抗凝血纳米壳聚糖微球的合成、表征及生物安全性评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.47.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：有研究显示，壳聚糖等天然多糖经磺化改性后具有类似肝素的抗凝功能，因磺酸化后的壳聚糖其形成的磺酸根基团与肝素的活性基团相似，具有良好的抗凝血性。
目的：制备具有抗凝血功能的纳米壳聚糖微球，检测其形态结构、理化性能及生物安全性。
方法：利用乳相法合成纳米壳聚糖微球，通过磺化反应合成磺酸化壳聚糖微球，通过透射电镜描述其形态特征，红外光谱观察其特异基团峰值变化。①凝血实验：分别将肝素、纳米壳聚糖微球及10，30，50 mg磺酸化壳聚糖微球加入SD大鼠血中，检测凝血指标。②溶血实验：分别将去离子水、生理盐水及10，30，50 g/L磺酸化壳聚糖微球浸提液加入兔2%红细胞悬液中，检测溶血率。③细胞毒性实验：分别采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基及10，30，50 g/L磺酸化壳聚糖微球的浸提液培养人脐静脉血管内皮细胞，72 h后检测细胞相对增殖率及毒性分级。
结果与结论：扫描电镜显示磺酸化壳聚糖微球具有良好的形态结构，粒径大小50 nm，红外图谱提示存在磺化取代。体外凝血实验表明磺酸化壳聚糖微球具有显著抗凝血作用，抗凝血效果呈剂量效应关系。磺酸化壳聚糖微球符合国标关于溶血率小于5%的安全标准，无致溶血性。细胞毒性实验表明磺酸化壳聚糖微球浸提液无明显细胞毒性，其生物安全性符合国家标准。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 纳米材料, 壳聚糖, 微载体, 磺酸化, 抗凝血, 生物安全性

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that chitosan and other natural polysaccharides have heparin-like anticoagulant function after sulfonated modification. Sulfonated chitosan has good anticoagulant property because the sulfonate group formed by sulfonated chitosan is similar with the active group of heparin.

OBJECTIVE: To prepare the anticoagulant chitosan nanoparticles and to detect its morphology, physical and chemical properties and biological security.

METHODS: Chitosan nanoparticles were synthesized by emulsion-chemical cross link. Sulfonated chitosan nanoparticles were synthesized by sulfonation reaction. Its morphology was described by transmission electron microscope. The peak-value change of its specific groups was observed by infrared spectroscopy. (1) Coagulation experiment: Heparin, chitosan nanoparticles and 10, 30 and 50 mg of sulfonated chitosan nanoparticles were added into the blood of Spraque-Dawley rats. The coagulation indicators were detected. (2) Hemolysis experiment: deionized water, physiological saline and 10, 30, 50 g/L sulfonated chitosan nanoparticles extracts were added into 2% red blood cell suspension of rabbits. The hemolysis rate was detected. (3) Cytotoxicity experiments: DMEM medium containing fetal bovine serum and 10, 30, 50 g/L sulfonated chitosan nanoparticle extracts were used to culture human umbilical vein endothelial cells. Cell relative growth rate and toxicity grading were detected after 72 hours.

RESULTS AND CONCLUSION: Scanning electron microscopy showed that sulfonated chitosan nanoparticles had good morphology, with a diameter of 50 nm. Infrared spectroscopy showed that the sulfonated replacement occurred. In vitro coagulation experiments showed that sulfonated chitosan nanoparticles had significant anticoagulant effects in a dose-dependent manner. Sulfonated chitosan nanoparticles meet the national safety standard for hemolysis rate of less than 5%, non-induced hemolysis property. Cytotoxicity assays showed that sulfonated chitosan nanoparticles extracts had no significant cytotoxicity, and its biological safety was in line with the national standards.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Chitosan, Nanostructures, Microspheres, Tissue Engineering

王子婧，刘朝阳，钱智勇，高德伟，郭希民. 抗凝血纳米壳聚糖微球的合成、表征及生物安全性评价[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(47): 7655-7659.

Wang Zi-jing, Liu Chao-yang, Qian Zhi-yong, Gao De-wei, Guo Xi-min. Anticoagulant chitosan nanoparticles: synthesis, characterization and biological safety[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(47): 7655-7659.

图/表（结果） 5

2.1 磺酸化壳聚糖微球的透射电镜形态磺酸化壳聚糖微球大小较为均匀，为纳米尺度，形态均匀呈圆形或类圆形，分散度较好，无团聚现象，见图1。

2.2 磺酸化壳聚糖微球的红外光谱检测红外光谱表征中，壳聚糖、纳米壳聚糖微球和磺酸化壳聚糖微球的曲线在3 290 cm^-¹的垂直谱带为 N-H 伸缩振动峰，说明纳米壳聚糖微球和磺酸化壳聚糖微球都有-NH₂存在；纳米壳聚糖微球比壳聚糖在1 649 cm^-¹和1 562 cm^-¹左右多出2个吸收峰，这两个峰分别是酰胺Ⅰ谱带和酰胺Ⅱ谱带，说明戊二醛与壳聚糖的氨基反应形成的是酰胺键；与纳米壳聚糖微球曲线比较，磺酸化壳聚糖微球曲线在1 200-1 250 cm^-¹处都出现强吸收峰，显示有-SO₃H 基团的 S=O的伸缩振动，而原有的壳聚糖在这个位置均未有峰出现，表明纳米壳聚糖微球已发生磺化取代，见图2。

2.3 磺酸化壳聚糖微载体的体外凝血实验不同质量的磺酸化壳聚糖微球对血液均有一定抗凝作用，质量增大其抗凝效果越强，呈一定剂量效应关系，当剂量为50 mg时，其抗凝效果与肝素钠相当，见表1。

2.4 磺酸化壳聚糖微球的溶血实验不同质量浓度磺酸化壳聚糖微球的溶血率均小于 5%，符合国标关于溶血率的安全标准，均无致溶血性，见表2。

2.5 磺酸化壳聚糖微球的细胞毒性实验从脐静脉血管内皮细胞的相对增殖率可以看到，细胞在不同质量浓度的磺酸化壳聚糖微球浸提液中生长情况良好，当其质量浓度为10 g/L时，细胞毒性级别为0级；当其质量浓度为30，50 g/L时，细胞毒性级别为1级，表明磺酸化微载体材料的浸提液无明显细胞毒性，见表3。

参考文献

[1] Bilati U,Allemann E,Doelker E.Strategic approaches for overcoming peptide and protein instability within biodegradable nano- and microparticles.Eur J Pharm Biopharm.2005;59(3):375-388.

[2] Huang G,Gao J,Hu ZB,et al.Controlled drug release from hydrogel nanoparticle networks.J Control Release.2004; 94(2-3):303-311.

[3] Bonian P,Petnova T,Manolova N,et al.pH-senstive hydrogels composed of chitosan and polyaerylamide: enzymatice degradation.J Bioact Compat Polym.2004;19:197-208.

[4] Chang KL,Tai MC,Cheng EH.Kinetics and products of the degradation of chitosan by hydrogen peroxide.J Agric Food Chem.2001;49(10):4845-4851.

[5] Vanfrvord PJ,Matthw HW,Desilva SP,et al.Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice.J Biomed Mater Res.2002;59(3):585-590.

[6] Rao SB,Shama CP.Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential.J Biomed Mater Res. 1997;34(1):21.

[7] Chou TC,Li CY,Lee AR,et al.Mechanism of inhibition of platelet aggregation by HCL-31D.Eur J Pharmacol.2000; 387(2):125-131.

[8] 尹刚,侯春林.浅析壳聚糖的止血作用及机理[J].生物骨科材料与临床研究,2009,6(4):18-23.

[9] Dodane V,Khan AM,Merwin JR.Efect of chitosan on epithelia permeability and structure.Int J Pharm.1999; 182(1):21-32.

[10] 王琰,李正荣,潘飞燕,等.纳米脂质体包裹胰岛素经Caco-2细胞转运的研究[J].中国药理学通报,2005,21(1):78-81.

[11] Fernandez UR,Calvo P,Remunan LC,et al.Enhancement of nasal absorption of insulin using chitosan nanoparticles.Pharm Res.1999;16(10):1576-1580.

[12] Mitra S,Caur U,Ghosh PC,et al.Tumor targeted delivery of encapsulated dextran -doxorubicin conjugate using chitosan nanoparticles as carrier.J Control Release. 2001;74(1-3): 317-323.

[13] 王斌.壳聚糖的硫酸/氯磺酸酯化[D].成都:西南石油大学,2004.

[14] 杨越冬.磺化6-羧基壳聚糖的制备、表征及血液相容性研究[D].天津:天津大学,2007.

[15] 蒋挺大.甲壳素[M].北京:化学工业出版社,2003:128.

[16] Amiji MM.Platelet adhesion and activation on an amphoteric chitosan derivative bearing sulfonate groups.Colloids Surf B Biointerfaces.1998;10(5):263-271.

[17] 罗华丽,臧剑甬,张秀娟.壳聚糖载药微球的制备和体外释放研究[J].河南科学,2011,29(1):20-24.

[18] 王世敏,许祖勋,傅晶.纳米材料制备技术[M].北京:化学工业出版社,2002:1-6.

[19] 许加超,肖英龙.壳聚糖硫酸醋在药物中的应用[J].海洋科学, 1996, 20(2):2-4.

[20] Baumann H,Faust V.Concepts for improved regioselective placement of O-sulfo, N-sulo, N-acetyl and N-carboxymethyl groups in chitosan derivatives.Carbohydrate Res. 2001; 331(1):43-44.

[21] 王声宇,张文清.壳聚糖硫酸酯的合成及其抑菌作用[J].功能高分子学报,2007,19(4): 440-442.

[22] 张虹.壳聚糖的改性及其抗凝血活性研究[D].安徽:安徽工程大学,2014.

引言

因纳米粒给药系统具有独特的药物保护作用及控释特性，日益受到关注^[1-4]。药物缓释和控释作用减低了药物毒性，提高了药物生物利用度及稳定性。随着纳米技术的发展，通过改变其大小并借助于载药靶向性，可使其通过特殊生物屏障而发挥作用。壳聚糖为甲壳素脱乙酰基后的碱性多糖聚合物，为天然高分子材料，具有好的生物相容性，无免疫原性。Vanfrvord等^[5]将壳聚糖多孔支架材料植入鼠背部和腹部，未观察到炎症反应和细胞免疫反应。壳聚糖降解产物为低分子壳寡糖和葡萄糖胺，可被人体完全吸收^[4]，并且有实验证明壳聚糖降解产生的低聚体、单体或低分子亚单位等小分子对人体有益^[5]。因此，壳聚糖被美国药物食品管理局(FDA)及欧洲共同政府(EC)批准生产，成为理想的药物载体材料。

由于壳聚糖分子表面氨基带有正电荷，在与血液接触后，可通过吸引红细胞表面带负电荷的神经氨酸残基来介导红细胞聚集，形成凝血块，而这一过程可以完全不依赖血小板和血清白蛋白而完成^[6]，且壳聚糖对血小板也有黏附和聚集作用^[7-8]。根据其特性，壳聚糖及其衍生物被用于制备止血材料，研究显示其具有较好的止血效果^[8]。现有研究将壳聚糖作为药物载体在体内应用主要通过胃肠道给药^[9-10]、鼻腔给药及入血抗肿瘤^[11-12]。通过黏膜给药时，其促凝血性不会对机体产生较大影响，主要利用其缓释和促进药物吸收等优势，而当壳聚糖作为药物载体入血应用时就存在了一定促凝血风险，有促进血栓形成的可能。

针对促凝血特性，壳聚糖等天然多糖经磺化改性后具有类似肝素的抗凝功能^[13]，通过对壳聚糖上2位氨基进行羧甲基，然后再磺化6位上的羟基，生成的产物经实验证明有良好的抗凝血性，并且与血液有良好的相容性，未见溶血现象，也不会造成血细胞损伤^[14]。磺酸化后壳聚糖形成的磺酸根基团与肝素的活性基团相似^[15]，具有良好的抗凝血性，消除了壳聚糖促凝血风险。同时Amiji^[16]通过体外实验证明，相比较于未改性前的壳聚糖，引入磺酸官能团的壳聚糖能显著提高血小板的含量，并且明显降低血小板的活化程度，显示出一定的抗血栓活性。因此，可以在壳聚糖微球的基础上对壳聚糖结构进行磺化改性，赋予其抗凝血、抗血栓特性，扩展壳聚糖微球的应用领域。

本课题根据壳聚糖纳米给药系统的优势及壳聚糖磺化改性后的抗凝特点，通过对相关文献制备工艺的借鉴与改良，以壳聚糖为原料，利用双乳相法制备一种具有抗凝血功能的药物载体，提高入血应用的安全性，载药同时防止形成血栓。
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材料方法

1.1 设计材料形貌观察与生物安全性评价实验。

1.2 时间及地点实验于2014年11月至2015年5月在解放军军事医学科学院实验室完成。

1.3 材料脐静脉血管内皮细胞系(HUVEC)由解放军军事医学科学院实验室惠赠。壳聚糖购自青岛海汇生物工程有限公司。

实验动物：SD大鼠30只，体质量350-450 g，雌雄各半，许可证号：SCXK(军)2012-0004；新西兰白兔25只，体质量2.0-2.5 kg，雌雄各半，许可证号：SCXK(京) 2012-0004，均购于解放军军事医学科学院实验动物中心。

抗凝血纳米壳聚糖微球实验的试剂与仪器：
试剂与仪器	来源
MTT	美国Sigma公司
DMEM培养基	美国Gibco Co.
戊二醛	分析纯，天津大茂化学试剂有限公司
氯磺酸	分析纯，格雷西亚化学科技有限公司
肝素钠注射液	上海第一生化药业有限公司
超净工作台(YJ -875)	苏州市净化设备公司
酶标分析仪	美国 Bio-RAD Model 550
8400S 傅里叶红外光谱仪	日本岛津
紫外分光光度计	苏州岛津公司
磁力加热搅拌器	山东甄城华鲁电热仪器有限公司
JEM-100CXⅡ透射电镜	日本电子

1.4 实验方法

纳米壳聚糖微球的构建：借鉴罗华丽等^[17]乳化法制备壳聚糖微球，具体做法如下：配置体积分数为2%的乙酸(CH₃COOH)溶液100 mL，将质量为2 g的壳聚糖粉末溶于其中，放置于磁力搅拌器上，室温下500 r/min均匀搅拌过夜，至完全溶解后备用。取100 mL液体石蜡，常温 1 000 r/min均匀搅拌下，分别加入表面活化剂Span80、Tween80搅拌10 min，以注射器缓慢滴加2%壳聚糖溶液 10 mL，常温搅拌乳化30 min后加入1 mL交联剂戊二醛进行交联。最后加入10 mL异丙醇分散，以20 000 r/min离心30 min。取沉淀物用石油醚、无水乙醇反复洗涤，减压干燥后得黄色纳米壳聚糖微球。

磺酸化壳聚糖微球的构建：称取1 g纳米壳聚糖微球和50 mL吡啶于三角烧瓶内，置于冰浴均匀磁力搅拌，以玻璃移液管缓慢滴加8 mL氯磺酸，控制反应体系的温度保持在4 ℃以下。滴加完毕后，保鲜膜封闭三角烧瓶，继续磺化反应4 h后，20 000 r/min离心30 min，收集磺酸化壳聚糖微球，乙醇溶液反复洗涤去除吡啶负压干燥后获得黄色粉末，置于干燥容器中保存。

磺酸化壳聚糖微球的透射电镜观察：取适量磺酸化壳聚糖微球，用去离子水分散均匀后滴在铺有碳膜的铜网上，待溶液晾干后，透射电子显微镜镜下观察纳米微球的形态并拍照。

磺酸化壳聚糖微球的红外光谱分析：取干燥后的壳聚糖、纳米壳聚糖微球、磺酸化壳聚糖微球样品各2 mg，分别与100 mg溴化钾放入研钵中研成超细粉末(样品与溴化钾的质量比为1∶50)，研磨均匀后制成复合凝胶溴化钾样本压片。使用傅里叶变换红外光谱仪检测样本光谱，扫描次数为20次，分辨率2 cm^-¹，扫描范围为4 000-500 cm^-¹，Origin9软件成图，观测特异性基团峰值变化。

磺酸化壳聚糖微球的体外凝血实验：将30只SD大鼠随机均分成6组，每只大鼠用负压采血管采集血样2 mL，其中壳聚糖微球组每个血样內加30 mg纳米壳聚糖微球，肝素钠组每个血样加50 U肝素钠，实验组分别加10，30，50 mg的磺酸化壳聚糖微球，混匀后，3 000 r/min离心5 min，取血清行凝血四项检测，评估凝血指标。

磺酸化壳聚糖微球溶血实验(分光光度法)：取25只新西兰兔，随机均分为5组，分别为阳性对照组(去离子水)、阴性对照组(生理盐水)、实验组(磺酸化壳聚糖微球浸提液10，30，50 g/L组)。采每只兔新鲜血液20 mL，分别放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中摇床100 r/min震摇10 min，除去纤维蛋白原，形成脱纤血液，加50 mL生理盐水摇匀，2 000 r/min离心20 min，除去上清，反复用生理盐水洗至上清液澄清，将所得红细胞用生理盐水配制成2%红细胞混悬液。

称取100，300，500 mg的磺酸化壳聚糖微球，分别溶于10 mL生理盐水形成悬液，于37 ℃摇床100 r/min过夜后，20 000 r/min离心取上清，制备浸提液。

分别取去离子水、生理盐水及磺酸化壳聚糖微球浸提液10 mL加入离心管中，每个样品加兔2%红细胞悬液 200 µL，37 ℃水浴60 min，1 000 r/min离心5 min，取上清在分光光度计545 nm处扫描，以蒸馏水为空白样本读取各组吸光度(A)。根据公式计算：溶血率(%)=(Dt-Dnc)/ (Dpc-Dnc)×100%。其中Dt为试验样品吸光度，Dnc为阴性对照吸光度，Dpc为阳性对照吸光度。Dnc吸光度不应大于0.03，Dpc吸光度值为0.8±0.3。当溶血率< 5%时，材料符合生物材料溶血实验要求；若溶血率> 5%，提示实验材料有溶血作用。

磺酸化壳聚糖微球细胞毒性实验：称取100，300， 500 mg磺酸化壳聚糖微球，分别加入10 mL DMEM培养基形成悬液，于37 ℃摇床100 r/min摇匀，4 h后20 000 r/min离心取上清，制备浸提液。

取对数期脐静脉血管内皮细胞，胰酶消化离心后重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁷ L^-¹，接种于96孔板，每孔加200 µL细胞悬液，设对照组为体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基培养，实验3组分别加等量含磺酸化壳聚糖微球浸提液的完全培养基，每组设5个平行样本。培养箱中常规培养72 h后，每孔加入20 µL MTT溶液，继续培养4 h后弃去孔内液体，加入150 µL DMSO，混匀后酶标仪592 nm波长下测吸光度(A值)，计算细胞相对增殖率，细胞相对增殖率(%)=实验组吸光值/对照组吸光值×100%。根据细胞相对增殖率判定毒性反应分级：当想相对增殖率≥100%时，为0级；在80%-99%之间为1级；在50%-79%之间为2级；在30%-49%之间为3级；在0-29%之间为4级。

1.5 主要观察指标磺酸化壳聚糖微球的物理学表征及溶血、凝血、细胞毒性等实验结果是否符合生物医学材料的相关标准和要求。

1.6 统计学分析数据用统计软件SPSS 12.0处理，数据均以x(_)±s表示，组间比较采用重复测量数据的F 检验和两样本均数t 检，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

因蛋白、多肽类药物(如生长因子、白细胞介素、胰岛素等)疗效好、不良反应低而被广泛应用，但相比于其他化学合成药物，这类药物又有易被降解、半衰期短和稳定性差等不足。因此，一种控制释放体系在医学上的研究和应用日益受到人们的重视。纳米粒纳米尺度多在 10-1 000 nm范围内，可分散在水中形成近似胶体的溶液。研究显示，当药物粒子的粒径在纳米尺度分布时，粒子的表面积和化学势将显著增大，产生新的治疗效应^[18]。而对纳米粒的研究不仅因为控释和缓释的优势，一个重要原因是纳米粒在特定的尺度下可减弱或消除血脑屏障及特殊生物屏障对药物转运的限制，尤其是与靶向技术相结合更发挥了药物在特殊部位的疗效。

本实验依据既往制备壳聚糖纳米微载体的方法，提高搅拌转速至900 r/min，控制壳聚糖微载体尺度在纳米级别，保证其均匀成球，成功制备出分散度好的纳米壳聚糖微球。常用磺化改性包括浓硫酸磺化^[19]、SO₂/SO₃磺化及氯磺酸磺化^[20-21]，当以浓硫酸作为磺化剂时，会产生少量的水，稀释浓硫酸，这就需要大量的浓硫酸保证体系中的酸浓度，同时，过量的酸对于后续处理工作影响非常大^[22]；以SO₂/SO₃作为磺化试剂较难得，较少应用，因此选择氯磺酸作为磺化剂，吡啶作为反应介质。通过磺化改性使壳聚糖氨基氧化为具有抗凝血活性的-SO₃H基团，从而具有与肝素钠相似的抗凝血活性，具有抗Xa活性。有研究用木瓜蛋白酶降解制备低分子壳聚糖，经氯磺酸-N，N-二甲基甲酰胺体系中反应获得不同分子量的磺化壳聚糖，通过体外抗凝血活性指标检测，并对其抗凝血机制作深入研究，结果表明磺化壳聚糖分子的抗凝血活性是通过肝素辅助因子Ⅱ介导的。但壳聚糖及衍生物与血液相互作用的机制十分复杂，抗凝血机制仍有许多不确定性。本实验在纳米微载药材料基础上增加了抗凝功能，扩展了载药材料在循环系统中的应用，通过红外光谱检测及体外凝血实验，从化学结构和抗凝血效果两方面证实这种抗凝血壳聚糖微球在结构上含有-SO₃H基团，具有显著的抗凝血效果，应用质量浓度50 g/L时，即可达到类似肝素钠的抗凝效果。

作为循环系统应用的载药材料，必须具有良好的血液相容性及组织相容性，材料的生物安全性是临床使用前必须考虑的问题。本实验采用溶血实验、细胞毒性实验初步评价这种载药材料的生物安全性。溶血实验是材料与血液直接接触时评价血液相容性的指标，一般认为当溶血实验显示有溶血倾向时，提示材料对红细胞有一定破坏作用，表明材料有血液毒性。本实验测得各质量浓度梯度实验组溶血率均小于5%，符合医用材料标准，表明该载药材料无致溶血性，有良好的血液相容性。细胞毒性实验是利用体外细胞培养方法来评价生物医学材料或其浸提液可滤出成分中急性细胞毒性的潜在性，以反映生物材料对机体内细胞是否具有细胞毒性的体外初筛实验。本实验结果表明，这种载药材料具有良好的细胞相容性。
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