1.1 设计 材料学体外实验。
1.2 时间及地点 于2015年6月至2015年12月在西安交通大学附属红会医院转化医学中心完成。
1.3 材料 甲基丙烯酸甲酯丙烯酸甲酯共聚物(PMMA):购于Quiru´rgicas de Levante化学公司,是甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸酯的接枝共聚物,平均分子质量约为350 ku。壳聚糖季铵盐:购于绿神生物工程有限公司(中国,南通),白色或浅类白色无定形粉末状,pH 6.0-8.0。二氧化锆:(BPO)购于Sigma-Aldrich公司,相对分子质量242.23。
1.4 实验方法
1.4.1 新型抗感染骨水泥材料的制备
壳聚糖季铵盐纳米粒子的制备:取100 g壳聚糖季铵盐(绿神生物工程有限公司,南通)溶解于体积分数1%的醋酸溶液,调节pH 4-6。三聚磷酸钠TPP溶于超净水中,不断搅拌直至溶解完全,调节pH值为7.2-7.7,用0.45 μm的滤膜过滤,保持持续磁力搅拌溶液。取溶于体积分数1%醋酸的壳聚糖季铵盐溶液10 mL,缓慢加入TPP溶液中,保持搅拌20-30 min,获得壳聚糖季铵盐纳米粒子溶液。将溶液倒入大面积的玻璃培养皿中, 然后将其放入温度为80 ℃烘箱中进行干燥, 待烘烤至成型并且不再粘手时取出,用剪刀将产品剪成小块并继续放入烘箱烘烤3-5 h直至产品完全干燥,然后研磨成粉剂。
纳米粒子粒径分析:采用激光粒度分析仪(美国麦奇克,西安交通大学实验中心提供)测得所得粉末样本平均直径为200 nm。
新型抗感染骨水泥材料的复合方案:新型抗感染骨水泥QCSNP-15的固相由质量分数69.00%甲基丙烯酸甲酯丙烯酸甲酯共聚物(PMMA)、15.00%壳聚糖季铵盐纳米粒子(自制)、15.20%二氧化锆(BPO,Sigma-Aldrich公司,英国)以及0.80%过氧化苯甲酰(DMPT,Fluka公司,德国)构成, 固相的各组份在高速球磨机(QM-3B,南京南大仪器)中达到均匀复合,液相由97.98%异丁烯酸甲酯和2.02%邻甲基苯腈构成。抗感染骨水泥的固相与液相,按照固相与液相的比例为2 g∶1 mL经过充分混合和手动搅拌,发生聚合反应,即制备成新型抗感染骨水泥材料。聚合反应原理是:二氧化锆作为引发剂,过氧化苯甲酰作为催化剂,固相中甲基丙烯酸甲酯丙烯酸甲酯共聚物与液相中异丁烯酸甲酯,通过自由基聚合方式发生聚合反应。
实验分组:实验分为3组:新型抗感染骨水泥命名为QCSNP-15(n=6),普通骨水泥命名为Palacos R(n=6),抗生素骨水泥命名为Palacos R+G(n=6)。
1.4.2 体外材料学观察实验
扫描电镜观察:将QCSNP-15和Palacos R+G制成直径2 mm、厚度1 mm的圆片。在真空条件下,使用电子显微镜(Scanning Electron Microscope, SEM,S-3400,HITACHI,Japan,西安交通大学电镜实验中心提供)观察材料表面表层的结构和形貌。各组样本在观察前需进行喷金处理。参数设置:加速电压5 kV,视野范围6 mm,X-射线参数8.5 mm、WD35 度接收角,压力范围:10-400 Pa,工作室365 mm(φ)× 275 mm(h)。
固化时间测定:面团时间和固化时间根据ISO5833 国际标准测定。面团时间为从骨水泥混合到骨水泥不再粘附手术手套的时间。固化时间的测定采用ISO 水泥标准稠度凝结时间测定仪(河北省虹宇仪器设备有限公司)。将终凝用试针垂直放在骨水泥表面,停留5 s,每隔30 s重复1 次, 至终凝用试针针头在骨水泥表面未能留下圆形痕迹。从骨水泥开始混合到终凝用试针针头不能在骨水泥表面留下圆形痕迹的时间为骨水泥的固化时间。QCSNP-15和Palacos R+G两组骨水泥重复6 次,取平均值。
体外抗压强度试验:将QCSNP-15和Palacos R两组固化后制备成直径6 mm、长度12 mm的圆柱体,每组各制备6个样本(n=6)。在MTS力学实验机(MTS 858 Bionix machine,MTS公司,新泽西,美国)上进行抗压强度测定,载荷速率为0.01 mm/s。抗压缩强度为材料屈服的时所承受的最大压缩应力除以受压面积[18]。
1.4.3 细胞毒性实验
细胞株的培养:小鼠成骨细胞株MC3T3-E1为西安交通大学中心实验室提供, 培养于体积分数10%小牛血清的DMEM培养基中, 置培养箱内体积分数5%CO2、 37 ℃常规培养,均匀接种于96孔板,每孔加1 mL,继续培养供实验待用。
细胞贴附实验:将QCSNP-15和Palacos R+G制成直径2 mm、厚度1 mm的圆片,将MC3T3-E1以1×108/孔的浓度接种到材料表面,置培养箱内5%CO2,37 ℃培养3 h。用40 g/L多聚甲醛固定细胞,使用Rhodamine phalloidin (Sigma, 伦敦,英国)进行细胞免疫染色,在激光共聚焦显微镜下观察各组细胞的贴附情况。然后将各组样本使用无菌PBS冲洗,将各组样本上贴附的细胞使用100 W的超声下5-7 min,从样本表面完全冲洗下来,进行连续10倍稀释,用细胞计数板的方法计算样本上贴附的细胞数量。
1.4.4 体外抗菌实验
金黄色葡萄球菌的培养:使用酵母葡萄糖肉汤(Sigma)作为金黄色葡萄球菌的培养基。所有的玻璃器皿均在120 ℃高压灭菌20 min。将细菌放置于培养基中37 ℃过夜。再将2 mL的细菌样本加入到酵母葡萄糖肉汤中培养6-8 h直至达到指数生长期。最终将细菌使用分光光度仪在紫外线波长600 nm的条件下,调整细菌菌落密度为1011 CFU L-1。
骨水泥抗菌实验:将QCSNP-15、Palacos R和Palacos R+G制成直径2 mm、厚度1 mm的圆片。将3组样本置于37 ℃的PBS溶液中浸泡2周。然后将浸泡前与浸泡后的各组样本,置于15 mL的细胞悬液中,37 ℃培养3 h。然后将各组样本使用无菌PBS冲洗,将各组样本上贴附的细菌使用100 W的超声下5-7 min,从样本表面完全冲洗下来,进行连续10倍稀释,用细胞计数板的方法计算细菌数量[19]。
1.5 主要观察指标 各组固化时间、抗压强度、材料表面细胞贴附率及材料表面贴附细菌数。细胞贴附率=贴附细胞的总数/接种细胞总数×100%;以细胞培养板材料TCPS(Tissue Culture Polystyrene, 组织培养的聚苯乙烯)为参照,设TCPS表面的细胞贴附率为100%,QCSNP-15的规范化细胞贴附率(Normalized cell adhesion)=QCSNP-15的细胞贴附率/TCPS的细胞贴附率×100%,Palacos R+G的规范化细胞贴附率= Palacos R+G的细胞贴附率/TCPS的细胞贴附率× 100%。细菌数量=贴附的细菌总数/材料表面积。
1.6 统计学分析 计量资料以x±s表示,采用SPSS 17.0软件进行数据分析。两组间的比较采用两样本t 检验,多组数据的总体差异比较采用单因素方差分析,组内各组间的两两比较采用LSD-t 检验。检验水准α =0.05。