软骨细胞膜蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白1低表达的意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.006

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文题释义：

shRNA：short hairpin RNA 的缩写，短发夹RNA，包括两个短反向重复序列，利用细胞内的Dicer酶，生成相应的干扰RNA，干扰RNA合成。

NF-kB：NF-κB为一个转录因子蛋白家族，NF-κB信号通路在细胞因子诱导的基因表达中起关键性的调控作用。

背景：肿瘤坏死因子α是骨关节炎主要致病因子，主要通过激活核因子KB信号通路活性实现软骨细胞炎症反应。细胞膜蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白1参与调节多种细胞因子诱导的细胞炎症反应。
目的：观察大鼠软骨细胞膜蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白1对炎症因子肿瘤坏死因子α反应中的作用。
方法：将慢病毒包装的低密度脂蛋白受体相关蛋白1-shRNA转染原代培养的软骨细胞。转染3 d后用核因子κB磷酸化抑制剂Bay 11-7082(10 μmol/L)预处理的阴性对照组和shLRP1组软骨细胞30 min，肿瘤坏死因子α(30 μg/L)分别作用两组软骨细胞30 min，收集总蛋白并进入后续Western blot的实验，测定相关胞内信号蛋白表达情况, 收集总RNA并行Real-time PCR实验检测相关RNA表达情况。收集肿瘤坏死因子α(30 μg/L)作用软骨细胞12 h的培养基行ELISA检测基质金属蛋白酶13表达水平。
结果与结论：①慢病毒介导敲低低密度脂蛋白受体相关蛋白1后的软骨细胞肿瘤坏死因子α受体1表达增加；②肿瘤坏死因子α作用后的shLRP1组软骨细胞核因子kB通路较对照组均有明显激活，诱导型一氧化氮合酶表达增加；③ELISA检测提示shLRP1组胞外基质金属蛋白酶13浓度增加；④结果提示，软骨细胞膜蛋白低密度脂蛋白受体相关蛋白1低表达对炎症因子肿瘤坏死因子α的作用表现为激活核因子kB通路和提高骨关节炎相关的蛋白基质金属蛋白酶13表达以及易凋亡。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-8538-3658(杨二平)

关键词: 组织构建, 软骨细胞, 低密度脂蛋白受体相关蛋白1, 肿瘤坏死因子α, 慢病毒, NF-kB

Abstract:

BACKGROUND: Tumor necrosis factor α, as a pathogenic factor, induces the inflammatory reaction mainly via the activation of the nuclear factor kappa B signaling pathway. Low density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP1) is involved in the regulation of the inflammatory reaction induced by cytokines.

OBJECTIVE: To study the effect of knockdown of LRP1 on tumor necrosis factor α-induced inflammatory reaction.

METHODS: Primary cultured rat chondrocytes were transfected with lentivirus-mediated RNA interference to knockdown LRP1 gene. Three days after lentivirus transfection, chondrocytes were pretreated with Bay 11-7082 (10 μmol/L) for 30 minutes prior to the addition of tumor necrosis factor α (30 μg/L) for 30 minutes. Signaling protein and mRNA expressions in chondrocytes were detected by western blot assay and real-time PCR analysis, respectively. Chondrocytes were pretreated with or not Bay 11-7082 (10 μmol/L) 30 minutes prior to the addition of tumor necrosis factor α (30 μg/L) for 12 hours after starvation in DMEM for overnight, and the culture medium was collected for ELISA determination of matrix metalloproteinase 13 level.

RESULTS AND CONCLUSION: Tumor necrosis factor α receptor 1 expression was upregulated in chondrocytes after lentivirus-induced knockdown of LRP1. Increased expression of inducible nitric oxide synthase and activation of the nuclear factor kappa B signaling pathway were found after the addition of tumor necrosis factor α in shLRP1 group. Moreover, increased level of matrix metalloproteinase 13 was determined by ELISA. Taken together, knockdown of LRP1 up-regulates the expression of tumor necrosis factor α-induced inducible nitric oxide synthase and matrix metalloproteinase 13 through the activation of the nuclear factor kappa B signaling pathway.
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Key words: Chondrocytes, Tumor Necrosis Factor-alpha, NF-kappa B, Tissue Engineering

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图/表（结果） 4

2.1 软骨细胞IKK–NF-κB信号通路相关蛋白表达两组细胞在无肿瘤坏死因子α作用时Bay 11-7082预处理两组细胞后IκB，核因子κB-p65的表达无明显差异。在Bay 11-7082预处理两组细胞后经肿瘤坏死因子α作用30 min时核因子κB-p65的表达，两组比较差异有显著性意义，IκB的表达在shLRP1+肿瘤坏死因子α组中几乎完全降解，核因子κB-p65磷酸化明显增强(见图1)。

2.2 诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α受体1表达 shLRP1组较对照组和阴性对照组的肿瘤坏死因子α受体1表达明显增加，对照+肿瘤坏死因子α组和shLRP1+肿瘤坏死因子α组的软骨细胞诱导型一氧化氮合酶的表达均有增加，且Bay11-7082能明显抑制LRP1干扰后的软骨细胞诱导型一氧化氮合酶的表达，shLRP1+肿瘤坏死因子α组较对照+肿瘤坏死因子α组和shLRP1+肿瘤坏死因子α+Bay11-7082组的诱导型一氧化氮合酶的mRNA表达明显增加(P < 0.05，见图2。

2.3 软骨细胞LRP1干扰后软骨细胞外基质金属蛋白酶13量的变化 ELISA检测到对照+肿瘤坏死因子α组和shLRP1+肿瘤坏死因子α组的软骨细胞外基质金属蛋白酶13的量均有增加，而shLRP1 +肿瘤坏死因子α组基质金属蛋白酶13的量较其他3组明显增加，差异有显著性意义，Bay11-7082能抑制这一变化，且抑制有显著差异(P < 0.05)，见图3。

2.4 软骨细胞LRP1干扰后在肿瘤坏死因子α作用下相关凋亡蛋白表达 Western Blot灰度值比分析显示：对照组和shLRP1组在肿瘤坏死因子α作用前P-Akt/ Akt灰度值比差异有显著性意义(P < 0.05)。两组细胞在肿瘤坏死因子α作用后，shLRP1+肿瘤坏死因子α组P-Akt/ Akt灰度值明显低于对照+肿瘤坏死因子α组(P < 0.05)。对照组和shLRP1组的Bcl-2/Bax灰度值比差异有显著性意义 (P < 0.05)。而shLRP1+肿瘤坏死因子α组Bcl-2/Bax灰度值比明显低于对照+肿瘤坏死因子α组(P < 0.05)，见图4。

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引言

骨关节炎是一种慢性退行性骨关节疾病，其病因及发病机制尚未完全明确。研究显示白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α 作用于软骨细胞干扰软骨细胞合成和分解代谢平衡，使分解代谢增强，软骨细胞分泌多种基质降解酶^[1]。与骨关节炎相关的炎症递质中，肿瘤坏死因子α被认为是软骨退变关键的炎性调节因子，肿瘤坏死因子α促进滑膜细胞和软骨细胞表达炎性因子和趋化因子并维持局部炎性因子。

最近研究表明低密度脂蛋白受体相关蛋白(The lipoprotein receptor low-density lipoprotein receptor- related protein，LRP)除了参与脂质代谢外，还参与调节炎症反应^[2-3]。因此，LRP被认为有可能参与调节骨关节炎发病进程。

骨关节炎的滑膜组织产生促炎性细胞因子和其他炎性介质，其中一些炎性因子通过滑液扩散到关节软骨表面，激活软骨细胞产生分解因子从而破坏软骨。多种酶降解骨关节炎的软骨基质发挥重要作用，这些酶包括金属基质蛋白酶和去整合素金属蛋白酶(ADAMTS)^[4-5]。

分子信号通路对关节和骨的发育起着基础作用，近10年来得到广泛研究，有可能成为潜在治疗方向。软骨细胞信号通路包括Wnt/β-catenin，HIF-1α/2α通路，转化生长因子β/骨形态发生蛋白通路，核因子κB/细胞因子通路。目前研究表明软骨病理变化涉及到这些信号通路调节，越来越多的研究表明这些不同信号通路之间存在交叉调节，并且软骨细胞功能改变依赖于这些通路信号蛋白活性平衡综合调节结果，包括前炎性细胞因子、过度压力刺激，细胞外基质降解成分在内的多种压力相关的刺激因子激活转录因子NF-κB。软骨细胞通过核因子κB通路表达多种炎症相关基因，如基质金属蛋白酶1，基质金属蛋白酶13，一氧化氮合成酶，白细胞介素1，白细胞介素6，肿瘤坏死因子α，和去整合素基质金属蛋白酶4，5。

骨关节炎软骨退变另一种表现是软骨细胞凋亡，软骨细胞凋亡对软骨退变过程中发挥多大作用仍未明确。肿瘤坏死因子α作为软骨退变的关键调节因子调节调高滑膜细胞和软骨细胞的细胞因子和趋化因子表达，以维持局部炎性因子持续表达。慢病毒载体携带的shRNA目的序列可以有效地通过RNA干扰机制被整合到宿主细胞内基因组中，从而实现目的序列持久地表达。慢病毒也能有效地转染多种细胞达到基因表达的有效调控。对于一些如原代细胞、干细胞和静止细胞，慢病毒也能实现转染将携带的shRNA转染到宿主细胞，目的序列整合到宿主基因组中，实现长久稳定的基因表达调控效应。
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材料方法

1.1 设计分组对照观察。

1.2 时间及地点实验于2014年6至11月在武汉大学医学院完成。

1.3 材料

实验动物：1周龄SD大鼠购自武汉大学动物实验中心。

软骨细胞膜蛋白LRP1表达实验用试剂：
试剂	来源
抗大鼠 LRP1单克隆抗体	美国Epitomics公司
GAPDH、IkB磷酸化核因子κB -p65/RelA单克隆抗体	美国赛信通公司
AKT，P-AKT，Bax，Bcl-2，caspase3	购自美国Bioworld
二抗 horseradish peroxidase (HRP) conjugated抗兔IgG、抗山羊IgG抗体	武汉博士德公司
重组大鼠肿瘤坏死因子α	Peprotech公司
NF-κB磷酸化抑制剂(Bay 11-7082)	上海碧云天公司
(DMEM)/F12细胞培养基、胎牛血清	Gibco公司
大鼠基质金属蛋白酶13酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒	武汉伊莱瑞特公司

1.4 实验方法

1.4.1 原代软骨细胞培养大鼠原代细胞来自1周龄大鼠膝关节软骨，经过酶消化法获得，接种于含体积分数10%胎牛血清的(DMEM)/F12细胞培养基培养瓶，置于37 ℃、体积分数5%CO₂孵箱内进行细胞培养用培养至3×10⁹L^-1，细胞生长至约80%融合时传代。

1.4.2 目的基因LRP1靶向序列设计利用公用网站中提供的RNA干扰序列设计原则，并根据公开发布的文献提供的靶点序列验证RNA干扰序列有效性。目的靶位点序列：5’-GCA TTG GCG TGC AGC TTA A-3’，除了设计的 siRNA 靶点序列之外，也使用一些 RNA干扰实验中公认序列，比如siRNA 阴性对照Scramble 序列(5’-TTC TCC GAA CGT GTC ACG T-3’)作为实验对照组(Negative Control，NC)。以慢病毒为载体的shRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。

1.4.3 大鼠关节软骨细胞的转染大鼠原代软骨细胞在整个培养过程中，保持良好的细胞状态，选择第1传代细胞为转染细胞，计数目的细胞并接种于六孔板的大鼠软骨细胞生长密度为2.0×10⁸L^-1。8 h后观察细胞贴壁良好，根据接种前细胞的计数加入适量的病毒，MOI值为20。12 h后观察细胞状态，并更换新鲜培养基。感染3 d后荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况观察报告基因GFP的表达情况，根据转染效率，进入后续实验。

1.4.4 细胞因子诱导软骨细胞待6孔板中软骨细胞铺满后更换无血清培养基DMEM过夜，核因子κB磷酸化抑制剂(Bay 11-7082) (10 μmol/L)加入培养基中预处理 30 min后，肿瘤坏死因子α(30 μg/L)作用软骨细胞30 min收集细胞总蛋白监测相关信号蛋白变化。肿瘤坏死因子α(30 μg/L)作用软骨细胞12 h提取总RNA供RT-PCR试验用，收集培养基供Elisa实验监测软骨细胞分泌蛋白变化。

1.4.5 Real-time PCR检测采用Real-time PCR检测肿瘤坏死因子α作用对照组和shLRP1干扰后的软骨细胞后诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α受体1mRNA表达。按??CT法计算表达倍数，以对照组肿瘤坏死因子α受体1和诱导型一氧化氮合酶的扩增倍数表达为基线，其他各细胞组相对扩增倍数比。

引物序列：
GAPDH	上游引物：5’-ACA GCA ACA GGG TGG TGG AC-3’，下游引物：5’- TTT GAG GGT GCA GCG AAC TT -3’，
诱导型一氧化氮合酶	上游引物：5’-AAA ATG GTT TCC CCC AGT TC-3’，下游引物：5‘-GCT TGT CTC TGG GTC CTC TG-3’，
肿瘤坏死因子α受体1	上游引物：5‘- TCA AAG AGG TGG AGG GTG AAG GA -3’，下游引物：5‘-AGA CAG GAT GAC TGA AGC GTG GG-3。

1.4.6 Western Blot 检测采用Western Blot 检测肿瘤坏死因子α作用对照组和LRP1干扰后的软骨细胞凋亡蛋白Akt，P-Akt，Caspase3，Bcl-2，Bax的表达，图像经过BandScan图像分析软件分析条带灰度值得出数据，并对数据进行统计学分析

1.5 主要观察指标 ①软骨细胞IKK-NF-κB信号通路相关蛋白表达。②诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α受体1表达。③软骨细胞LRP1干扰后软骨细胞外基质金属蛋白酶13量的变化。④软骨细胞LRP1干扰后在肿瘤坏死因子α作用下相关凋亡蛋白表达。

1.6 统计学分析计量实验数据以x(_)±s表示，采用SPSS 21.0统计软件进行方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP1)是结构相似但大于低密度脂蛋白受体蛋白家族中其他成员^[6]。LRP1参与识别和内吞脂质，而且能识别大量非脂质体，包括尿激酶和组织纤溶酶原激活物及相应抑制剂，参与不同生理过程^[7]。LRP1还可与多种配体结合，组成具有不同功能配体受体系统激发启动配体依赖性细胞信号通路。LRP1还可与其他细胞膜受体特异性结合组成新的受体系统可激发不同的信号通路反应^[8]。作为具有内吞作用的膜蛋白，LRP1也具有调节基质金属蛋白酶家族水平功能。胶原酶3受体为内吞基质金属蛋白酶13的膜受体，而LRP1通过胶原酶3受体实现调节基质金属蛋白酶13水平^[9]。

对于细胞因子刺激诱导反应，LRP1通过多种机制实现调节细胞信号通路，细胞生理和基因表达。调节细胞信号通路是其中主要的机制，LRP1竞争性地结合相关配体来激活其他受体信号蛋白并导致相关胞外炎性因子表达降低。相应地，炎性因子促进跨膜蛋白LRP1胞内多肽链(RIP)脱落释放，胞内多肽链的释放是炎症抑制反馈重要一步，可抑制炎症组织中炎症级联反应放大。这一抑制炎症反馈效应也可体现在巨噬细胞对炎症反应^[10]。

作者发现敲低LRP1时无任何外界刺激时肿瘤坏死因子α受体1RNA表达增加，这与以往文献报道一致^[11]。肿瘤坏死因子α受体1作为肿瘤坏死因子α重要受体将肿瘤坏死因子α的信号传导到细胞内，并激活NF-κB通路^[12]。通过调节肿瘤坏死因子α1受体表达， LRP1实现对肿瘤坏死因子α下游信号通路调节。肿瘤坏死因子α是主要的促炎性因子，其在骨关节炎患者的关节滑液的含量水平是增加，能通过不同信号通路诱导基质金属蛋白酶13的表达^[13-14]。本实验的结果提示LRP1敲低后的软骨细胞在肿瘤坏死因子α刺激后核因子kB-P65磷酸化水平增加，并伴有诱导型一氧化氮合酶和基质金属蛋白酶13的增加，肿瘤坏死因子α激活IKK–NF-kB 信号通路的效应可以被核因子κB 抑制剂抑制。LRP1通过降低细胞膜肿瘤坏死因子α受体的表达从而抑制NFKB信号通路及相关炎症介质释放如：一氧化氮合成酶和白细胞介素6，内吞清除胞外基质金属蛋白酶9，减轻炎性因子导致的神经性疼痛^[10]。通过对膝关节骨关节炎患者滑膜组织和关节液进行ELISA分析发现一氧化氮合成酶含量明显增加，在骨关节炎软骨组织和血清中同样发现大量的一氧化氮^[15]，提示一氧化氮在骨关节炎发病机制中发挥重要炎性调节因子，是关节损伤重要潜在因素^[16-17]。核因子kB信号通路也参与软骨细胞炎性反应和软骨细胞凋亡调节^[18]。低氧诱导因子(HIF)可激发调节核因子κB-p65信号通路产生慢性炎症反应以及应激反应，一氧化氮合成酶的增加可增加胞浆一氧化氮浓度，并由此激发NFkB信号通路和凋亡反应^[19-20]。上调凋亡蛋白Bax，Bcl-2表达伴随着一氧化氮合成酶增加^[21]，NFkB和一氧化氮合成酶可诱导凋亡蛋白Caspase-3，9表达和应激反应，提示一氧化氮合成酶可诱导凋亡反应^[22]。

LRP1敲低后的软骨细胞在肿瘤坏死因子α刺激后核因子kB-P65磷酸化水平增加，并伴软骨细胞合成分泌基质金属蛋白酶13的增加，且Bay-11-7082能抑制基质金属蛋白酶13的增加。实验结果提示LRP1能抑制肿瘤坏死因子α诱导的IKK–NF-kB信号通路，通过抑制IKK–NF-kB通路来实现抑制基质金属蛋白酶13的表达，肿瘤坏死因子α作用于软骨细胞通过激活NF-κB通路来提高基质金属蛋白酶13表达^[23]，骨关节炎软骨细胞炎症反应的NF-κB信号通路和一氧化氮合成酶表达增加均可诱导胞外基质金属蛋白酶13表达。而基质金属蛋白酶13能降解软骨细胞外Ⅱ型胶原酶从而崩解软骨组织。在骨关节炎软骨细胞NFKB转录因子的激活常激发多个压力相关炎性细胞因子的释放(包括肿瘤坏死因子α和白细胞介素1b)，从而导致软骨细胞胞外基质降解。核因子κB-p65的活性上调可导致软骨细胞多个分解基因(去整合素金属基质蛋白酶5，一氧化氮合成酶和金属基质蛋白酶13)表达增强，且可经肿瘤坏死因子受体途径诱导软骨凋亡^[24]。

既然多种类型细胞通过细胞膜TNFR1与肿瘤坏死因子α结合诱导激活核因子κB通路。激活核因子κB 通路不仅通过调高关键的抗凋亡蛋白(Bcl-2，Bcl-Xl，XIAP)表达来抑制凋亡^[25-26]，而且也有促凋亡作用^[27-28]。肿瘤坏死因子α通过直接方式和间接方式诱导软骨细胞凋亡，核因子κB通路和Bcl-2/ Bax通路是两个主要途径。本实验的结果提示LRP1低表达的软骨细胞易出现细胞死亡。LRP1低表达的软骨细胞增加bax和caspase-3活性，降低Akt 的磷酸化和Bcl-2表达。最有可能的原因是LRP1低表达的软骨细胞通过调高肿瘤坏死因子受体1来增强肿瘤坏死因子α诱导的凋亡反应。磷酸化的Akt是主要的抗凋亡蛋白^[29]，敲低LRP1后软骨细胞在肿瘤坏死因子α的作用下提高caspase-3和 Bax的表达，激活的caspase-3和Bax是重要的凋亡蛋白^[30-31]。Bcl 家族包括Bcl-2能阻止肿瘤坏死因子诱导的凋亡^[32]。Bcl-2和 Bax 是两个重要的调节因子来调节细胞对凋亡的易感性^[31]。LRP1低表达的软骨细胞降低Bcl-2(特别是Bcl-2/ Bax比值)，表明LRP1具有促细胞生存和抗凋亡作用。

LRP1其分子量巨大，含有多个功能亚基，通过目前基因高表达各种方法很难达到LRP1高表达满意效果，也是本研究的局限。但通过本研究，初步发现LRP1对软骨细胞具有保护作用，抑制肿瘤坏死因子α对软骨细胞的严重反应，为研究骨关节炎提供新的思路和方向。
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