补阳还五汤对脑出血模型大鼠脑组织CXCR4-PI3K自噬信号传导通路及Beclin-1的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.006

中国组织工程研究 ›› 2016, Vol. 20 ›› Issue (27): 3992-3998.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.006

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补阳还五汤对脑出血模型大鼠脑组织CXCR4-PI3K自噬信号传导通路及Beclin-1的影响

仇志富¹，吴晓光¹，祖炳学²，时召平³，苗惠⁴，李蒙蒙⁴

1河北省中医药抗痴呆重点研究室/承德医学院基础医学研究所，河北省承德市 067000
2抚宁县第二人民医院，河北省秦皇岛市 066300
3承德市中医院药剂科，河北省承德市 067000
4承德医学院2012级本科，河北省承德市 067000

修回日期:2016-04-05 出版日期:2016-06-30 发布日期:2016-06-30
通讯作者: 吴晓光，硕士，副研究员，河北省中医药抗痴呆重点研究室/承德医学院基础医学研究所，河北省承德市 067000
作者简介:仇志富，男，1988年生，黑龙江省肇东市人，汉族，承德医学院在读硕士，主要从事中医药治疗脑病的基础研究。
基金资助:
河北省卫生厅课题基金(H2015401006)；河北省高等学校重点学科病理生理学项目资助(2013)

Effects of Buyang Huanwu Decoction on CXCR4-PI3K autophagy signal transduction pathway and Beclin-1 in a rat model of cerebral hemorrhage

Qiu Zhi-fu¹, Wu Xiao-guang¹, Zu Bing-xue², Shi Zhao-ping³, Miao Hui⁴, Li Meng-meng⁴

1Hebei Provincial Key Research Office of Traditional Chinese Medicine Against Dementia/Institute of Basic Medical Science of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei Province, China
2the Second People’s Hospital of Funing County, Qinhuangdao 066300, Hebei Province, China
3Department of Pharmacy, Chengde Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chengde 067000, Hebei Province, China
4Grade 2012 Undergraduate of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei Province, China

Revised:2016-04-05 Online:2016-06-30 Published:2016-06-30
Contact: Wu Xiao-guang, Master, Associate researcher, Hebei Provincial Key Research Office of Traditional Chinese Medicine Against Dementia/Institute of Basic Medical Science of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei Province, China
About author:Qiu Zhi-fu, Studying for master’s degree, Hebei Provincial Key Research Office of Traditional Chinese Medicine Against Dementia/Institute of Basic Medical Science of Chengde Medical College, Chengde 067000, Hebei Province, China
Supported by:
the Hebei Provincial Health Department Project, No. H2015401006; the Pathophysiology Project of Key Discipline in Universities of Hebei Province, No. 2013

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
自噬体标记蛋白Beclin-1：其参与了脑出血引起的的细胞凋亡变化，其发生的轻中度自噬对于脑出血起到了保护作用。Beclin-1调节机制中最主要的即是PI3K调节，与PI3K的磷酸化密切相关。
补阳还五汤：中华传统医学认为其具有补气活血、祛瘀通络之功效，可作为治疗气虚络瘀证之脑卒中后遗症的常用方药。大量研究表明补阳还五汤的作用机制广泛，其在改善血液流变、抗血栓形成、抗动脉粥样硬化、血管性脑病中降低兴奋性氨基酸毒性、抑制细胞凋亡、抑制自由基的产生及抗脂质过氧化等方面发挥着重要作用。

摘要
背景：补阳还五汤是治疗脑出血的临床常用药，前期研究已发现其出色的神经保护作用，能够高效的抑制神经细胞凋亡。自噬活动与神经细胞凋亡关系密切，CXCR4-PI3K自噬信号传导通路在少许的临床常用药中已得以验证，然而关于补阳还五汤对其影响却知之甚少；同时对于Beclin-1在补阳还五汤神经保护的研究中尚未见报道。
目的：探究补阳还五汤对脑出血大鼠脑组织CXCR4-PI3K自噬信号传导通路与Beclin-1的影响及其相关机制。
方法：按照Rosenberg法复制脑出血大鼠模型，以补阳还五汤灌胃给药，采用Western blot法检测Beclin-1蛋白，免疫组化方法检测PI3K、AKT、基质细胞衍生因子1、CXCR-4蛋白表达，TUNEL法检测细胞凋亡情况。
结果与结论：①补阳还五汤灌胃给药后，能够减轻脑出血大鼠神经细胞凋亡数量，在脑出血发生后几小时上调Beclin-1、PI3K、AKT、基质细胞衍生因子1、CXCR-4等蛋白的表达，发挥脑保护效果；②补阳还五汤能够激活CXCR4-PI3K自噬轴信号传导通路，既能够激发细胞自噬，又能够调控细胞自噬状态，实现抑制细胞凋亡的脑保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程
ORCID: 0000-0002-6307-4889(仇志富)

关键词: 实验动物, 神经损伤与修复动物模型, 补阳还五汤, 脑出血模型, PI3K/AKT, 基质细胞衍生因子1/CXCR4, Beclin-1, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Buyang Huanwu Decoction is commonly used in clinical medicine in treatment of intracerebral hemorrhage. Previous studies have been found that it has excellent neuroprotective effect, can efficiently inhibit the apoptosis of nerve cells. Autophagic activity is closely related to apoptosis of nerve cells. CXCR4-PI3K autophagy signaling pathway has been verified in clinic. However, the effect of Buyang Huanwu Decoction is poorly understood. There is no study on Beclin-1 in the neuroprotective studies of Buyang Huanwu Decoction.
OBJECTIVE: To explore the effects of Buyang Huanwu Decoction on CXCR4-PI3K autophagy signaling pathway and Beclin-1 in rats with cerebral hemorrhage and related mechanisms.
METHODS: According to Rosenberg method, a rat model of cerebral hemorrhage was replicated and intragastrically administered Buyang Huanwu Decoction. Western blot assay was used to measure Beclin-1 protein. Immunohistochemical method was utilized to detect the expression of PI3K, AKT, stromal cell derived factor 1 and CXCR-4 protein. TUNEL assay was applied to identify apoptosis.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After administration, Buyang Huanwu Decoction could reduce the number of neuronal apoptosis in rats with intracerebral hemorrhage, up-regulate the expression of Beclin-1, PI3K, AKT, stromal cell derived factor 1, and CXCR-4 protein, and exert neuroprotective effect. (2) Buyang Huanwu Decoction could activate CXCR4-PI3K autophagy signal transduction pathway, both to stimulate autophagy and to regulate autophagy state, can inhibit apoptosis, and exert cerebral protective effect.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Models, Animal, Cerebral Hemorrhage, Apoptosis, Immunochemistry

中图分类号:

R318

仇志富，吴晓光，祖炳学，时召平，苗惠，李蒙蒙. 补阳还五汤对脑出血模型大鼠脑组织CXCR4-PI3K自噬信号传导通路及Beclin-1的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(27): 3992-3998.

Qiu Zhi-fu, Wu Xiao-guang, Zu Bing-xue, Shi Zhao-ping, Miao Hui, Li Meng-meng. Effects of Buyang Huanwu Decoction on CXCR4-PI3K autophagy signal transduction pathway and Beclin-1 in a rat model of cerebral hemorrhage[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(27): 3992-3998.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠72只，分成4组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 细胞凋亡数量的变化 用TUNEL法来计算脑组织的神经细胞凋亡数目，TUNEL阳性细胞形态学表现为胞体缩小，核固缩，染色质凝聚，呈棕黄色或黄褐色颗粒，出现明显的凋亡特征。假手术组大鼠大脑皮质内可见零星的、散在的、极为少量的TUNEL阳性细胞，TUNEL阳性细胞中大部分为神经元，少部分为胶质细胞和血管内皮细胞。模型组大鼠血肿周围皮质TUNEL阳性细胞较假手术组显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)；补阳还五汤组和银杏叶片组TUNEL阳性细胞较模型组显著减少，差异有显著性意义(P < 0.05)，详见表1。

2.3 PI3K、AKT蛋白阳性表达时吸光度的变化 PI3K蛋白和AKT蛋白均位于胞浆上，阳性表达呈棕黄色的物质沉积。与假手术组比较，模型组PI3K、AKT蛋白阳性表达显著增高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组比较，补阳还五汤组和银杏叶片组PI3K、AKT蛋白阳性表达显著增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，详见表2及图1，2。

2.4 Beclin-1的表达变化 Beclin-1条带结果显示，各组中的Beclin-1蛋白表达水平差异均有显著性意义(P < 0.05)。与假手术组相比，模型组的Beclin-1蛋白表达显著升高(P < 0.05)；与模型组相比，补阳还五汤组、银杏叶片组的Beclin-1蛋白表达均显著降低(P < 0.05)，详见表3。

2.5 基质细胞衍生因子1α、CXCR4阳性细胞表达变化

基质细胞衍生因子1α阳性细胞表达情况：假手术组中可见0-1个阳性表达，模型组及补阳还五汤组阳性细胞均高于假手术组，且补阳还五汤组阳性细胞数目高于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)，详见表4。

CXCR4阳性细胞表达情况：假手术组可见0-1个阳性表达，模型组及补阳还五汤组阳性细胞均高于假手术组，且补阳还五汤组阳性细胞数目高于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)，详见表4。

参考文献

[1] 范芳芳,霍勇.高血压疾病防治的中国特点[J]. 中国实用内科杂志,2015,35(4):276-281.
[2] 李萍,赵树明,胡亚男,等. 脑出血发病机制研究进展[J]. 中华老年心脑血管病杂志,2015,17(2):214-215.
[3] 关雪莲,侯丽淳,毕胜,等. 大鼠脑出血周边组织脑水含量、细胞凋亡和Bax表达的变化及粒细胞集落刺激因子的影响[J].中风与神经疾病杂志,2015,32(4):328-331.
[4] Tan CC, Yu JT, Tan MS, et al. Autophagy in aging and neurodegenerative diseases:implications for pathogenesis and therapy. Neurobiol Aging. 2013; 12(7):369-373.
[5] 张创杰,张连峰,周琳.自噬相关蛋白Beclin1、LC3和P62在进展期胰腺癌中的表达及临床意义[J]. 世界华人消化杂志,2015,35(2):318-323.
[6] Datan E, Shirazian A, Benjamin S, et al. mTOR/p70S6K signaling distinguishes routine, maintenance-level autophagy from autophagic cell death during influenza A infection. Virology. 2014;7(6):452-453.
[7] 李俊,刘晓渝,江歌丽,等.自噬相关基因在乳腺癌ET方案新辅助化疗疗效预测中的作用[J].重庆医学, 2015,44 (3):337-339.
[8] Yu YB, Duan JC, Yu Y, et al. Silica nanoparticles induce autophagy and autophagic cell death in HepG2 cells triggered by reactive oxygen species. J Hazard Mat. 2014;8(12):252-257.
[9] 黄凤媛,李菲,曾飞剑,等.自噬基因Beclin1启动子细胞自噬模型的建立[J].广州中医药大学学报,2015,32(2): 325-330.
[10] 张雨晴,张丽慧,魏尔清,等.Beclin-1在凋亡和自噬中的调节作用[J]. 中国生物化学与分子生物学报,2015,31(4): 331-338.
[11] 秦永刚,李晨旭,李雷, 等.自噬在镉致大鼠肾脏损伤中的作用[J]. 吉林大学学报(医学版),2015,41(2):213-217.
[12] 张雨晴,张丽慧,魏尔清, 等. Beclin 1在凋亡和自噬中的调节作用[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2015, 31(4):331-338.
[13] 黎柏源,白万胜,赵永博,等.基质衍生因子-1对大鼠脑出血后神经细胞凋亡的作用及其机制研究[J].中国现代医学杂志,2015,25(1):21-25.
[14] 李荣虎,于论,缪珀,等. 缺氧缺血海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3的表达变化以及雷帕霉素对其表达的影响[J]. 中国当代儿科杂志,2015,16(4):400-404.
[15] Yu AP, Pei XM, Sin TK,et al. [D-Lys3]-GHRP-6 exhibits pro-autophagic effects on skeletal muscle. Mol Cell Endocrinol. 2015;401:155-164.
[16] 张雅丽,崔丽艳,杨硕,等.自噬对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及机制[J]. 临床与实验病理学杂志, 2015,31(4): 431-435.
[17] 李琳,刘志婷,储利胜,等. 补阳还五汤诱导脑缺血后血管生成促进侧脑室下区神经母细胞迁移[J].中国中药杂志, 2015,40(2):298-302.
[18] 陈兴泳,汪银洲,雷惠新, 等.大鼠脑缺血再灌注后自噬的变化及灯盏生脉胶囊干预的影响[J]. 中国康复理论与实践,2015,7:773-779.
[19] 祝赫,黄海艳,张继平,等. 补阳还五汤预处理对脑缺血再灌注大鼠脑组织海马区Akt磷酸化水平的影响[J]. 中药新药与临床药理,2015,16(4):451-455.
[20] Rosenberg GA,Mun-Bryce S,Wesley M, et al. Collagenase-Induced Intracerebral hemorrhage in Rats. Stroke. 1990;21(5):801-807.
[21] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 1989;201(1):84-91.
[22] Stahl SM, Mackey J. Surveillance neuroimaging and neurologic examinations affect care for intracerebral hemorrhage. Neurology. 2014;82(13):e108-109.
[23] 陈家劲,王娟娟,张鹏.重楼活性单体pp-26抑制结肠肠癌SW620细胞增并诱导细胞凋亡[J]. 暨南大学学报, 2015, 36(2):265-269.
[24] 程明秀,赵宗江,田晨,等.补肾益髓生血法AA大鼠含药血清对BMSCs与BM-NCs共培养BMNCs增殖分化及SDF-1/CXCR4/PI3K/AKT信号通路的影响[J]. 中华中医药杂志,2015,30(8):2877-2881.
[25] 仇志富,颜勇,吴晓光.PI3K/Akt信号转导通路与神经细胞凋亡研究进展[J].中风与神经,2015,32(10):952-953.
[26] 仇志富,吴晓光,丁方. 姜黄素对大鼠脑缺血损伤时脑组织PI3K/AKT信号通路、caspase-3表达的影响[J]. 湖北民族学院学报(医学版),2015,32(3):7-9.
[27] 仇志富,吴晓光,孟杰,祖炳学,李蒙蒙,苗惠,时召平.补阳还五汤提取物灌胃对脑出血大鼠脑组织中PI3K、AKT
Caspase-3表达的影响[J].山东医药,2016,56(9):29-31.
[28] 庞月珊,罗勇,谢宸宸.胸腺素β4通过提高Akt磷酸化促进局灶脑缺血/再灌注大鼠大脑皮质eNOS和CD31表达[J]. 基础医学与临床,2014,34(7):921-926.
[29] 杨志峰,杨清玲,陈昌杰. 趋化因子SDF-1与受体CXCR4的研究进展[J]. 分子诊断与治疗杂志,2011,3(1):58-61.
[30] 李永东,葛智平,慧华,等.贝那普利对高血压患者内皮祖细胞凋亡及氧化应激的影响[J].中国心血管杂志, 2015, 20(1): 52-56.
[31] 赵蕾,张晓红,吴柏成,等.山楂叶总黄酮对脑缺血大鼠脑组织PI3K/Akt信号通路的影响[J].广东医学,2014,52(7): 982-984.
[32] Yang P,Wang G,Huo HJ,et al. SDF-1/CXCR4 signaling upregulates survivin to regulate human sacral cell cycle and transition via ERK and PI3K/AKT pathway. Med Oncol. 2015;321(96):3896-3899.
[33] 王远航,夏盛源,王芳,等.自噬通路中mTOR、Beclin1与肿瘤关系研究的最新进展[J]. 基因组学与应用生物学, 2015,8:1656-1662.
[34] 顾军,殷建,殷照阳,等. 缺血预处理通过增强自噬水平及抑制自噬性细胞死亡保护脊髓神经[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2015,60(11):1504-1510.
[35] 刘红权,王玉,郭立中,等.犀角地黄汤对脑缺血大鼠的自噬相关蛋白Atg-5、Be-clin-1表达的研究[J]. 南京中医药大学学报,2014,30(1):61-64.
[36] 王伟,朴美花,王艳姝, 等.异氟醚对Aβ25-35诱导大鼠PC12细胞自噬和凋亡的影响[J]. 吉林大学学报(医学版), 2014,40(1):49-54.
[37] 刘斌,孙静,张晋霞,等.自噬及自噬相关蛋白在帕金森病模型大鼠黑质纹状体中的表达及意义[J]. 中国神经免疫学和神经病学杂志,2014,21(3):187-191.
[38] 雒可夫,刘文佳,陈吉华,等.自噬对小鼠骨髓间充质干细胞干性标记基因的影响[J]. 牙体牙髓牙周病学杂志, 2014, 24(5):251-257.

引言

脑出血是脑卒中类型中极其重要的一种，全世界范围内每年约有两百万人发病，尤其在亚洲，脑出血占到了脑卒中的20%-30%，并且其死亡率极高(发病1个月内死亡率约占40%)，即使幸存也会发生较为严重的神经功能障碍^[1]，因而，脑出血的治疗可以说是当前临床脑卒中治疗中相当重要的类型，通常所说的脑出血即是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血^[2]。脑出血后脑组织神经细胞凋亡是其重要的病理生理过程，因而防治脑组织细胞凋亡是治疗脑出血的必要举措^[3]。

脑出血发生后，自噬活动在调节细胞凋亡过程中的重要作用不容忽视。所谓自噬即是指细胞利用溶酶体途径来实现过多或衰亡的细胞器及损伤蛋白的降解现象^[4-5]。正常脑组织中自噬含量很少，但是在出血性脑损伤中，自噬现象显著增强，自噬途径的激活可以作为脑损伤早期的一种潜在保护机制。各种组织细胞中或多或少的可以见到自噬现象，其作为真核生物体内广泛存在的、信号通路保守的生物学行为，在清除长寿命蛋白，异常聚集的蛋白及老化的细胞器方面发挥着重要的作用^[6-7]。当细胞缺乏能量时，可以通过自噬降解的部分氨基酸及小分子来重新利用进入到细胞结构的再循环之中，该自噬效应可以有益于细胞存活。但是如果发生了自噬过度，则可以导致细胞死亡，这一过度自噬也是许多脑损伤疾病产生的机制之一^[8-9]。

已有研究发现，自噬体的标记蛋白Beclin-1参与了脑出血引起的的细胞凋亡变化，其发生的轻中度自噬对于脑出血起到了保护作用^[10-11]；而基质细胞衍生因子1/CXCR4生物学信号传导通路不仅属于脑出血后神经修复的的重要通路，也是属于自噬活动的一种，二者均在脑出血后的细胞凋亡与神经修复中起到了积极的作用^[12-13]。Beclin-1调节机制中最主要的即是PI3K调节，与PI3K的磷酸化密切相关。基质细胞衍生因子1/CXCR4生物学轴在被激活的同时，又激活了CXCR4-PI3K自噬信号传导通路，从而来通过自噬调节进而实现脑保护作用的。由于PI3K磷酸化后参与的最重要信号通路即为PI3K/AKT信号转导通路，提示PI3K/AKT信号转导通路与自噬活动密不可分，其可与Beclin-1、基质细胞衍生因子1/CXCR4生物学轴通过复杂联系产生的CXCR4-PI3K自噬轴信号传导通路而实现脑保护作用^[14-15]。

补阳还五汤作为临床上常用的脑出血治疗药物，大量研究表明补阳还五汤的作用机制广泛，其在改善血液流变、抗血栓形成、抗动脉粥样硬化、血管性脑病中降低兴奋性氨基酸毒性、抑制细胞凋亡、抑制自由基的产生及抗脂质过氧化等方面发挥着重要作用^[16-19]。但是补阳还五汤对CXCR4-PI3K信号传导通路和Beclin-1的影响却鲜有报道，由于其疗效之卓越，作用之广泛，推测其亦会对CXCR4-PI3K信号传导通路和Beclin-1产生生物学作用。

实验以免疫组化方法检测脑出血大鼠脑组织中PI3K、AKT、基质细胞衍生因子1、CXCR-4蛋白变化，TUNEL法检测细胞凋亡的变化，Western blot法检测自噬标志蛋白Beclin-1的变化，以此来探究其对脑出血大鼠脑组织细胞凋亡、Beclin-1蛋白、PI3K/AKT通路及基质细胞衍生因子1/CXCR4通路的影响，分析其脑保护机制与CXCR4-PI3K自噬信号传导通路的相关性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

材料方法

1.1 实验材料 随机对照动物实验，于2015年3至6月在承德医学院动物房和基础所完成。

实验试剂及仪器：银杏叶片，双鹤药业有限公司；PI3K、AKT、基质细胞衍生因子1、CXCR4兔抗大鼠多克隆免疫组化试剂盒，上海雅吉生物科技有限公司；Beclin-1一抗，上海购自瑞齐生物科技有限公司；TUNEL凋亡检测试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；显微镜，上光中恒公司；荧光显微镜，上光一厂；离心机，江苏赛德力；电泳仪，北京六一生物科技有限公司。

补阳还五汤：由生黄芪120 g、当归尾6 g、赤芍 4.5 g、川芎4.5 g、干地龙3 g、桃仁3 g、红花3 g组成，承德大药房提供，4 ℃冰箱保存。

1.2 实验动物 选择成年健康清洁级雄性SD大鼠72只，体质量280-320 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。大鼠称体质量编号后按随机数字表法分组，假手术组、模型组、补阳还五汤组、银杏叶片组各18只。每组中6只用于检测PI3K、AKT蛋白，6只用于检测基质细胞衍生因子1、CXCR4、Beclin-1蛋白，6只用于检测细胞凋亡变化。

1.3 造模方法

脑出血大鼠模型制备：采用Rosenberg法进行脑出血大鼠模型的制备^[20]，以10%水合氯醛(400 mg/kg，腹腔注射)麻醉大鼠后，于立体仪上固定，于头部正中行纵行切口，将大鼠骨膜剥离，使其冠状缝和前囟裸露。在前囟之前约2.0 mm、中线右侧约3.0 mm处钻一约 1.0 mm直径的小孔。以微量注射器从股动脉抽取适量的血液，借助立体定向仪沿钻孔垂直进针6.0 mm左右，缓缓注血80 L，留针10 min后撤针，以消毒针缝合切口。模型组、补阳还五汤组、银杏叶片组均造模，假手术组仅仅裸露颈总动脉、神经。

脑出血大鼠模型造模成功的检测标准：以模型大鼠清醒后出现同侧Horner征作为脑出血大鼠模型制备成功的标准，即没有方向性的自主运动、提尾时向右侧旋转、会自行向右转圈、右前肢发生瘫痪或者右前肢内收、腕会屈曲、曲头朝向右侧背部。

1.4 药物干预 给药途径为灌胃给药，从造模后第2天起，补阳还五汤组、银杏叶片组灌胃给药连续干预35 d，药量分别为26 g/(kg•d)和3.5 mg/(kg•d)(均按人和大鼠间体表面积折算的2倍剂量给药)，假手术组及模型组给予生理盐水。

1.5 指标测定 在最后给药的4 h之后，大鼠以乙醚麻醉断头处理，选取视交叉至漏斗部之间的脑组织，10%CH₃CHO置于4 ℃冰箱固定48 h，石蜡包埋，冠状切片5 μm厚度，常规脱蜡、乙醇浸水。Western blot法检测Beclin-1蛋白，免疫组化方法检测PI3K、AKT、基质细胞衍生因子1、CXCR-4蛋白水平，TUNEL法检测细胞凋亡的变化。

1.6 主要观察指标 ①显微镜下观察PI3K、AKT、基质细胞衍生因子1、CXCR-4蛋白阳性表达变化及阳性细胞吸光度变化等；②荧光显微镜下观察细胞凋亡的变化；③观察Beclin-1条带结果变化。

1.7 统计学分析 应用SPSS 17.0统计系统进行数据分析，方差分析采用one-way ANOVA方法，先进行方差齐性检验，若方差齐行LSD检验，若方差不齐行Games-Howell检验。

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讨论

此次实验造模方法参照Rosenberg等^[20]所述的方法造模，以模型大鼠清醒后出现同侧Horner征作为脑出血大鼠模型制备成功的标准。造模方法规范、经典，模型十分稳定，接近人类疾病模型，存在转化医学意义。

作为真核细胞降解和再循环胞质内容物的主要细胞保护途径——自噬，其维护细胞内环境稳态方面起到了重要的作用。Beclin-1作为酵母Atg6/Vps30基因的同源物之一，其能够与PI3K发生作用相互结合成复合物调控自噬体的形成。由此方面可见，Beclin-1蛋白对自噬调节起着相当突出的作用，能够间接的反映自噬活动的状态，可作为检测自噬活动的标记蛋白^[21-23]。与自噬密切相关的自噬相关蛋白Beclin-1、自噬相关通路基质细胞衍生因子1/CXCR4都在脑出血所致的细胞神经功能受损和神经细胞凋亡中发挥重要的生物效应，而二者交点的的重要信号通路即为PI3K/AKT信号转导通路，PI3K/AKT信号转导通路与基质细胞衍生因子1/CXCR4信号转导通路的激活都具有着各自的特点。PI3K具有脂类激酶活性的同时，又拥有蛋白激酶的活性。脑缺血发生后，机体本身可以释放出一些能够将具有酪氨酸激酶活性受体激活的物质，这类物质如：神经细胞生长因子、整合素等，受体经过其磷酸化以后会特异性的结合PI3K的调节亚基，从而将PI3K激活。PI3K激活后可以使细胞膜上的肌醇发生磷酸化，生成第二信使PI3K，Akt作为PI3K下游的效应分子，PI3K结合Akt的PH结构域，在既能够使Akt从细胞质向细胞膜转位的同时，又能够改变其构象，如此一来便可使Akt的Thr308位点发生磷酸化、Ser473位点发生磷酸化，使其由抑制状态变为激活状态。作为调节位点的Thr308和Ser473，其磷酸化作用的进行是一前一后、互相独立的^[24-25]，AKT活性的最终实现需要依赖Ser473的磷酸化，Akt磷酸化激活后即成为p-Akt，其可以衡量该通路的活化程度，通过参与多条信号转导途径来起到促进细胞增殖和阻止细胞凋亡发生的作用。Akt活化后控制凋亡的方式是通过直接将凋亡相关蛋白磷酸化或者间接改变、编码凋亡相关蛋白的基因表达水平来实现的，活化后的Akt，通过磷酸化作用将其下游靶蛋白Bad、Caspase、核因子κB等激活或抑制，实现调控多种生长因子来诱发细胞生长、促进细胞存活的生物学效应^[26-27]。

基质细胞衍生因子1/CXCR4信号轴是指趋化因子基质细胞衍生因子1结合其特异性受体CXCR4的N端^[28]，同时CXCR4和第二胞外环相互作用而形成的偶联分子对，后者和细胞间信号传导及细胞迁移息息相关，能够对CXCR4二聚体形成、空间构象内化发挥促进作用，且可以通过将与CXCR4偶联的G蛋白改变或激活等多重作用方式来实现各种信号转导通路的激活。如PI3K/Akt信号转导通路、ERK1/2信号转导通路、核因子κB通路等，从而影响细胞的趋化、运动、黏附、分泌、血管生成、生长等生物效应。基质细胞衍生因子1/CXCR4信号轴生物效应很广泛：促进血管、中枢神经系统祖细胞的迁移，参与血管重构；参与EPCS相关的生物学反应，如动员、迁移、归巢等，其广泛的生物效应在脑缺血疾病中越来越受到人们的重视^[29-31]。

研究发现，PI3K/AKT信号转导通路与Beclin-1、基质细胞衍生因子1/CXCR4信号轴有一定的相关性，其中PI3K的作用最为重要，其磷酸化后影响着自噬活动，其具有代表性的PI3K/AKT信号转导通路无疑是自噬活动的积极参与者^[32-35]。基质细胞衍生因子1/CXCR4生物学轴在脑出血损伤中，不仅表现出调控内源性祖细胞迁移、促进血管的新生、增强机体抗缺氧的能力来发挥抑制细胞凋亡，实现神经修复与脑保护的作用；更值得一提的是其还具有调控细胞自噬状态的功能，该功能在细胞凋亡调控方面的作用不言而喻。基质细胞衍生因子1/CXCR4信号轴与PI3K/AKT信号转导通路通过复杂过程形成CXCR4-PI3K自噬轴信号传导通路，CXCR4-PI3K自噬轴信号传导通路对细胞自噬具有调节作用，当CXCR4表达下调时，作为自噬启动因子的PI3KmRNA和蛋白表达也随之下调。基质细胞衍生因子1与CXCR4结合后能够促进G蛋白三聚体分离，形成GβGγ和Gai，两者均可以激活下游信号通道的重要节点分子PI3K。当CXCR4表达下调时，作为自噬启动因子的PI3K mRNA和蛋白表达也随之下调^[36-38]。总之，CXCR4-PI3K自噬轴信号传导通路既能够激发细胞自噬，又能够调控细胞自噬状态。补阳还五汤可通过对脑出血大鼠脑组织自噬活动产生影响来调节大鼠神经功能，其机制可能与补阳还五汤激活PI3K/AKT信号转导通路后，PI3K磷酸化导致静息状态的PI3K减少，而与其结合形成复合物的Beclin-1相应减少，上调了细胞自噬能力；CXCR4-与磷酸化后的PI3K结合形成CXCR4- PI3K自噬轴，影响着自噬活动。

补阳还五汤可通过对脑出血大鼠脑组织自噬活动产生影响来调节大鼠神经功能，其机制可能与补阳还五汤激活PI3K/AKT信号转导通路后，PI3K磷酸化导致静息状态的PI3K减少，而与其结合形成复合物的Beclin-1相应减少，上调了细胞自噬能力；CXCR4-与磷酸化后的PI3K结合形成CXCR4-PI3K自噬轴，影响着自噬活动。总之，通过对CXCR4-PI3K自噬轴的激活能够很好地治疗脑出血所产生的神经损伤，为治疗脑出血提供了新的思路，然而，CXCR4-PI3K自噬轴激活后对于脑出血所致脑水肿现象是否会有所缓解；是否还有更加高效激活CXCR4-PI3K自噬轴的药物存在仍然不得而知，需要今后进行更深层次的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

补阳还五汤对脑出血模型大鼠脑组织CXCR4-PI3K自噬信号传导通路及Beclin-1的影响

Effects of Buyang Huanwu Decoction on CXCR4-PI3K autophagy signal transduction pathway and Beclin-1 in a rat model of cerebral hemorrhage

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[1]	耿秋东, 葛海雅, 王和鸣, 李楠. 基于网络药理学探讨龟鹿二仙胶治疗骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1229-1236.
[2]	李时斌, 赖渝, 周毅, 廖建钊, 章晓云, 张璇. 激素性股骨头坏死发病机制及相关信号通路的靶点效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(6): 935-941.
[3]	徐银琴, 史红美, 王光义. 通痹方热敷联合针刺治疗对退变椎间盘细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 713-718.
[4]	张雯雯, 金颂峰, 赵国梁, 宮丽鸿. 复方中药稳斑汤减少同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 723-728.
[5]	刘青, 万碧江. 针刀治疗胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 729-734.
[6]	范军朝, 陈勇, 宋俊杰. 七氟醚联合氙气预处理对脊髓缺血再灌注损伤模型大鼠的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3660-3665.
[7]	左振魁, 韩佳瑞, 计树灵, 贺璐璐. 银杏酮酯预处理减轻辐射所致模型小鼠的急性肠损伤[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3666-3671.
[8]	张亮, 马晓燕, 王佳虹. 肾衰饮调控慢性肾功能衰竭大鼠肾脏细胞凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3672-3677.
[9]	靖金鹏, 张玥, 刘效敏, 刘壹. 补阳还五汤预防骨科术后深静脉血栓形成的系统评价及试验序贯分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3267-3274.
[10]	陈辛玲, 王生兰. 细胞自噬过程、通路、调控及其与肺动脉高压的多重相关性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 311-316.
[11]	严秀蕊, 陶金, 梁雪云. 人胎盘间充质干细胞来源外泌体保护氧化应激损伤肺上皮细胞的机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 2994-2999.
[12]	赵宁, 于洪丹, 冯珍, 丁佳媛, 刘学政. 红景天苷抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1664-1669.
[13]	彭旭, 杨继滨, 尤奇, 金瑛, 张骏, 葛振, 邹刚, 江孔军, 刘毅. 金骨莲灌胃对兔骨关节炎模型软骨细胞凋亡相关蛋白表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1188-1194.
[14]	张方新, 康朋, 王起腾, 张晓, 刘伟, 杨红涛, 艾尔肯•阿木冬. 腰椎肥厚黄韧带中细胞凋亡及凋亡因子caspase-3、fas、p53的表达[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1195-1199.
[15]	黄永明, 黄启明, 刘焱杰, 王竣, 曹振武, 田振江, 陈博鉴, 麦秀钧, 冯恩辉. TDP43慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞与软骨细胞共培养后的增殖与凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1016-1022.