丙泊酚干预脊髓损伤模型脊髓水肿及后肢电生理的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.05.006

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

丙泊酚：丙泊酚是一种快速、短效静脉麻醉药，它具有麻醉起效快、苏醒迅速且功能恢复完善、不良反应低等优点，研究证实丙泊酚在产生广泛中枢抑制作用的同时，还具有降低脑耗氧量、降低颅内压和抗惊厥、抗炎症、抗氧化和支气管舒张特性。

Allens法打击法制备脊髓损伤模型：Allens法打击法以一定力量撞击脊髓后造成脊髓水肿、缺血，并继发一系列损伤反应致脊髓损伤的典型表现，这种模型比较接近人类脊髓损伤的病理生理特点及变化规律。该法保持了硬脊膜完整，可有效防止外源性成分侵入脊髓损伤区域，并防止脊髓外露与脑脊液外漏。这种模型对研究脊髓损伤后神经元、神经胶质细胞的病理变化、再生规律和相互作用、探索神经保护策略等有较大帮助。

背景：大量研究证实，丙泊酚通过改善脊髓损伤的微环境，可以有效减少继发性神经损伤。

目的：探讨丙泊酚干预对脊髓损伤大鼠脊髓水肿和后肢电生理的影响。

方法：按照改良的Allen打击法形成大鼠急性脊髓损伤模型，取建模成功40只大鼠随机分为脊髓损伤组和丙泊酚组，每组20只，丙泊酚组尾静脉泵注丙泊酚。另20只假手术组大鼠只暴露脊髓组织。分别于造模前、造模后1，3 d与1-4周通过BBB评分、斜板实验进行运动功能评定。造模后72 h采用TUNEL法检测脊髓损伤神经元凋亡情况，RT-PCR和Western blot法检测脊髓组织水通道蛋白4/9、基质金属蛋白酶9/2 mRNA和蛋白的表达。造模后4周进行免疫组化和苏木精-伊红染色观察脊髓组织病理变化，运动诱发电位和体感诱发电位分析大鼠神经电生理恢复情况。

结果与结论：①造模后1-4周，丙泊酚组BBB评分、斜板实验评分均高于脊髓损伤组(P < 0.05)，但均较假手术组低(P < 0.05)。②脊髓损伤组凋亡细胞数明显多于丙泊酚组(P < 0.05)，假手术组没有凋亡细胞。③脊髓损伤后72 h，丙泊酚组损伤区脊髓组织水通道蛋白4/9、基质金属蛋白酶9/2 mRNA和蛋白表达高于假手术组(P < 0.05)；丙泊酚组大鼠损伤区脊髓组织水通道蛋白4/9、基质金属蛋白酶9/2 mRNA和蛋白的表达较脊髓损伤组明显减少(P < 0.05)。④造模后4周，丙泊酚组脊髓损伤区组织较为疏松，脊髓空洞较小，可见部分神经元坏死，丙泊酚组神经纤维密集程度介于假手术组与脊髓损伤组之间。⑤丙泊酚组运动诱发电位和体感诱发电位明显恢复，潜伏期缩短，波幅增高，与假手术组和脊髓损伤组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。⑥结果表明丙泊酚能够减少脊髓损伤后神经元细胞凋亡，降低脊髓水肿相关基因表达，改善电生理功能及肢体运动功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

ORCID: 0000-0002-4040-4267(何珏)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 丙泊酚, 脊髓损伤, 水肿, 神经再生, 运动功能, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: A large number of studies have verified that propofol could effectively reduce secondary nerve injury by improving microenvironment of spinal cord injury.
OBJECTIVE: To study the effects of propofol on spinal cord edema and electrophysiology of the hind limb in rats with spinal cord injury.
METHODS: Rat models of acute spinal cord injury were established by using the modified Allen method. A total of 40 rat models were randomly divided into spinal cord injury group and propofol group (n=20). Rats in the propofol group were injected with propofol through the caudal vein. The spinal cords of an additional 20 rats were exposed in the sham surgery group. Motor function was evaluated using BBB score and inclined plate test before modeling, 1, 3 days, 1-4 weeks after modeling. Neuronal apoptosis was detected after spinal cord injury using TUNEL assay at 72 hours after modeling. AQP4/9, matrix metalloproteinases 9/2 mRNA and protein expressions were measured using RT-PCR and western blot assay. At 4 weeks after modeling, pathological changes of the spinal cord were observed using immunohistochemistry and hematoxylin-eosin staining. Neurophysiological recovery was analyzed using motor evoked potentials and somatosensory evoked potentials.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 1-4 weeks after modeling, BBB score and inclined plate test score were higher in the propofol group than in the spinal cord injury group (P < 0.05), but lower than in the sham surgery group (P < 0.05). (2) The number of apoptotic cells was significantly more in the spinal cord injury group than in the propofol group (P < 0.05). No apoptotic cells were found in the sham surgery group. (3) At 72 hours after spinal cord injury, AQP4/9 and matrix metalloproteinases 9/2 mRNA and protein expression was higher in the propofol group than in the sham surgery group (P < 0.05). AQP4/9 and matrix metalloproteinases 9/2 mRNA and protein expression was significantly reduced in the propofol group (P < 0.05). (4) At 4 weeks after modeling, the spinal cord was loose, and the cavity was small. Partial neuronal necrosis could be seen. The degree of nerve fiber density in the propofol group was between the sham surgery group and spinal cord injury group. (5) Motor evoked potentials and somatosensory evoked potentials were obviously recovered, the latency was short, amplitude was increased in the propofol group, which showed significant differences as compared with the sham surgery group and the spinal cord injury group (P < 0.05). Results suggested that propofol can reduce apoptosis in rat neurons after spinal cord injury, reduce spinal cord edema-related gene expression, and improve electrophysiological function and limb motor function.

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何珏，王天科. 丙泊酚干预脊髓损伤模型脊髓水肿及后肢电生理的变化[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(5): 640-645.

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图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析参加实验数量65只，进入结果分析数量60只，中途有脱落，造模失败3只及造模后死亡2只。

2.2 运动功能评定结果术前BBB评分、斜板实验评分各组未见明显差异(P > 0.05)。造模后1-4周，丙泊酚组2项评分均高于脊髓损伤组，差异有显著性意义(P < 0.05)，但均较假手术组低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.3 TUNEL检测细胞凋亡情况光镜下可见凋亡细胞散布于整个脊髓损伤区，损伤区边缘亦可见凋亡阳性细胞。丙泊酚组凋亡细胞数(13.46±3.83)明显少于脊髓损伤组(31.76±3.54)，差异有显著性意义(P < 0.05)，假手术组没有凋亡细胞，见图1。

2.4 各组脊髓组织中AQP4/9、MMP9/2 mRNA表达大鼠脊髓损伤后72 h，丙泊酚组损伤区脊髓组织AQP4/9、MMP9/2 mRNA的表达高于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.05)；丙泊酚组大鼠损伤区脊髓组织AQP4/9、MMP9/2 mRNA的表达较脊髓损伤组明显减少，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2，表3，4。

2.5 各组脊髓组织中AQP4/9、MMP9/2蛋白表达大鼠脊髓损伤后72 h，丙泊酚组损伤区脊髓组织AQP4/9、MMP9/2蛋白表达高于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.05)；丙泊酚组大鼠损伤区脊髓组织AQP4/9、MMP9/2 蛋白表达较脊髓损伤组明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3，表3，4。

2.6 脊髓组织病理变化造模后4周，脊髓损伤组脊髓损伤区组织结构疏松，可见脊髓空洞形成，大量神经元坏死。丙泊酚组脊髓损伤区组织较为疏松，脊髓空洞较小，可见部分神经元坏死。假手术组脊髓组织结构清晰完整，未见神经细胞凋亡及脊髓空洞，见图4。

2.7 免疫组化检测结果假手术组脊髓损伤神经纤维排列密集，脊髓损伤组神经纤维排列稀疏，仅见很少短的神经纤维；丙泊酚组神经纤维密集程度介于假手术组与脊髓损伤组之间，见图5。

2.8 体感诱发电位和运动诱发电位的检测结果造模后4周，脊髓损伤组大鼠的运动诱发电位和体感诱发电位少量恢复，丙泊酚组运动诱发电位和体感诱发电位明显恢复，潜伏期缩短，波幅增高，见表5，6。

丙泊酚组与假手术组和脊髓损伤组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。表明丙泊酚组电信号从头皮到后肢传导时间比脊髓损伤组短，恢复较好。

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引言

材料方法

1.1 造模动物成年雌性SD大鼠65只，清洁级，3月龄，体质量250-300 g，购自江西省医学实验动物中心，动物许可证号SCXK(赣)20090106。

1.2 建立脊髓损伤模型及丙泊酚干预随机取45只SD大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于实验平台上，以T₈_-₉棘突为切口中心，自大鼠背部正中逐层切开，完全暴露T₇_-₁₀棘突和椎板，咬除部分椎板和T₈_-₉棘突，暴露硬膜保持完整，作为损伤区。根据改良的Allen法打击，在2.5 cm高度将10 g重物自由落下，撞击脊髓组织及大鼠硬膜(术后大鼠双下肢瘫痪且尾巴痉挛摆动表明成功)。用双氧水清洗伤口，逐层缝合背部切口。术后每天挤尿2到3次，直至大鼠恢复了排尿反射为止。剔除造模失败的3只及造模后死亡的2只，余下40只大鼠随机等分为脊髓损伤组和丙泊酚组。另20只大鼠只暴露脊髓组织作为假手术组。建模后丙泊酚组通过尾静脉留置针泵注丙泊酚注射液2 mL/(kg•h)持续4 h。

1.3 评估方法

1.3.1 运动功能评定 3组大鼠造模前和造模后1，3 d与1-4周进行运动功能评估，运动功能评估统一时间为上午8：00。

BBB评分系统：将后肢运动功能分为22等级，主要观察内容包括关节活动数目和范围、负重程度及前后肢协调性、前后爪和尾部活动情况等。0分为后肢全瘫，21分为功能完全正常。

斜板测试：将大鼠放在光滑的木板上，其身体轴线与平板纵轴平行，平板每次升高5°，以大鼠能停留5 s(保持不下滑)的最大角度为其功能值。

1.3.2 TUNEL法检测细胞凋亡情况造模后72 h，每组取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg)麻醉后开胸，通过升主动脉插管完全显露大鼠心脏，然后剪开右心耳，先灌注生理盐水，再用40 g/L多聚甲醛灌注固定。2 h后取出以伤段为中心上下各0.5 cm节段脊髓组织，用40 g/L多聚甲醛固定，制备切片，每只大鼠取10张切片，二甲苯脱蜡，TUNEL法检测计数阳性细胞，按德国Roche公司试剂盒操作。胞核呈棕黄色颗粒即为TUNEL阳性细胞，计算凋亡指数=阳性细胞数/(阴性+阳性细胞数)×100%。

1.3.3 RT-PCR检测相关基因表达造模后72 h，每组取5只大鼠，取损伤脊髓组织5 mg，Trizol裂解后，分别提取总RNA。通过RT-PCR两步法试剂盒(TaKaRa公司)将mRNA反转录为cDNA，然后再将cDNA进行PCR扩增。扩增产物进行电泳，电泳凝胶图像分析系统分析吸光度值，计算水通道蛋白(aquaporin，AQP)4/9，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)9/2和GAPDH积分吸光度比值，作为AQP4/9、MMP9/2 mRNA表达的指标。各基因引物序列见表1。

1.3.4 Western Blot检测将RT-PCR提取后剩余物以 1 500 r/min离心30 min，取上清为粗体蛋白质，移入干净的Eppendorf管，采用Bradford法蛋白定量。5%浓缩胶40 V衡压1 h，10%分离胶60 V恒压3.5 h，湿转14 V恒压14 h，37 ℃摇床封闭2 h，洗膜3次，将AQP4/9、MMP9/2多克隆抗体1∶500稀释溶于TBST中，室温孵育60 min；TBST洗膜3次10 min，，加入1∶2 000稀释碱性磷酸酶标记的兔抗鼠抗体。室温孵育60 min；TBST洗膜3次，再用TBS洗膜10 min，DAB显色，Quantity one图像分析，AQP4/9、MMP9/2产物与GAPDH产物条带吸光面积的比值，作为AQP4/9、MMP9/2 蛋白表达的指标。

1.3.5 免疫组化和苏木精-伊红染色造模后4周，每组取5只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg)麻醉后开胸，通过升主动脉插管完全显露大鼠心脏，然后剪开右心耳，先灌注生理盐水，再用40 g/L多聚甲醛灌注固定。 2 h后取出以伤段为中心上下各0.5 cm节段脊髓组织，制备冰冻切片，分别进行免疫组化和苏木精-伊红染色，均按试剂盒说明书操作，每张切片取10个视野，在光学显微镜下观察。

1.3.6 运动诱发电位和体感诱发电位检测造模后4周，每组取5只大鼠进行运动及体感诱发电位检测。

体感诱发电位检测：用10%水合氯醛腹腔注射 (350 mg/kg)麻醉，固定后腿刺激电极，将其平放在水平面上记录电极安放于矢状缝和冠状缝愈合线的相交处头皮后肢皮质感觉区下，将参考电极置于其后方0.5 cm处。将其用直流方波电脉冲刺激，以后肢轻微抽动为宜，波宽 0.2 ms，叠加次数50-60次，电流强度为5-15 mA，频率 3 Hz，记录波幅的变化及体感诱发电位潜伏期。

运动诱发电位检测：用10%水合氯醛腹腔注射 (350 mg/kg)麻醉，将针状刺激电极置于矢状缝旁2 mm、顶冠状缝前2 mm处头皮下大脑皮质运动区，扫描速度 5 ms/D，刺激波宽0.1 ms，刺激强度40 mA，刺激频率1 Hz，叠加次数300-500次，灵敏度5 μV/D。分析记录波幅的变化及运动诱发电位潜伏期。

1.4 主要观察指标 ①运动功能。②细胞凋亡情况。③AQP4/9、MMP9/2 mRNA和蛋白表达。④脊髓组织病理变化。⑤运动诱发电位和体感诱发电位。

1.5 统计学分析实验数据以SPSS 17.0软件分析，多组均数比较用单因素方差分析和LSD法，两组均数比较用t 检验，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

脊髓损伤呈逐年上升趋势^[8-9]，如何恢复脊髓损伤患者的神经功能一直是临床医学界的一大难题^[10-11]。急性脊髓损伤后早期微循环障碍导致局部缺血缺氧并发生免疫炎症反应，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等炎症因子被大量激活，星形胶质细胞及小胶质细胞的增殖、活化、迁徙，导致瘢痕形成并继发细胞毒性，持续的脊髓缺血缺氧及代谢紊乱，不利于神经元及轴突的再生，最终导致继发性脊髓损伤^[12-13]。

继发性脊髓损伤是由于造模后损伤区产生大量自由基，随即出现一系列的氧化反应，最终可导致脊髓损伤区神经组织损伤，从而出现许多神经功能缺失的症状及体征^[14-15]。脊髓损伤后应尽早行丙泊酚治疗，有利于减少神经细胞凋亡，减轻患者的残疾程度，预防和阻止患者病情进一步恶化。此研究表明，脊髓损伤后予以丙泊酚治疗，可以有效的减轻脊髓损伤区神经组织的水肿，MMP9/2，AQP4/9基因及蛋白表达的降低能够减轻水肿的程度，同时丙泊酚治疗后能够有效降低损伤区神经细胞的凋亡。BBB评分、斜板实验相关功能学实验表明，丙泊酚治疗能够改善大鼠后肢运动功能。诱发电位实验亦表明丙泊酚治疗能够缩短脊髓损伤大鼠的潜伏期，增高波幅，有效促进大鼠脊髓损伤的恢复。临床治疗脊髓损伤的主要方法是营养神经和物理治疗及康复方式来减少周围神经元坏死的边缘受损面积，恢复脊髓缺血缺氧，促进修复神经元的功能^[16-20]。相关研究表明丙泊酚治疗提高机体的动脉血氧分压^[20]，提高中枢神经系统组织的含氧量，促进中枢神经系统组织的有氧代谢。也有研究表明丙泊酚治疗能降低丙二醛、钙离子含量，抑制脂质过氧化，提高细胞膜抗氧化能力，减少钙离子向细胞内流，保护神经细胞再生^[21]。

总之，丙泊酚能够以下列途径改善大鼠治疗脊髓损伤区的微环境：①脊髓损伤后局部组织水肿，缺氧明显，丙泊酚治疗能显著提高脊髓损伤区的血氧浓度，增加氧的扩散距离，减少缺氧诱导的神经元凋亡。②丙泊酚可以减少MMP9/2，AQP4/9基因和蛋白的表达，减少脊髓损伤的水肿程度。③丙泊酚可以纠正脊髓损伤组织的酸中毒，维持损伤区神经细胞的能量代谢，恢复可逆性损伤的神经元功能。该研究为临床通过丙泊酚干预脊髓损伤修复、提供新的理论依据。

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