补肾中药成分配伍对成骨细胞成骨活性及Smad4 mRNA表达的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.009

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (33): 5289-5294.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.009

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补肾中药成分配伍对成骨细胞成骨活性及Smad4 mRNA表达的影响

贾英民^1，2，李瑞玉³，武密山⁴，霍瑞楼²，李彬⁵，郭雅静⁶

1解放军北京军区总医院肾脏病科，北京市 100700； 2平乡县中西医结合医院，河北省邢台市 054500； 3邢台医学高等专科学校第二附属医院中西医结合研究所，河北省邢台市 054000； 4河北中医学院方剂教研室，河北省石家庄市 050090；5河北医科大学生化教研室，河北省石家庄市 050051； 6山西博爱医院检验科，山西省太原市 140100

出版日期:2015-08-13 发布日期:2015-08-13
通讯作者: 李瑞玉，教授，主任医师，邢台医学高等专科学校第二附属医院中西医结合研究所，河北省邢台市 054000
作者简介:贾英民，男，1981年生，河北省曲周县人，汉族，2009年河北医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事慢性肾脏病与骨代谢的中西医结合治疗的研究。

Compatibility of Chinese nourishing kidney herbs influences osteoblast activity and Smad4 mRNA expression

Jia Ying-min^{1, 2}, Li Rui-yu³, Wu Mi-shan⁴, Huo Rui-lou², Li Bin⁵, Guo Ya-jin⁶

1Department of Nephrology, Beijing Military General Hospital, Beijing 100700, China; 2Integrated Traditional and Western Medicine Hospital of Pingxiang, Xingtai 054500, Hebei Province, China; 3Institute for Integrated Traditional and Western Medicine, the Second Affiliated Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei Province, China; 4Department of Prescription, Hebei College of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050090, Hebei Province, China; 5Department of Biochemistry, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050051, Hebei Province, China; 6Shanxi Boai Hospital, Taiyuan 140100, Shanxi Province, China

Online:2015-08-13 Published:2015-08-13
Contact: Li Rui-yu, Professor, Chief physician, Institute for Integrated Traditional and Western Medicine, the Second Affiliated Hospital of Xingtai Medical College, Xingtai 054000, Hebei Province, China
About author:Jia Ying-min, Master, Attending physician, Department of Nephrology, Beijing Military General Hospital, Beijing 100700, China; Integrated Traditional and Western Medicine Hospital of Pingxiang, Xingtai 054500, Hebei Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：补肾中药对动物及细胞实验研究提示具有防治骨质疏松及改善骨代谢作用，但补肾中药的配伍研究较少且复杂，且有效作用成分之间的相互作用及药物物质基础尚不确定，筛选最佳配伍困难。
目的：通过采用不同补肾中药成分配伍，对新生SD大鼠成骨细胞进行干预性培养，并对其增殖、分化、Smad4 mRNA表达进行测定，从而筛选并确定补肾中药的最佳配伍。
方法：第5代成骨细胞分为5组：淫羊藿苷组细胞中加入1×10^-5 mol/L的淫羊藿苷；淫羊藿苷+柚皮苷组细胞中加入1×10^-5 mol/L淫羊藿苷+1×10^-5 mol/L柚皮苷；淫羊藿苷+薯蓣皂苷元组细胞中加入1×10^-5 mol/L淫羊藿苷+1×10^-5 mol/L薯蓣皂苷元；淫羊藿苷+梓醇组细胞中加入1×10^-5 mol/L淫羊藿苷+1×10^-5 mol/L梓醇；对照组细胞中加入10 μL生理盐水。每组6个复孔。
结果与结论：与对照组相比，淫羊藿苷+柚皮苷组和淫羊藿苷+薯蓣皂苷元组成骨细胞增殖能力及Smad4 mRNA表达水平增加，且培养72 h时，淫羊藿苷+柚皮苷组成骨细胞增殖能力最强。48 h时，淫羊藿苷+柚皮苷组和淫羊藿苷+薯蓣皂苷元组成骨细胞碱性磷酸酶活性高于对照组；72 h，淫羊藿苷+柚皮苷组和淫羊藿苷+梓醇组成骨细胞碱性磷酸酶活性高于对照组。提示淫羊藿苷等补肾中药成分配伍可以影响成骨细胞的成骨活性，且其中以淫羊藿苷配伍柚皮苷的作用最强。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织工程, 成骨细胞, 补肾中药, 骨质疏松症, 淫羊藿苷, 配伍, 有效成分, 增殖, 分化, 转化生长因子β, Smad4

Abstract:

BACKGROUND: Chinese nourishing kidney herbs can prevent osteoporosis and improve bone metabolism, which has been proved in animal and cell experiments. But there are few reports on the compatibility of Chinese nourishing kidney herbs, and it is difficult to screen the optimal compatibility, as the interaction of active ingredients and drug substance basis are uncertain.

OBJECTIVE: To determine the proliferation, differentiation and Smad4 mRNA expression of neonatal Sprague-Dawley rat osteoblasts cultured by Chinese nourishing kidney herbs with different compatibility so as to find out the optimal compatibility of Chinese nourishing kidney herbs.

METHODS: Passage 5 osteoblasts were divided into five groups: group A, 1×10^-5mol/L icariin; group B, 1×10^-5mol/L icariin+1×10^-5 mol/L naringin; group C, 1×10^-5mol/L icariin+1×10^-5 mol/L diosgenin; group D, 1×10^-5mol/L icariin+1×10^-5 mol/L catalpol; group E, 10 μL normal saline (control group). There were six wells in each group.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the group E, the proliferative ability of osteoblasts and expression of Smad4 mRNA were increased in the groups B and C; until the 72^nd hour, the proliferative ability of osteoblasts in the group B reached the peak. At 48 hours of culture, the activity of alkaline phosphatase in groups B and C was higher than that in group E; at 72 hours of culture, the activity of alkaline phosphatase in groups B and D was higher than that in group E. These findings indicate that the compatibility of Chinese nourishing kidney herbs can influence the activity of osteoblasts, and icariin+naringin has the strongest effect.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoblasts, Epimedium, Smad4 Protein, Alkaline Phosphatase

中图分类号:

R318

贾英民，李瑞玉，武密山，霍瑞楼，李彬，郭雅静. 补肾中药成分配伍对成骨细胞成骨活性及Smad4 mRNA表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(33): 5289-5294.

Jia Ying-min, Li Rui-yu, Wu Mi-shan, Huo Rui-lou, Li Bin, Guo Ya-jin. Compatibility of Chinese nourishing kidney herbs influences osteoblast activity and Smad4 mRNA expression[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(33): 5289-5294.

图/表（结果） 3

2.1 成骨细胞的形态刚传代的细胞呈球形，悬浮于培养液，在24 h内细胞开始贴壁，展开后的细胞多呈短梭形、三角形或多角形，形态不规则且有较多突起，细胞突起相互连接；胞核呈圆形或椭圆形，居中或偏于一侧，轮廓清晰，可见1-3个核仁；2周后细胞长满瓶底时，多呈梭形或立方形，汇合时呈铺路石状^[18]。细胞传至第5代碱性磷酸酶细胞化学染色鉴定所用细胞为成骨细胞，且细胞纯度超过90%以上(图1) 2.2 成骨细胞的增殖培养24，48，72 h时，与对照组相比，淫羊藿苷+柚皮苷组和淫羊藿苷+薯蓣皂苷元组成骨细胞增殖能力增强(P < 0.05)，而淫羊藿苷和淫羊藿苷+梓醇组成骨细胞增殖差异无显著性意义(P > 0.05)；且培养72 h时，淫羊藿苷+柚皮苷组成骨细胞增殖能力最强(P < 0.01)，见图2。

2.3 成骨细胞的分化培养48 h后，与对照组相比，淫羊藿苷+柚皮苷组和淫羊藿苷+薯蓣皂苷元组成骨细胞碱性磷酸酶活性明显增加(P < 0.05)，而淫羊藿苷组和淫羊藿苷+梓醇组成骨细胞碱性磷酸酶活性差异无显著性意义(P > 0.05)；培养72 h时，与对照组相比，淫羊藿苷+柚皮苷组和淫羊藿苷+梓醇组成骨细胞碱性磷酸酶活性增加(P < 0.05)，以淫羊藿苷+柚皮苷组为著(P < 0.01)，见图3。

2.4 Smad4 mRNA的表达水平反转录PCR结果显示，大鼠成骨细胞培养48 h后，与对照组相比，淫羊藿苷组和淫羊藿苷+梓醇组Smad4 mRNA表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)，而淫羊藿苷+柚皮苷组和淫羊藿苷+薯蓣皂苷元组Smad4 mRNA表达水平明显增加(P < 0.05)，见图4。

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引言

骨质疏松症是以单位体积内的骨量减少，骨强度降低，骨组织显微结构异常，致使骨的脆性增加易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病，其发生是由各种原因导致的骨形成和骨破坏平衡失调，如遗传因素、环境因素、生活方式等，以绝经后妇女和老年患者常见，主要表现为腰背疼痛、膝软无力、身高变矮、驼背、易于骨折等^[1-4]。近年来，骨质疏松症发生率逐年增高，尤其老年人骨质疏松引起的骨折发病率高，治疗费用高，预后差。骨质疏松症目前已经是世界上发病率、死亡率及医疗保健费用消耗较大的疾病之一。美国有资料显示，到2020年，每年发生骨质疏松骨折的人数可达150万，年支出超过150亿美元，而中国在近15年间，骨质疏松骨折发生率也增加了近3倍。骨的代谢总是随着骨吸收和骨重建动态平衡的不断改变而变化，在骨质疏松症发生过程中，主要表现为骨形成功能相对不足。成骨细胞是骨代谢和骨形成过程中的主要功能细胞，该细胞可合成、分泌骨钙素，促进骨质矿化，对骨组织的生长发育、损伤修复、骨代谢平衡与骨量维持起着重要作用。成骨细胞的活性下降，同时破骨细胞活性增加是造成骨质疏松的重要原因。体外培养成骨细胞能很好地反映成骨细胞的功能活动特点，增强成骨细胞的增殖和分化，为预防骨质疏松症的方法^[5-6]。成骨细胞是骨代谢和骨形成过程中的主要功能细胞，对维持成年骨骼系统正常有重要的作用^[6]。体外原代培养的成骨细胞是常用的体外细胞实验模型，为研究成骨细胞生长代谢及骨组织工程的基础，刺激成骨细胞增殖并促进其分化成熟是防治骨质疏松症的主要方法^[7-8]。骨质疏松症尚缺乏有效的治疗措施，药物应用有限，且存在许多争议。以往应用雌激素、钙剂、钙盐、双膦酸盐、维生素D、氟化物、降钙素等治疗结果发现，存在如内分泌紊乱、癌变、疗效不确定、受生理因素限制等，均受到质疑^[1^，^5]。骨质疏松属中医学的“骨痿”、“骨痹”的范畴，中医药在防治骨质疏松症方面具有独特的优势。近年来经过国内众多学者在补肾中药防治骨质疏松的研究中发现某些中药能够使患者的骨量增加，骨小梁面积及密度、成骨细胞分泌骨钙素增加，从而达到治疗骨质疏松症的效果^[8-10]。《黄帝内经》认为“肾主骨生髓”，通过补肾法可很好的改善骨代谢，防治抗骨质疏松作用^[10]。基于中医理论及中药复方配伍研究^[11]。本实验选用补肾中药成分配伍即补肾中药淫羊藿的有效成分淫羊藿苷分别与地黄、山药及骨碎补的有效成分配伍，同时设单体淫羊藿苷对照组和空白对照组，通过比较观察其对体外培养SD大鼠成骨细胞增殖与分化及Smad4 mRNA表达的影响，从而确定最佳配伍。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

设计：随机对照细胞学实验。

时间及地点：实验于2008年5月至2009年5月在河北医科大学中西医结合研究所实验室完成。

材料：

实验动物：出生24 h内SD乳鼠，雌雄不限，购于河北医科大学实验动物中心(合格号903124)。实验经河北医科大学动物伦理学委员会批准，动物在戊巴比妥钠麻醉下进行手术，并尽一切努力最大限度减少其疼痛、痛苦和死亡。

药物：梓醇(Catalpol)，批号110808-200407；淫羊藿苷(Icariin)，批号110737-200413；薯蓣皂苷元(Diosgenin)，批号111539-200001；柚皮苷(Naringin)，批号110722- 200309，均购自中国药品生物制品检定所。

成骨细胞的增殖与分化检测使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
胰蛋白酶，Ⅱ型胶原酶，MTT，二甲基亚砜	美国Sigma公司
DMEM培养基	Invitrogen Corporation公司
胎牛血清	中美合资兰州民海生物工程有限公司
碱性磷酸酶试剂盒	保定长城临床试剂有限公司
TRIzol	GIBCO
PCR试剂盒	Japan
COIC XDS-1B倒置显微镜	重庆光电仪器有限公司
318MC型双波光酶标仪	上海三科仪器有限公司
超净化工作台	北京冠鹏净化设备有限公司
CO₂培养箱	日本三阳生物电子有限公司
DYY-10 型三恒电泳仪	北京市六一仪器厂

方法：

体外成骨细胞培养：采用贴块法^[12-14]，在无菌条件下，剪断头部，取出SD乳鼠颅骨，置入D-hanks 液内，清洗并清除骨膜、血管等结缔组织；37 ℃下0.25%胰蛋白酶消化液中预消化15 min，37 ℃下移入5 mL含有0.1%的Ⅱ型胶原酶消化液处理40 min，将骨片剪成1.0-2.0 mm³大小的骨粒，分散于培养瓶中，加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液，将培养瓶放入37 ℃，体积分数5%CO₂的培养箱中开始培养。3 d后换培养液，观察成骨细胞形态及生长情况，5 d后弃去骨粒，开始传代细胞培养。

补肾中药成分配伍分组：成骨细胞传至第5代，取96孔培养板，以每孔加入0.2 mL细胞(3 000/孔)，在37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养，待成骨细胞贴壁并70%达到融合时，弃去培养基。淫羊藿苷组细胞中加入1×10^-5mol/L的淫羊藿苷。淫羊藿苷+柚皮苷组细胞中加入1×10^-5 mol/L淫羊藿苷+1×10^-5 mol/L柚皮苷。淫羊藿苷+薯蓣皂苷元组细胞中加入1×10^-5 mol/L淫羊藿苷+1×10^-5 mol/L薯蓣皂苷元。淫羊藿苷+梓醇组细胞中加入1×10^-5 mol/L淫羊藿苷+ 1×10^-5 mol/L梓醇。对照组细胞中加入10 μL生理盐水。每组6个复孔。

测定成骨细胞的增殖：培养24，48，72 h后，加入MTT 20 μL，于37 ℃条件下，体积分数5%CO₂的培养箱中继续进行培养4 h，加入二甲基亚砜溶液150 μL，用酶标仪于 492 nm波长处测定吸光度值。

成骨细胞分化的测定：细胞分组干预48，72 h后，弃去培养液，加入0.25 mL 0.1% Triton溶液，吹打细胞，于10 min后收集每孔溶液，按试剂盒说明测定碱性磷酸酶，采用对硝基苯磷酸二钠基质动力学法，结果以U/g表示。

反转录PCR：将成骨细胞按5×10⁷L^-1的细胞浓度接种于100 mL的培养瓶中，每瓶6 mL，常规培养3 d后均换为含浓度10^-5 mol/L的不同补肾中药配伍无血清培养基及生理盐水，继续培养48 h后，用4 ℃ PBS洗涤细胞3次，每孔加入1 mL Trizol，按照说明书提取的步骤提取细胞内总RNA。经紫外分光光度计测定A_{260 nm}/A_{280 nm}值，保证各组比值均在1.8-2.0之间。根据A_{260 nm}计算RNA的浓度，调整定量反转录PCR总反应体系中各组RNA的加样量。根据文献[15-17]及Genebank中的序列，用引物设计软件Primer Premer 设计Smad 4基因的引物。由上海生工生物工程公司合成。Smad 4(407 bp)上游引物：5’-TGG CTG GTC GGA AAG GAT-3’，下游引物：5’-CAC AGG AAT GTT GGG GAA GTT-3’。GAPDH (606 bp)，上游引物：5’-CCC ACG GCA AGT TCA ACG GCA-3’，下游引物：5’-TGG CAG GTT TCT CCA GGC GGC-3’。定量反转录PCR反应，按照试剂盒说明逆转录得cDNA，总RNA加样量均为 1 μg。PCR反应条件：预变性94 ℃ 2 min，变性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1.5 min。共30个循环。最后一个循环结束后72 ℃延伸7 min。产物经1.7%琼脂糖凝胶电泳, 电压为3-5 V/cm(100 V)，电泳缓冲液为1×TAE，待样品迁移至凝胶长度2/3时，停止电泳。凝胶成像仪观察。

主要观察指标：①补肾中药成分配伍对成骨细胞增殖的作用。②补肾中药成分配伍对成骨细胞碱性磷酸酶的影响。③补肾中药成分配伍对成骨细胞Smad4 mRNA表达情况。

统计学分析：数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，结果以x(_)±s表示，组间差异比较用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

随着社会的发展，世界人口老龄化的趋势越来越明显，作为老年人的常见病，骨质疏松症的发病率必将进一步提高。据资料显示骨质疏松症已由20世纪的第13大疾病跃居为21世纪的第5大疾病，全世界患骨质疏松的总人数超过2亿，中国近1亿的60岁以上的老年人中约有8 900万人患有不同程度的骨质疏松，但大多数人缺乏有效的治疗^[2-4]。目前临床上抗骨质疏松药物可分为骨吸收抑制剂和骨形成促进剂，但费用较高，且有一定不良反应。补肾是中医药治疗骨质疏松症的重要原则。中医学认为骨质疏松症属于“骨痿”范畴，是因肝肾不足、气血亏损、损伤和感受风寒湿邪引起，其病机为本虚标实，《灵枢•经络篇》提出：“足少阴气绝则骨枯，骨不濡则肉不能著也；骨肉不相亲则肉软却，发无泽者骨先死”。骨质疏松症的本质是阴阳气血俱虚，以肾虚为主，兼有脾气虚弱，肝血不足。骨的生长、发育与肾精盛衰关系密切，肾精充足则骨生化有源，骨骼得以充足滋养；反之肾精亏虚则骨生化无源，骨骼失养而痿弱无力。因此中医药学采用补肾为主，辅以健脾、活血、强筋健骨等方法^[10^，^19-20]。有学者通过分析208首中药防治骨质疏松症方剂，结果发现治疗骨质疏松症中药的药性以温为主，辅以平性，药味以甘、辛为主，其中有关淫羊藿相关报道最多。通过临床实验和动物实验证明补肾中药具有激素样作用，以及抗菌、消炎、镇痛、舒张平滑肌、抑制血小板聚集、扩张血管、提高免疫功能等作用^[21-22]。 Smad4参与调节成骨细胞对骨组织的修复和重建。骨的代谢总是随着骨吸收和骨重建动态平衡的不断改变而变化，成骨细胞和破骨细胞都之间的耦联平衡是维持正常骨量的关键，而参与骨重建的成骨细胞具有促进骨基质的合成、分泌和矿化的作用，是骨的形成、骨骼发育与生长的重要细胞，因此成骨细胞的活性增强和降低影响着骨质疏松的发生和发展^[5-6]。转化生长因子β是个庞大的家族，有内分泌型多肽分子转化生长因子β、骨发生蛋白等构成，具有广泛的生物学活性，通过细胞膜表面Ⅰ和Ⅱ型丝氨酸/苏氨酸激酶受体进行信号转导^[23-24]。转化生长因子β是骨代谢的重要因子，Smads蛋白直接参与其信号转导，包括受体调节型 Smad(Smad1，2，3，5，8)、通用型Smad(Smad4)和抑制型Smad(Smad6，7)。其中，Smad2，3主要传递转化生长因子β和活化素(activin)信号，Smad1，5，8主要传递骨发生蛋白信号。其中Smad4作为转化生长因子β家族中信号通路中通用型细胞内信号转导分子，是促进其转导过程的重要中转分子之一，参与调节成骨细胞及成软骨细胞的分化，调节骨组织的修复和重建^[24-26]。补肾中药及其有效成分对成骨细胞的生物学活性具有促进作用。淫羊藿具有补肾、壮阳、强筋骨的作用，是小檗科淫羊藿属(epimedium)多种植物的地上部分，淫羊藿苷(Icariin)是一种黄酮苷类化合物，是小檗科淫羊藿属植物中的主要活性成分之一。实验研究证明淫羊藿苷具有促进成骨细胞的增殖和分化^[27]，促进成骨细胞活性；整体实验研究提示可提高大鼠的骨密度，增加骨强度和韧性，减少骨吸收，具有抗骨质疏松作用^[28]。此外淫羊藿苷还具有增加心脑血管血流量，延缓肾衰竭的进程，增强雄性生殖功能，改善血液流变学和促进造血，调节机体免疫功能，抗肿瘤，抗衰老等功效^[29-30]。地黄是玄参科植物地黄(rehmannia glutinosa)的根块，具有清热凉血、益精填髓功效。地黄的主要成分是梓醇，实验证实其具有促进MC3T3-E1成骨细胞增殖和分化作用，具有成骨活性^[31-32]；山药具有健脾补肾、固肾益精的功能，为薯蓣科植物薯蓣(Dioscorea opposite Thunb)的根块，薯蓣皂苷元是从薯蓣(yam)中提取的一种化合物，实验证实其可通过上调Lrp5 mRNA表达，促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖、分化，具有成骨活性及抗氧化作用^[33-34]；骨碎补主要的有效成分是柚皮苷，为水龙骨科植物槲蕨(Drynaria fortunei J. Sm.)的根茎，具有补肾强骨作用，实验研究证实柚皮苷对大鼠成骨细胞及小鼠MC3T3-E1细胞株的增殖和分化及骨保护素等有明显促进作用^[35-36]，且对切除卵巢后的骨质疏松有改善作用^[37]。补肾中药有效成分配伍能有效促进成骨细胞的增殖和分化，其机制可能与提高Smad 4 mRNA表达水平有关。实验结果显示淫羊藿苷联合薯蓣皂苷元或柚皮苷能明显促进成骨细胞增殖，两者配伍起到协同作用；而淫羊藿苷单独或与梓醇配伍促进细胞增殖作用不明显。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志，通过对碱性磷酸酶含量的测定，进而可反映成骨细胞的成骨活性^[38-47]。实验显示淫羊藿苷配伍柚皮苷、淫羊藿苷配伍梓醇具有实验性提高成骨细胞成骨活性作用，以淫羊藿苷与柚皮苷配伍为优。补肾中药成分配伍，以淫羊藿苷与柚皮苷配伍最佳，可能是通过提高Smad4 mRNA表达，参与转化生长因子β的信号转导，而影响成骨细胞的成骨活性。补肾中药有效成分配伍是补肾方剂的拆方实验研究的一部分。文章以体外培养的成骨细胞培养体系作为研究和筛选抗骨质疏松药物活性成分的重要手段和技术平台，通过补肾中药成分配伍，对新生SD乳大鼠成骨细胞进行体外培养，并对成骨细胞的成骨活性进行测定和Smad4 mRNA 表达的影响，提示补肾中药有效成分之间的配伍存在协同和拮抗的作用，其机制尚不清楚。本实验为中药现代化及复方中药的研究提供了新的思路和有益探索。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

补肾中药成分配伍对成骨细胞成骨活性及Smad4 mRNA表达的影响

Compatibility of Chinese nourishing kidney herbs influences osteoblast activity and Smad4 mRNA expression

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