阳离子化牛血清白蛋白诱导膜性肾病模型大鼠足细胞相关蛋白的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.015

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (40): 6028-6033.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.015

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阳离子化牛血清白蛋白诱导膜性肾病模型大鼠足细胞相关蛋白的表达

梁静¹，张渊²，赵玉容¹，孟祥龙¹，王莉²

¹四川省医学科学院•四川省人民医院城东病区肾脏科，四川省成都市 610110；²四川省医学科学院•四川省人民医院肾脏科，四川省成都市 610072

修回日期:2016-07-02 出版日期:2016-09-30 发布日期:2016-09-30
通讯作者: 王莉，教授，博士，四川省医学科学院?四川省人民医院肾脏科，四川省成都市 610072
作者简介:梁静，女，1981年生，四川省泸州市人，汉族，2008年四川医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事肾脏纤维化的研究。
基金资助:
四川省卫生厅课题基金资助(110238)：纤溶系统及细胞免疫对膜性肾病大鼠足细胞损伤凋亡的影响

Model rats with membranous nephropathy induced by cationic bovine serum albumin: expressions of related proteins in podocytes

Liang Jing¹, Zhang Yuan², Zhao Yu-rong¹, Meng Xiang-long¹, Wang Li²

¹Department of Nephrology, Sichuan Provincial Academy of Medical Science•East Branch of Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610110, Sichuan Province, China; ²Department of Nephrology, Sichuan Provincial Academy of Medical Science•Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China

Revised:2016-07-02 Online:2016-09-30 Published:2016-09-30
Contact: Wang Li, Professor, M.D., Department of Nephrology, Sichuan Provincial Academy of Medical Science?Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan Province, China
About author:Liang Jing, Master, Attending physician, Department of Nephrology, Sichuan Provincial Academy of Medical Science?East Branch of Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610110, Sichuan Province, China
Supported by:
the Foundation of Sichuan Provincial Health Department, No. 110238

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

膜性肾病：是一种原发性肾小球疾病的病理学诊断名称，以肾小球基底膜上皮细胞下弥漫的免疫复合物沉积，伴肾小球基底膜弥漫增厚为特点，临床呈肾病综合征或大量蛋白尿，是成人肾病综合征的主要病因。

足细胞：即肾小球上皮细胞，是高度特异且终未分化的细胞，具有维持正常肾小球蛋白滤过，合成肾小球基底膜，支撑肾小球毛细血管襻结构等重要的生理功能。在膜性肾病，肾小球细胞以足细胞损伤为主，足细胞病变导致蛋白尿形成和肾组织损伤。

摘要

背景：膜性肾病动物模型可模拟人类膜性肾病的发病机制，对疾病的研究具有重要意义。

目的：观察膜性肾病模型大鼠足细胞相关蛋白nephrin、podocin的表达，以探讨其与膜性肾病发病的关系。

方法：将40只SD大鼠随机分为模型组和对照组，每组20只。模型组取阳离子化牛血清白蛋白1 mg溶解于0.5 mL生理盐水中与等量不完全弗氏佐剂充分乳化后在颈背部皮下多点注射预免疫1周后正式免疫，尾静脉给予阳离子化牛血清白蛋白16 mg/kg，隔日1次，持续4周。对照组尾静脉注射等体积生理盐水。造模后第2，4周进行生化指标检测和病理学检查，RT-PCR法检测肾组织中nephrin和podocin mRNA的表达。

结果与结论：①模型组24 h尿液总量明显减少，且出现了明显的蛋白尿，血清肌酐、尿素氮、胆固醇、三酰甘油水平显著升高，血清白蛋白水平显著降低，与对照组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，且随着病变继续发展，病情加重；②病理检测发现模型组有不同程度肾小管扩张，肾小球基底膜增厚，系膜细胞及基质增生，呈典型的膜性肾炎改变；③模型组大鼠肾组织nephrin和podocin mRNA表达量低于对照组；④结果表明，nephrin、podocin表达减少可能使足细胞裂孔膜结构的完整性受损，肾小球滤过屏障破坏，导致蛋白尿。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

ORCID: 0000-0002-4204-3768(王莉)

关键词: 实验动物, 细胞损伤与修复模型, 膜性肾病, 阳离子化牛血清白蛋白, 蛋白尿, 肌酐, 尿素氮, nephrin, podocin, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Establishing the animal model of membranous nephropathy is of importance to figure out the pathogenesis of membranous nephropathy.

OBJECTIVE: To investigate the expression of nephrin and podocin in the model of membrane nephropathy in rats, and to investigate their relationships with the pathogenesis of membranous nephropathy.

METHODS: A total of 40 Sprague-Dawley rats were equivalently randomized into model and control groups. Rats in the model group were in premunity by given subcutaneous and multi-point injection of 1 mg cationic bovine serum albumin firstly dissolved in 0.5 mL normal saline and then fully emulsified with the equal incomplete Freund’s adjuvant for 1 week, and 16 mg/kg cationic bovine serum albumin was injected via vein tails, once every other day for 4 weeks. The same volume of normal saline was injected into the controls. The mRNA expressions of nephrin and podocin in renal tissues were detected using real-time PCR, and biochemical indicators and morphological observation were measured at 2 and 4 weeks after modeling.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) In the model group, the total amount of urine and serum albumin levels were significantly decreased accompanying with overt proteinuria, and the serum creatinine, urea nitrogen, cholesterol and triglyceride levels were significantly increased all in a time-independent manner compared with the control group (P < 0.01), and the difference was significant (P < 0.05). (2) The pathological examination showed that rats in the model group had different degrees of renal tubular dilatation, glomerular basement membrane thickening, mesangial cells and stromal hyperplasia, which was typical of membranous nephritis. (3) Moreover, the mRNA expressions of podocin and nephrin in the model group were lower than those in the control group. (4) In conclusion, the decreased expressions of podocin and nephfin may disturb the integrity of the slit membrane of podocytes giving rise to the damage of glomerular filtration barrier, and proteinuria appears in final.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Glomerulonephritis, Membranous, Serum Albumin, Bovine, Proteinuria, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

梁静，张渊，赵玉容，孟祥龙，王莉. 阳离子化牛血清白蛋白诱导膜性肾病模型大鼠足细胞相关蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(40): 6028-6033.

Liang Jing, Zhang Yuan, Zhao Yu-rong, Meng Xiang-long, Wang Li. Model rats with membranous nephropathy induced by cationic bovine serum albumin: expressions of related proteins in podocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(40): 6028-6033.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性健康SD成年大鼠40只，体质量(200±20) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于屏障系统环境。

1.1.2 主要药品及试剂天然牛血清白蛋白(Sigma公司)，等电点4.5；碳化二亚胺盐酸盐(西安罗森伯科技有限公司)；4 mol/L醋酸缓冲液和无水乙二胺(国药集团化学试剂成都有限公司)；尿蛋白定量试剂盒、肌酐(Cr)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；RT-PCR试剂盒(美国Promega公司)。

1.1.3 主要仪器光学显微镜(日本Olympus公司)；747 型全自动生化分析仪(日立公司)；PCR仪(美国ABI公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 阳离子化牛血清白蛋白的制备参照Bordert等^[5]方法，将67 mL无水乙二胺加入500 mL双蒸水中混匀，缓慢加入6 mol/L盐酸约350 mL，调节pH至4.75，最终溶液温度保持在25 ℃；取5 g天然牛血清白蛋白溶于25 mL双蒸水，在恒温25 ℃下不断搅拌，缓慢加入上述溶液中，再加入1.8 g碳化二亚胺盐酸盐，反应2 h后加入pH为4.75的4 mol/L醋酸缓冲液30 mL终止反应，即得阳离子化牛血清白蛋白溶液。将所得溶液在4 ℃双蒸水中透析72 h(每3-5 h换水1次)，冷冻干燥，得到冻干粉剂，测得等电点为9.00，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 动物分组及造模将40只SD大鼠随机分为模型组和对照组，每组20只。大鼠适应性饲养1周后模型组取阳离子化牛血清白蛋白1 mg溶解于0.5 mL生理盐水中与等量不完全弗氏佐剂(自备)充分乳化后在颈背部皮下多点注射预免疫1周后正式免疫，尾静脉给予阳离子化牛血清白蛋白16 mg/kg(溶于1 mL pH 7.4的PBS中)，隔日1次，持续4周。对照组尾静脉注射等体积生理盐水。

1.2.3 生化指标检测造模后第2，4周，两组随机各取5只大鼠用代谢笼收集24 h尿液(禁食不禁水)，记录24 h尿液总量，采用试剂盒进行24 h尿蛋白定量检测，随后称体质量，麻醉后眼眶静脉丛采血分离血清使用生化分析仪进行尿素氮、肌酐、白蛋白、胆固醇、三酰甘油等血清生化指标检测。

1.2.4 标本采集造模后第2，4周，两组随机各取5只大鼠麻醉后处死，分离肾脏，一部分用体积分数为10%甲醛溶液固定，光镜观察肾组织病理学改变，另一部分置于液氮过夜后转入-70 ℃保存，用于RT-PCR检测。

1.2.5 肾组织病理学形态观察取体积分数为10%甲醛溶液固定后的标本，经乙醇逐级脱水、包埋于石蜡中，切片厚度为3 µm，并行苏木精-伊红染色，光镜观察肾组织病理学改变。

1.2.6 肾组织中nephrin和podocin mRNA的表达取肾组织5 mg，Trizol裂解后，分别提取总RNA。通过RT-PCR两步法试剂盒将mRNA反转录为cDNA，然后再将cDNA进行PCR扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶图像分析系统分析灰度值，计算目的基因与内参β-actin基因扩增条带灰度比值，即得目的基因的相对表达量。各基因引物序列见表1。

1.3 主要观察指标 ①24 h尿蛋白定量和血生化指标；②肾组织病理学形态；③肾组织nephrin和podocin mRNA表达。

1.4 统计学分析 计量数据以x(_)±s表示，采用SPSS 13.0统计学软件进行t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

讨论

膜性肾病是一种免疫介导的肾小球疾病，目前比较公认的机制是上皮侧免疫复合物的沉积，激活补体形成膜攻击复合物导致足细胞损伤^[6]，尚缺少有效的治疗方案，因此建立良好的膜性肾病动物模型对疾病的研究具有重要意义。膜性肾病造模方法的基本原理是通过注射外源性抗原或抗体，诱发机体自身免疫反应，从而复制出具有与人类膜性肾病相似临床和病理表现的动物模型^[7-10]。
阳离子化牛血清白蛋白建立膜性肾病模型是免疫复合物肾小球肾炎模型的一种，其操作简单，应用范围广泛^[11-13]，缺点是需要长期尾静脉注射，对动物损伤较大。该模型原理是由于肾小球基底膜带有负电荷，使得带正电荷的阳离子化牛血清白蛋白能够轻易地穿过基底膜成为种植抗原，诱导循环中相应的抗牛血清白蛋白抗体聚集于此形成原位免疫复合物。阳离子化牛血清白蛋白模型适用于多种动物，包括兔、大鼠、小鼠等。阳离子化牛血清白蛋白不仅能引起动物的膜性肾病，在人类身上也具有类似的效应，食物中未被完全消化掉的阳离子化牛血清白蛋白可通过消化道途径进入人体内形成种植抗原，与IgG1和IgG4 形成原位免疫复合物，导致膜性肾病的发生。前期实验选用大鼠进行造模，发现3，10，16 mg/kg阳离子化牛血清白蛋白所致的肾小球毛细血管基底膜增厚程度不一，3 mg/kg组与正常组比较无明显差异，10 mg/kg组表现类似于膜性肾病Ⅰ期，16 mg/kg组成模稳定，效果最佳^[14]，与膜性肾病Ⅱ-Ⅲ期表现类似，因其发病机制与人类膜性肾病有很多相似之处，已成为研究人类膜性肾病最常用的动物模型之一。实验用16 mg/kg尾静脉给大鼠阳离子化牛血清白蛋白，免疫周期为4周，无论是从病理特点还是临床特征都更接近于人类膜型肾病。

实验使用阳离子化牛血清白蛋白隔日尾静脉注射4周，可见大鼠的24 h尿液总量明显减少，且出现了明显的蛋白尿，血清胆固醇、三酰甘油水平显著升高，血清白蛋白水平显著降低，与对照组比较差异有非常显著性意义(P < 0.01)，各项指标变化符合膜性肾病病变特征，且随着病变继续发展，病情加重。另外，实验结果显示，血清肌酐和尿素氮水平在实验周期内与对照组比较差异无显著性意义，可能是在4周内肾脏仍处于功能代偿期，使肌酐和尿素氮值尚处于正常范围内，也可能与造模剂量和造模时间有很大关系。

利用阳离子化牛血清白蛋白免疫大鼠4周，病理检测发现模型组大鼠可见不同程度肾小管扩张，肾小球基底膜增厚，系膜细胞及基质增生，呈典型的膜性肾炎改变。但是，实验未进行免疫组化、免疫荧光、组织电镜检查是该研究的不足之处，在以后研究中将进一步进行分析。

Nephrin是免疫球蛋白超家族的一种细胞黏附分子，主要由足细胞合成，近年来研究证实，Nephrin蛋白是足细胞裂隙膜关键分子之一，nephrin分子与蛋白尿及滤过屏障密切相关^[15-17]。Huh等^[18]研究表明膜性肾病患者的nephrin降低。Doublier等^[19]发现膜性肾病患者的nephrin与IgG免疫沉积物共同存在，膜性肾病模型大鼠出现蛋白尿与足细胞裂孔隔膜整体性的改变与nephrin从肌动蛋白细胞骨架分离有关。庄永泽等^[20]观察采用免疫组化方法检测35例HBV相关性膜性肾病患者肾组织nephrin的表达情况，结果显示HBV相关性膜性肾病早期足细胞即受损伤，肾组织nephrin表达明显下调，并认为HBV相关性膜性肾病中nephrin表达下调与蛋白尿的产生密切相关。Podocin是足细胞裂孔隔膜复合体重要组成成分，并通过激活瞬时受体电位阳离子通道蛋白参与细胞信号传导，维持裂孔隔膜的结构和功能的完整性，与蛋白尿产生密切相关，大鼠膜性肾病和人类膜性肾病均发现podocin mRNA水平下降及出现蛋白尿^[21-23]。以上研究提示nephfin与podocin表达降低以及两者之间发生分离在膜性肾病蛋白尿的形成中起作用^[24-27]。实验采用RT-PCR检测结果显示，模型组大鼠肾组织nephrin和podocin mRNA表达量低于对照组，提示nephfin、podocin表达减少可能使足细胞裂孔膜结构的完整性受损，肾小球滤过屏障破坏，导致蛋白尿。近年研究证实肾小球足细胞裂孔膜蛋白nephrin以及podocin是构成肾小球对血浆成分选择性滤过的主要和最后屏障^[28]，膜性肾病大鼠早期足细胞裂孔膜蛋白表达降低可能与其合成减少和(或)丢失增加有关。nephrin和podocin共同保持足细胞裂孔膜结构和功能的完整，nephrin和podocin表达的减少及分布异常可能与蛋白尿发生及蛋白尿程度有关^[29-30]，但其损伤的始动因素以及是否还有其他因素参与仍需进一步探讨。

综上所述，该模型的鉴定综合了生化指标和病理特点，不仅观察到模型组大鼠出现了明显的蛋白尿，而且血清胆固醇、三酰甘油水平显著升高，血清白蛋白水平显著降低；肾脏病理切片也显示出不同程度肾小管扩张，肾小球基底膜增厚，系膜细胞及基质增生等，符合膜性肾病病变特征^[31-32]，另外实验检测出肾组织nephrin和podocin mRNA表达量降低，可能是蛋白尿产生的重要机制，为研究膜性肾病的发病机制和药物干预提供重要依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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