞能表达胚胎干细胞标志物，能够分化形成三胚层来源细胞，并且植入机体后能改善心功能、组织心室重构，但是对于骨髓胚胎样干细胞的生物学特性及分化潜能尚不完全知晓。
目的：分析大鼠骨髓胚胎样干细胞生物特性和分化潜能。
方法： 20只SD大鼠，采用阶段特异性胚胎抗原1(SSAE-1)标记骨髓单核细胞，利用流式细胞仪分选骨髓胚胎样干细胞。采用电镜扫描观察骨髓胚胎样干细胞形态、结构；免疫荧光化学染色测定胚胎干细胞转录因子(Oct4、Nanog、Sox2)在骨髓胚胎样干细胞中的表达，将骨髓胚胎样干细胞放入纤维细胞饲养层进行扩增，诱导心肌和内皮细胞，测定其特异蛋白表达。
结果与结论：①采用SSEA-1标记大鼠骨髓胚胎样干细胞，对直径为2-6 μm细胞设门，大鼠骨髓胚胎样干细胞呈现纺锤形，多边形以及圆形多细胞形态；体积较小；②透射电镜下可见细胞核增大，细胞质较少，含有少量的细胞器。③第2代大鼠骨髓胚胎样干细胞免疫细胞化学染色下能测定到多潜能抗原标志；随传代次数增加，细胞增殖能力出现下降趋势；④大鼠骨髓胚胎样干细胞分化1周后心肌细胞平行排列，诱导2周后细胞形态发生明显的变化，细胞相互连接。免疫荧光化学染色可见心肌特异蛋白cTnT以及Cx43表达；大鼠骨髓胚胎干细胞分化1周后内皮细胞呈现多角形、梭形。诱导2周后细胞相互连接，免疫细胞化学染色可见内皮细胞特异蛋白VWF以及CD31表达。⑤结果提示：大鼠骨髓胚胎样干细胞具备与骨髓间充质干细胞类似的生物学特性，能表达干细胞转录因子，能够在一定的条件下分化为心肌细胞和内皮细胞，具有较高的临床应用价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3584-1112(王政)

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 大鼠骨髓胚胎样干细胞, 生物特性, 分化潜能, 特异性胚胎抗原1, 单形核细胞, 流式细胞仪, 免疫细胞, 内皮细胞, 心肌细胞

Abstract:

BACKGROUND: Rat bone marrow embryonic-like stem cells are found to express embryonic stem cell markers, differentiate into cells derived from three germ layers, and improve cardiac function and remodel the ventricle after implantation. However, the cell biological characteristics and differentiation potential are still unclear.
OBJECTIVE: To study the biological properties and differentiation potential of embryonic-like stem cells from rat bone marrow.
METHODS: Bone marrow mononuclear cells from 20 Sprague-Dawley were labeled with stage-specific embryonic antigen 1 (SSAE-1), and bone marrow embryonic stem cells were sorted by flow cytometry. Morphology and structure of the sorted cells were observed under scanning electron microscope. Expression of transcription factor (Oct4, Nanog, Sox2) in bone marrow embryonic-like stem cells was detected by immunofluorescence staining. Bone marrow embryonic-like stem cells were cultured and amplified in the feeder layer of fibroblasts to induce myocardium and endothelial cells, and their specific proteins expression was determined.
RESULTS AND CONCLUSION: SSEA-1 labeled rat bone marrow embryonic-like stem cells were gated based on a diameter of 2-6 μm, and these cells were fusiform, polygonal or circular, with a small size. Under the transmission electron microscope, the cell nucleus was enlarged with less cytoplasm containing a small amount of organelles. Multipotential antigen markers could be detected under the immunocytochemical staining of passage 2 rat bone marrow embryonic-like stem cells. With the increase of the number of passages, the cell proliferation ability exhibited a descending trend. One week after myocardial differentiation of rat bone marrow embryonic-like stem cells, myocardial cells were in the parallel arrangement. Two weeks after myocardial induction, the cell morphology changed significantly, and interconnected cells were observed. Immunofluorescence staining showed that cTnT and Cx43 protein were expressed in the myocardium. One week after endothelial differentiation, the endothelial cells were polygonal and spindle-shaped. Two weeks after endothelial differentiation, immunocytochemical staining showed that VWF and CD31 were expressed in the interconnected endothelial cells. To conclude, these findings indicate that rat bone marrow embryonic-like stem cells have similar biological characteristics as bone marrow mesenchymal stem cells and can express stem cell transcription factors. These cells are a likely to differentiate into myocardial and endothelial cells under certain conditions and have a high clinical value.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Cardiovascular Diseases, Heart Diseases, Embryonic Stem Cells

中图分类号:

R394.2

王政，林凯. 大鼠骨髓胚胎样干细胞生物学特性和分化潜能[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(1): 43-48.

Wang Zheng, Lin Kai. Biological characteristics and differentiation potential of bone marrow embryonic-like stem cells in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(1): 43-48.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 实验选用SD大鼠20只，中途无脱落，全部进行结果分析。

2.2 大鼠骨髓胚胎样干细胞分离、鉴定 采用SSEA-1标记大鼠骨髓胚胎样干细胞，对直径为2-6 μm细胞设门，倒置显微镜下大鼠骨髓胚胎样干细胞体积较小，形态相对均以。同时，大鼠骨髓胚胎样干细胞呈现纺锤形，多边形以及圆形多细胞形态，见图1。

2.3 大鼠骨髓胚胎样干细胞扩增结果 大鼠骨髓胚胎样干细胞体积较小，直径为4.0-5.0 μm，透射电镜下可见细胞核开始增大，细胞质较少，含有少量的细胞器。在无饲养层的培养条件下大鼠骨髓胚胎样干细胞增殖不明显。将大鼠骨髓胚胎样干细胞接种在纤维细胞饲养层上1 d细胞开始黏附分布。培养7 d，细胞增殖形成细胞簇，细胞较小，见图2。

在扫描电镜下，大鼠骨髓胚胎样干细胞表面含有较多的微绒毛，并且大鼠骨髓胚胎样干细胞开始向外扩展，见图3。

2.4 免疫荧光染色结果 采用无血清培养基扩增的第2代大鼠骨髓胚胎样干细胞，结果显示：免疫荧光染色下能测定到多潜能抗原标志，如：Oct-4、Nanog-3和Sox-2，但是表达相对微弱，见图4。

2.5 大鼠骨髓胚胎样干细胞生长曲线 经过酶标仪测定A值并进行比较，结果显示：大鼠骨髓胚胎样干细胞在传代生长过程中随着传代次数的不断增加，细胞增殖能力出现下降趋势，且每次传代经历两三天，经过2-5 d后经历对数增殖期而进入平台期，见表1。

从图5看出：大鼠骨髓胚胎样干细胞不同传代数的增加，细胞总体呈现上升趋势，但是随着传代次数增加，细胞生长能力变低。

2.6 大鼠骨髓胚胎样干细胞分化潜力实验 大鼠骨髓胚胎干细胞分化1周后心肌细胞平行排列，诱导2周后细胞形态发生明显的变化，细胞相互连接。免疫细胞化学染色可见心肌特异蛋白cTnT以及Cx43表达，见图6。

大鼠骨髓胚胎样干细胞分化1周后内皮细胞呈现多角形、梭形。诱导2周后细胞相互连接，免疫细胞化学染色可见内皮细胞特异蛋白VWF以及CD31表达，见图7。

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引言

目前，临床上对于心肌梗死等心血管疾病治疗方法相对较多，如：药物治疗、介入治疗、手术治疗以及心脏移植等^[1]。药物治疗、介入治疗以及冠脉搭桥虽然能降低临床死亡率，但是无法修复缺损的心肌细胞。同时，心脏移植由于受到供体心脏来源限制以及移植后免疫排斥反应发生率较高而受到限制^[2-3]。因此，临床上寻找积极有效的治疗方法具有重要的意义。干细胞是一类特殊的细胞，该细胞具备自我更新能力，能在一定的条件下分化为其他细胞潜力^[4-5]。相关研究显示：干细胞能在特定的条件下分化为心肌细胞^[6-7]，并且早期的动物实验和初期实验结果证实干细胞能修复缺损的心肌细胞，从而能改善机体心功能。但是，采用干细胞治疗心肌梗死等疾病时尚存在许多问题，如：移植细胞数量、移植时间以及细胞的生物学特性等^[8-9]。

胚胎干细胞属于干细胞的一种，具有全能分化潜能，是干细胞比较丰富的来源之一^[10-11]。同时，胚胎干细胞在一定的条件下能够分化形成具备心肌结构、功能的心肌细胞和内皮细胞，并且移植胚胎干细胞能有效的改善机体心功能^[12-13]。但是，胚胎干细胞临床应用时受到供卵数量限制、免疫排斥等因素的影响，难以在医院推广应用^[14]。相关学者研究显示：通过单细胞克隆培养以及干细胞表面标志物测定，能从骨髓间充质干细胞中筛选出骨髓源性心肌干细胞^[15-16]，并且经过5-氮杂胞苷诱导后具备心肌细胞分化潜能。大鼠骨髓胚胎样干细胞能表达胚胎干细胞标志物，能够分化形成三胚层来源细胞，并且植入机体后能改善心功能、组织心室重构，但是对于骨髓胚胎样干细胞的生物学特性及分化潜能尚不完全知晓^[17-18]。

此次实验分析大鼠骨髓胚胎样干细胞的生物特性和分化潜能。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2015年1月至2016年1月吉林大学基础医学院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：SD大鼠20只，清洁级，体质量为35-66 g，平均(48.5±3.5) g，周龄3-6周，雌雄随机，实验动物均由吉林大学基础医学院动物试验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为SCXK(吉)2007-0010。对大鼠进行等条件喂养，对大鼠的处理符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[19]。

主要仪器和试剂：Nikon相差倒置显微镜(Nikon，Japan)；FACSAria流式细胞仪(BeetonDickinson，USA)；Olympus荧光显微镜(OlymPus，Japan)；DMEM (Gibeo，USA)；丝裂霉素C(海正药业有限公司，浙江)；碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen，USA)；血管内皮生长因子(R&DSystems，USA)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓胚胎样干细胞分离、鉴定 取成年SD大鼠，手术前肌肉注射0.5 g阿托品，采用浓度为3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾，麻醉后SD大鼠固定在洁净工作台上，切开皮肤等软组织，取下胫骨和股骨，并放入HBSS液玻璃皿中。剔除HBSS液中的肌肉、软组织等，采用PBS冲洗3次，收集骨髓冲洗液，将其放置在相对密度为1.073的Percoll分离液中，离心25 min，速度为1 000 r/min。将获得的骨髓单形核细胞中加入浓度为1%的BSA的PBS混悬细胞，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹，小鼠抗大鼠SSEA-1，4 ℃孵育50 min，PBS冲洗后加入FITC标记的羊抗小鼠IgG，采用流式细胞仪分选SSEA-1⁺细胞^[20-21]。

1.4.2 大鼠骨髓胚胎样干细胞扩增 采用流式细胞仪分选的细胞中加入含体积分数为15%FBS的DMEM混悬后，将其放置在体积分数5%CO₂温箱中培养，每天换液以1次，加入1 000 U/mL白血病抑制因子以及20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，测定细胞生长曲线^[22-23]。

1.4.3 扫描电镜观察大鼠骨髓胚胎样干细胞 将含有丝裂霉素C处理的胚胎成纤维细胞接种在培养皿中，将上述获得的大鼠骨髓胚胎干细胞接种在饲养层上，培养7 d，取出培养液，采用PBS清洗细胞。

采用体积分数100%的乙醇和醋酸正戊酯混合液(2∶1)进行置换，再采用乙醇和醋酸正戊酯混合液(1∶2)置换。将获得的细胞玻璃片放入干燥仪中进行2 h干燥，将干燥后玻璃片在Nikon相差倒置显微镜下观察其表面形态及与饲养层的关系。

1.4.4 免疫荧光染色 将文中获得干燥的盖玻片涂抹多聚赖氨酸，从培养瓶中采集细胞，调整细胞浓度，接种在盖玻片上，干燥。采用PBS进行3次冲洗，并加入体积分数10%山羊血清，封闭30 min。分别加入兔抗大鼠Oct-4，兔抗大鼠Nanog-3，兔抗大鼠Sox-2，并加入小鼠抗大鼠SSEA-1抗体，进行2 h孵育采用PBS进行3次冲洗，检测胚胎干细胞标志物(Oct-4、Nanog-3、Sox-2)表达，采用荧光显微镜观察^[24-25]。

1.4.5 大鼠骨髓胚胎样干细胞分化潜力试验 ①向心肌细胞诱导分化。将获得的大鼠骨髓胚胎样干细胞加入体积分数5%FBS%、10 μg/L BMP-2、10 μg/L胰岛素样生长因子1以及10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM混悬液中，每24 h添加1次，每两三天换液1次，连续培养4周；②向内皮细胞诱导分化：将获得的大鼠骨髓胚胎样干细胞加入5%FBS%、10 μg/L血管内皮生长因子、10 μg/L转化生长因子转化生长因子β以及10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM混悬液中，每24 h添加1次，每两三天换液1次，连续培养4周。将2种分化的细胞采用免疫细胞化学方法进行染色，在荧光显微镜下进行观察^[26]。

1.5 主要观察指标 ①大鼠骨髓胚胎样干细胞的分离、鉴定；②大鼠骨髓胚胎样干细胞的扩增结果；③大鼠骨髓胚胎样干细胞免疫细胞化学染色结果；④大鼠骨髓胚胎样干细胞的生长曲线；⑤大鼠骨髓胚胎样干细胞分化潜力实验结果。

1.6 统计学分析 数据采用SPSS 18.0进行统计学处理，计数资料行χ²检验，采用n，%表示；计量资料行t检验，采用x(_)±s表示，P < 0.05差异有显著性意义。

讨论

相关学者采用胚胎干细胞扩增培养方法从骨髓中成分分离到表达多潜能干细胞标志的细胞，并且证明该细胞能够在特定的条件下向脂肪、骨、胰岛细胞分化^[27]。而SSEA属于是骨髓胚胎样干细胞的全能性的表面标志物，且类型较多，如：SSEA-1、SSEA-3以及SSEA-4等，不同的表面标志物作用也不尽相同，而对于哺乳类动物而言，主要以SSEA-1表达为主。

研究中，采用SSEA-1标记大鼠骨髓胚胎样干细胞，对直径为2-6 μm细胞设门，倒置显微镜下大鼠骨髓胚胎样干细胞体积较小，形态相对均以。同时，大鼠骨髓胚胎样干细胞呈现纺锤形，多边形以及圆形多细胞形态。由此看出：这些开放的常染色质结构是骨髓胚样干细胞进行自我更新已经多能性的结构基础^[28-29]。

研究中，采用无血清培养基扩增的第2代大鼠骨髓胚胎样干细胞，结果显示：免疫细胞化学染色下能测定到多潜能抗原标志，如：Oct-4、Nanog-3和Sox-2，但是表达相对微弱。在常规培养下，大鼠骨髓胚胎样干细胞增殖并不明显，但是在饲养层上，细胞能够定向增殖，由此看出：大鼠骨髓胚胎样干细胞具备良好的生物学特性以及较强的增殖特性。因此，临床上有望将大鼠骨髓胚胎样干细胞作为理想的种子细胞来源^[30]。

对于骨髓胚胎样干细胞的来源，相关学者研究显示：骨髓胚胎样干细胞的转录因子表达在胚胎发育过程中的原始增殖细胞或上胚层^[31]。研究显示：大鼠骨髓胚胎样干细胞可能源于上胚层，并且能够在胚胎的发育过程中由外胚层进行迁移。大鼠骨髓胚胎样干细胞属于是一类特殊的干细胞，而分化是干细胞比较重要的特性。采用碱性成纤维细胞生长因子，血管内皮生长因子和转化生长因子p诱导vSEL细胞向心肌细胞分化以及内皮细胞进行分析，利用免疫荧光组化方法测定其特定蛋白。

研究中，大鼠骨髓胚胎干细胞分化1周后心肌细胞平行排列，诱导2周后细胞形态发生明显的变化，细胞相互连接。免疫细胞化学染色可见心肌特异蛋白cTnT以及Cx43表达。由此看出：cTnT以及Cx43均能作为鉴定心肌分化的指标之一。大鼠骨髓胚胎干细胞分化后能够表达cTnT以及Cx43，即：细胞已经形成心肌细胞。由此看出：大鼠骨髓胚胎干细胞具备较强的心肌细胞分化潜能。采用血管内皮生长因子、转化生长因子β以及碱性成纤维细胞生长因子能诱导分化内皮细胞，并且植入机体后能改善心肌局部微循环，促进缺损细胞完成自我修复，对于重建血液循环等具有重要的意义^[32]。

本研究中，大鼠骨髓胚胎干细胞分化1周后内皮细胞呈现多角形、梭形。诱导2周后细胞相互连接，免疫细胞化学染色可见内皮细胞特异蛋白VWF以及CD31表达。

综上所述，大鼠骨髓胚胎干细胞具备与干细胞类似的生物学特性，能表达骨髓间充质干细胞转录因子，具备很高的增殖能力，能够形成拟胚体样小体而形成三胚层来源细胞，能够在一定的条件下分化为心肌细胞和内皮细胞，具有较高的临床应用价值。