胡椒碱对牙周炎模型牙槽骨和胶原的保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.016

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

胡椒碱：用于白兰地添加剂，使有辛辣味，也可作为杀虫剂。此外，它还是中国治疗癫痫验方(白胡椒和萝卜)中主要抗惊厥成分为食品业中用作辛辣味原料，具杀菌作用。

骨吸收：此过程是破骨细胞的破骨过程。当骨组织的某处在一特定的时间需要重建时(如微创伤-疲劳骨等)，先有一组破骨细胞被激活(包括单核前体细胞→破骨细胞前体→破骨细胞成熟、活性提高)，迁移并黏附于吸收部位的矿化骨基质上(即矿化骨表面)，融合成多核巨细胞，并发生极化。当骨吸收增加、或骨新生减少、或二者并存时，即发生骨丧失，使牙槽骨高度降低。

摘要

背景：胡椒碱在胰腺炎模型、痛风模型、大脑中动脉梗死模型中具有抗炎、抗氧化以及免疫调节作用，但其对牙周炎模型的作用效果目前尚未清楚。

目的：观察胡椒碱对实验性大鼠牙周炎模型骨吸收和胶原降解的保护作用。

方法：采用3-0的手术丝线结扎大鼠下颌第一磨牙牙颈部建立牙周炎模型，在建模前1 d分别灌胃胡椒碱50，100 mg/kg，并设健康对照组和模型组作对比，建模后8周进行相关检测。

结果与结论：①CT定量分析结果：与健康对照组相比，模型组的第一磨牙釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离明显降低(P < 0.05)，胡椒碱50，100 mg/kg组牙槽骨破坏程度较模型组明显改善(P < 0.05)；②相关因子蛋白表达：与模型组相比，胡椒碱100 mg/kg组基质金属蛋白酶8，13和白细胞介素1β蛋白表达明显下调(P < 0.05)，胡椒碱50 mg/kg组基质金属蛋白酶8蛋白表达明显下调(P < 0.05)；③胶原纤维染色形态：与模型组相比，胡椒碱50，100 mg/kg组的胶原纤维排列较为整齐，胶原纤维面积明显增加(P < 0.05)；④结果证实：胡椒碱能降低牙周炎模型牙槽骨吸收程度，减轻胶原纤维的降解，保护牙周组织，其机制与抑制基质金属蛋白酶8，13和白细胞介素1β蛋白表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

ORCID: 0000-0001-5991-8404(葛润)

关键词: 实验动物, 口腔损伤与修复动物模型, 胡椒碱, 牙周炎, 胶原纤维, 人中性粒细胞胶原酶, 人基质金属蛋白酶, 细胞外基质金属蛋白酶诱导因子, 肿瘤坏死因子α, 重组人白细胞介素1β, 大鼠, 牙槽骨吸收

Abstract:

BACKGROUND: Piperine in models of pancreatitis, gout, middle cerebral artery infarction has anti-inflammatory, antioxidant and immune regulatory effects, but its effects on periodontitis model are not clear.

OBJECTIVE: To observe the protective effect of piperine on bone absorption and degradation of collagen in experimental rat models of periodontitis.

METHODS: Rat models of periodontitis were established by ligaturing the dental cervix of rat mandibular first molar with 3-0 silk. On day 1 before model establishment, rats were intragastrically administered piperine 50 and 100 mg/kg. There were healthy control group and model group. Related detection was performed 8 weeks after model establishment.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Results of quantitative CT analysis: compared with the healthy control group, the distance from the first molar enamelo-cemental junction to the alveolar ridge crest was significantly lower in the model group (P < 0.05). The degree of alveolar damage was significantly improved in the 50 and 100 mg/kg piperine groups compared with the model group (P < 0.05). (2) Related factor protein expression: compared with the model group, matrix metalloproteinase-8, -13 and interleukin-1β protein expression was significantly decreased in the 100 mg/kg piperine group (P < 0.05); matrix metalloproteinase-8 protein expression was significantly decreased in the 50 mg/kg piperine group (P < 0.05). (3) Collagen fiber morphology: compared with the model group, collagen fibers arranged orderly and collagen fiber area significantly increased in the 50 and 100 mg/kg piperine groups (P < 0.05). (4) Results confirmed that piperine could reduce the alveolar bone resorption, reduce the degradation of collagen fibers and protect the periodontal tissues in models of periodontitis. Its mechanism is associated with the inhibition of matrix metalloproteinase-8, -13 and interleukin-1β protein expression.

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Key words: Tissue Engineering, Periodontitis, Models, Animal

中图分类号:

R318

葛润，杨兰. 胡椒碱对牙周炎模型牙槽骨和胶原的保护[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(40): 6034-6040.

Ge Run, Yang Lan. Protective effects of piperine on alveolar bone and collagen in a periodontitis model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(40): 6034-6040.

图/表（结果） 2

2.1 造模成功动物数量及过程 纳入大鼠32只均进入结果分析。造模动物流程表见图1。

2.2 模型创新性 锐分离大鼠双侧下颌第一磨牙颊侧牙龈、局部黏结牙周病患者牙石后，龈沟内滴入牙周病患者唾液的方法，并辅以高糖黏性食物饲养，成功制备了牙周炎动物模型。

2.3 模型稳定性 局部黏结牙石加混合细菌感染的方法建立的大鼠牙周炎模型可以模拟人类牙周炎的组织变化，是一种接近于人类临床的简单、实惠、有效的建模方法。

2.4 牙周炎模型大鼠体质量变化 实验前，4组大鼠的体质量差异无显著性意义(P=0.333)。丝线结扎后第7天，健康对照组大鼠体质量为(245.1±14.1) g，模型组体质量为(237.9±13.7) g。胡椒碱治疗组的体质量：胡椒碱50 mg/kg组为(244.1±15.1) g；胡椒碱100 mg/kg组为(231.6± 15.7g)，与模型组相比差异无显著性意义(P >0.05)。

2.5 胡椒碱对骨吸收的保护作用 健康对照组可见牙槽骨完整，骨小梁排列整齐，无破坏；模型组可见牙槽骨吸收严重，裸露牙根，骨小梁破坏严重；胡椒碱 50 mg/kg组和胡椒碱100 mg/kg组组与模型组相比较，牙槽骨吸收减轻，骨小梁破坏减轻，见图2。大鼠第一磨牙釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离显著性降低。胡椒碱各剂量组的大鼠第一磨牙釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离均明显低于模型组(P < 0.05)。见图3。

2.6 胡椒碱对牙周炎模型大鼠牙周组织学变化的影响 健康对照组牙周组织完整；模型组牙周组织可见大量的炎症细胞浸润；胡椒碱50，100 mg/kg组牙周组织炎症细胞浸润明显减轻，水肿少。见图4。

2.7 胡椒碱对牙周炎模型大鼠牙周组织胶原纤维的影响 建模后8周，检测各组牙周组织各自的胶原纤维的分布和降解情况。胶原纤维在图中显示为黄色、绿色、红色。在健康对照组大鼠牙周组织中，胶原纤维分布均匀、致密，排列整齐，胶原纤维方向较一致，未见明显空洞，且边界较完整，未见毛边。与健康对照组比较，模型组中胶原纤分布不均匀、疏松，排列紊乱，胶原纤维之间可见黑色吸收空洞，胶原纤维面积明显下降(P < 0.05)。胡椒碱50，100 mg/kg组胶原纤维面积明显比模型组大，纤维内空洞较少，排列较均匀，两组之间也差异有显著性意义(P < 0.05)。见图5，6。

2.8 胡椒碱对牙周组织基质金属蛋白酶8、基质金属蛋白酶13、EMMPRIN、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β蛋白表达的影响 建模后8周，Western blot检测显示，与健康对照组相比，模型组大鼠基质金属蛋白酶8、基质金属蛋白酶13、EMMPRIN、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β蛋白表达增高(P < 0.05)。与模型组相比，胡椒碱100 mg/kg组基质金属蛋白酶8、基质金属蛋白酶13和白细胞介素1β蛋白表达下降，胡椒碱50 mg/kg组基质金属蛋白酶8蛋白表达下降，但对基质金属蛋白酶13和白细胞介素1β蛋白表达则无明显作用。另外，两种剂量胡椒碱对EMMPRIN和肿瘤坏死因子α蛋白均无明显作用(图7，表1)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物模型实验。

1.2 时间及地点 于2014年1月至2015年5月在兰州大学第二附属医院口腔科实验室完成。

1.3 造模动物 健康雄性SD大鼠32只，体质量(250± 50) g，购自自湖北省动物实验中心，动物合格证号：SCXK(鄂)2014-2017，实验动物使用许可证号：SYXK (鄂)2004-2021，并辅以高糖黏性饲料饲养。

1.4 造模方法及干预 将SD大鼠32只随机分为4组，每组8只。健康对照组、模型组、胡椒碱50，100 mg/kg组。健康对照组大鼠不施加任何影响因素进行正常饲养；模型组大鼠采用3-0的手术丝线结扎大鼠下颌第一磨牙牙颈部；胡椒碱50，100 mg/kg组分别在建立大鼠牙周炎模型前1 d开始灌胃给药，剂量为50，100 mg/kg，1 d后结扎下颌第一磨牙颈部，持续保持胡椒碱喂食直至实验结束。

构建大鼠牙周炎模型：大鼠使用体积分数4%水合氯醛腹腔注射麻醉后，左上第一磨牙采用0.2 mm正畸结扎线结扎，局部黏结慢性牙周炎患者的牙石于牙颈部，滴入慢性牙周病炎患者的唾液10 μL/次，2次/d；右侧不结扎作为自身对照，于8周后颈椎脱臼发处死、取大鼠外周血血清，取双侧上颌牙体牙周联合标本，体积分数10%EDTA脱钙后，常规制作切片，苏木精-伊红染色。

1.5 造模成功的标准

1.5.1 探诊健康对照组大鼠在实验过程中牙龈组织呈粉红色，无充血水肿，无炎症性改变。牙槽骨未见吸收；实验组大鼠在造模3 d时，牙龈红肿、探诊出血，无牙槽骨丧失；8 d时牙周组织松软，探诊出血严重，牙槽骨吸收较重，有的甚至可见根分叉。

X射线检测：模型组大鼠牙槽骨可见附着丧失，牙槽骨可见不同程度的吸收，牙槽嵴亦有不同程度的吸收；健康对照组大鼠牙槽骨无附着丧失。

1.6 检测指标

1.6.1 骨形态学Micro-CT重建分析将剥离的一侧下颌骨块固定在扫描标准容器中。保持牙齿长轴于垂直于地面。每组样本扫描时间为2-5 h。扫描参数设置如下：① 1 024×1 024 像素分辨率；②扫描层厚10 μm；③扫描放大倍率10倍；④电压50 kV；⑤电流0.1 mA。扫描完成后使用DICOM保存，使用OnDemand软件重建图像。分别用软件检测大鼠下颌骨重建模型的第一磨牙釉牙骨质界(CEJ)到牙槽嵴顶(AC)的距离(CEJ-AC)。每个牙齿3个测量值(μm)，取其平均值作为CEJ-AC距离。

1.6.2 胶原纤维染色苦味酸天狼猩红染液的配置：苦味酸2 g加入到100 mL 3 d蒸馏水中，加热至完全溶解后室温冷却，有晶体析出后吸取上清，为饱和苦味酸溶液。按天狼猩红燃料和苦味酸溶液的比例为0.1 g∶100 mL的比例配置染液，最终浓度为体积分数0.1%饱和苦味酸天狼猩红胶原纤维染液；切片60 ℃温箱30 min，二甲苯脱蜡30 min×2次，乙醇梯度脱水，流水冲洗3 min，PBS漂洗3 min；体积分数0.1%苦味酸天狼猩红染液染色1 h，0.01 mol/L盐酸溶液漂洗3 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明；中性树胶封固，晾干；偏振光荧光显微镜下观察切片，使用内置数码相机拍摄图片。在每张切片邻间隙区域选择6个方框，大小为100 μm×100 μm，每个方框面积为0.01 mm²。用Leica Qwin软件(Leica Qwin V3)分析各个方框内的胶原纤维占方框的面积分数(area fraction，A%)。取6个检测结果的平均值为该张切片的数值，每个样本选取4张具有代表性的切片，其平均值代表每个样本的胶原纤维A%。

1.6.3 苏木精-伊红染色切片于60 ℃温箱烤片2 h，经二甲苯脱蜡30 min×2 次，乙醇梯度水化。置于PBS 中摇床上摇5 min；苏木精染色30-60 s，自来水冲洗5 min，返蓝；体积分数1%盐酸乙醇分色，流水冲洗60 s；伊红染色30 s，流水冲洗5 min；乙醇梯度脱水，干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干，光学显微镜下观察。

1.6.4 Western blot检测加入加速剂TEMED后立即摇匀，灌胶。凝后配浓缩胶灌胶备用；计算25 μg蛋白上样量，加入5×上样缓冲液，最终配成上样缓冲液浓度为1×的蛋白样本。95 ℃变性10 min。加足够体积的电泳液，每孔缓慢加入样品加入蛋白样本，一孔预留加入Marker；电泳：4 ℃冷房下进行连续电泳。其中浓缩胶70 V，30 min，分离胶100 V，120 min。转膜：戴无粉手套，防止其他蛋白污染。4 ℃下，70 V转膜2 h；封闭：将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有5%脱脂奶粉封闭液100 mL的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h；一抗孵育：取含有体积分数1%BSA的TBST，加入一抗工作液，4 ℃过夜。次日去除PVDF膜，TBST 漂洗3次，每次10 min；二抗孵育：用TBST按1∶2 000比例稀释HRP标记的二抗稀释液。二抗稀释液混匀与膜接触无气泡，室温孵育2 h，脱色摇床TBST洗3次，每次10 min；ECL试剂化学发光，显影，定影。图像分析：将胶片扫描，用用凝胶图像处理系统分析软件Quantity One分析目的蛋白条带的吸光度值和β-actin的比值。

1.7 主要观察指标 各组牙槽骨破坏程度，基质金属蛋白酶8、基质金属蛋白酶13、EMMPRIN、肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β蛋白表达情况。

1.8 统计学分析 计量资料采用x(_)±s表示，使用SPSS 13.0软件进行数据分析，数值符合正态分布采用t 检验，不符合正态分布采用非参数检验。采用单因素方差分析比较各组胶原纤维含量，用Turkey’s test进行组间多重数据比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

牙周病是口腔常见病，其复杂的致病因子、发病机制及某些防治措施等常无法直接在人体上进行研究，因此动物实验成为牙周病研究的基本实验方法之一^[9-10]。大鼠是最常用的实验动物^[11]，在大鼠磨牙上结扎丝线或正畸用钢丝是现在比较常用的造模方法。仅仅结扎或者结扎+高糖饮食的方法就可诱导大鼠产生牙周炎。与其他建模的实验方法相比较而言，此模型在局部涂抹牙周炎患者唾液，唾液中就含有大量的混合牙周致病细菌，更加接近于牙周炎患者口腔内环境，经观察8 d就可以建立稳定的牙周炎动物模型。实验所采用的建模方法简单、经济、易于操作，建模所需时间短、更接近于口腔内环境，对实验结果影响小，是一种值得采用的建立牙周炎动物模型的方法^[12-13]。

患牙周炎时牙槽骨的吸收主要由局部慢性炎症引起，研究表明，牙槽骨吸收与白细胞介素1、白细胞介素2、肿瘤坏死因子α、前列腺素E2等有密切关系，白细胞介素1和肿瘤坏死因子α在牙周炎中能启动组织破坏和骨吸收，白细胞介素1是牙槽骨脱矿的最有效诱导因素，白细胞介素6可刺激破骨细胞分化和骨吸收，且能抑制骨形成^[14-16]。前列腺素E2通过cAMP介导通路刺激类成骨细胞产生破骨细胞分化因子等途径促进破骨过程，使成骨细胞从骨组织内释放出来^[17-18]。胡椒碱是自胡椒科植物果实中提取一种生物碱，具有抗炎作用，研究表明，胡椒碱通过抑制诱导促炎性细胞因子产生的核转录因子、活化转录因子等抑制白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等炎性细胞因子表达明显下降^[19-21]。实验结果显示，胡椒碱50，100 mg/kg组型组明显减少，ACJ-AC距离明显低于模型组，说明胡椒碱在大鼠牙周炎中具有保护牙槽骨的作用，且这种作用呈浓度依赖性。另外，研究结果也显示，胡椒碱50，100 mg/kg组胶原纤维面积明显比模型组大，纤维内空洞较少，排列较均匀，说明胡椒碱对大鼠牙周组织胶原纤维具有保护作用。胡椒碱对牙槽骨和胶原纤维具有的保护作用机制目前尚未完全掌握清楚，有待进一步深入研究。

基质金属蛋白酶8是由中性粒细胞合成分泌^[22]，基质金属蛋白酶13 是上皮组织中首要表达的胶原酶基质金属蛋白酶8和基质金属蛋白酶13主要降解Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ、Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ型胶原^[23]，当中性粒细胞浸润炎性部位时释放出颗粒中大量的基质金属蛋白酶8从而维持局部的炎症反应。研究证实胶原酶的活性与牙周炎的炎症程度成正相关。基质金属蛋白酶8在成人牙周炎患者的胶原酶活性中起主要作用。体内外研究表明，基质金属蛋白酶在牙周炎的发生和发展过程中发挥重要作用，参与牙周组织细胞外基质的结构蛋白的降解和破坏^[24-25]。EMMPRIN直接作为信号转导黏附分子的调节因子，刺激邻近细胞MMPs表达上调^[26-27]。Emingil等^[28]从健康人龈沟液中检测到可溶性EMMPRIN的表达；在牙周炎患者的龈沟液中EMMPRIN的水平上调，且与炎症程度密切相关。实验结果显示，牙周炎大鼠基质金属蛋白酶8、基质金属蛋白酶13及EMMPRIN蛋白水平明显升高，50 mg/kg胡椒碱对基质金属蛋白酶8蛋白有明显抑制作用，但对基质金属蛋白酶13和白细胞介素1β蛋白则无明显作用，100 mg/kg胡椒碱能够明显抑制基质金属蛋白酶8、基质金属蛋白酶13和白细胞介素1β的蛋白表达。说明胡椒碱能抑制基质金属蛋白酶8、基质金属蛋白酶13及EMMPRIN的蛋白表达水平，对牙周炎具有保护作用。

综上所述，胡椒碱可以显著抑制实验性大鼠牙周炎模型的胶原纤维降解和骨吸收，对牙周组织具有保护作用，作用机制与胡椒碱能够明显降基质金属蛋白酶8、基质金属蛋白酶13及白细胞介素1β的蛋白表达水平有关，但其对EMMPRIN和肿瘤坏死因子α蛋白的表达量无显著影响。

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