犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：体外分离培养获得足够活性良好的种子细胞是构建阴道组织工程的关键。文献报道阴道上皮细胞体外纯化培养和传代较为困难，尤其是体外长期培养犬等大动物的阴道种子细胞尚未见报道。
目的：建立体外稳定培养犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞方法。
方法：获取犬小块阴道组织，机械分离阴道黏膜上皮，Dispase酶和胰蛋白酶分步消化收集上皮细胞，接种于无血清角化细胞培养液中培养和传代；机械分离阴道平滑肌组织后采用Ⅱ型胶原酶消化获得平滑肌细胞，在含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液中连续培养传代。动态观察上皮细胞和平滑肌细胞生长增殖情况，分别采用特异性抗体行细胞免疫化学染色鉴定。
结果与结论：原代培养的上皮细胞24-36 h后开始贴壁铺展，四五天后呈对数生长，七八天可达70%融合，为单一的上皮细胞，呈典型铺路石样，未见成纤维细胞混杂。每四五天可传代1次，连续传代六七次，细胞免疫化学染色角蛋白AEl/AE3抗体阳性。平滑肌细胞原代培养24 h后贴壁呈梭形，此后呈对数生长，4 d后融合呈典型的“峰和谷”样，每三四天可传代1次，连续传代七八次，细胞免疫化学染色示α-肌动蛋白染色阳性。结果证实，犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养，可为体外构建组织工程化阴道提供足够的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 培养, 阴道, 组织工程, 上皮细胞, 平滑肌细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In vitro culture of sufficient vaginal epithelial cells and smooth muscle cells is the key for vaginal tissue engineering. However, the culture, purification and passage of vaginal epithelial cells in vitro are difficult. Primary culture and passage of vaginal epithelial cells from large animals such as canines has not been reported.
OBJECTIVE: To establish a stable method of culturing canine vaginal epithelial cells and smooth muscle cells.
METHODS: Vaginal epithelial cells were isolated from the vaginal specimens by enzymatic digestion with Dispase and trypsin separately, and cultured in keratinocyte serum-free medium. Vaginal smooth muscle tissue were minced and digested with collagenase type II; the collected smooth muscle cells were cultured in DMEM culture medium containing 10% fetal bovine serum. The cultured cells were passaged regularly. Cell morphology and proliferation characteristics were observed and cell phenotypes were confirmed by morphology and immunohistochemistry staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Primary vaginal epithelial cells began to adhere after 24-36 hours, grew logarithmically after 4-5 days, and reached 70% confluence after 7-8 days; the epithelial cells showed a typical cobblestone, with no fibroblasts. Cultured epithelial cells passaged every 4-5 days and subcultured to 6-7 generations continuously. Immunohistochemical staining confirmed a positive staining for anti-pancytokeratin (AEl/AE3). Primary cultured smooth muscle cells adhered and grew after 24 hours. The smooth muscle cells were spindle-shaped and proliferated logarithmically. After 4 days, primary cultured smooth muscle cells were confluent and showed a typical shape of “peaks and valleys”, and then the cells could be passaged every 3-4 days and passaged 7-8 generations. Immunohistochemistry staining showed α-actin staining was positive. These findings indicate that canine vaginal epithelial cells and smooth muscle cells could have a long-term stable culture and proliferation, to provide adequate seed cells for vaginal tissue engineering.

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Key words: Vagina, Epithelial Cells, Myocytes, Smooth Muscle

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

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引言

阴道不仅是软产道的重要组成部分，也是女性性生活的重要器官^[1]。多种先天及后天因素均可导致阴道组织缺损，如先天性无阴道、两性畸形、肿瘤术后造成的阴道缺损等^[2-4]。

目前临床应用的阴道成形术主要有采用皮片或皮瓣、乙状结肠、腹膜组织替代修复阴道缺损。但这些方法会不同程度地导致阴道干涩、挛缩、异味、阴道瘢痕狭窄^[5-6]。近年来组织工程学的兴起及临床前的研究，为构建结构和功能正常的组织工程化阴道修复阴道缺损带来了希望^[7-9]。体外分离培养获得足够活性良好的种子细胞是构建阴道组织工程的关键^[10-11]。

阴道组织工程的种子细胞包括阴道上皮细胞和阴道平滑肌细胞。阴道黏膜为复层鳞状角化上皮，受体内性激素调节，只有基底层细胞才具有较强的增殖能力。因此体外分离培养阴道上皮细胞一直存在细胞贴壁难，易被成纤维细胞混杂、增殖缓慢且很快老化、不能传代等诸多困难，如何快速有效地体外培养足够的上皮细胞一直是阴道组织工程构建的关键^[12-13]。

De Filippo等^[14]首先采用两种酶分步消化法和角化细胞无血清培养体系成功培养了兔阴道上皮细胞。

李雅钗等^[15]研究也证实采用该培养方法可成功培养兔阴道上皮细胞，但该培养体系是否适合犬等大动物阴道上皮细胞培养尚不清楚。

阴道平滑肌也是阴道组织的重要结构之一，体外培养扩增足够活性良好的阴道平滑肌细胞也是成功构建阴道组织工程的基础^[16]。实验拟建立体外培养犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞的稳定培养体系，为构建组织工程化阴道提供足够的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2013年6至11月在武汉大学人民医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：成年雌性杂种犬4只，体质量16-21 kg，购于武汉大学人民医院实验动物中心。实验中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

实验方法：

阴道上皮细胞的培养：取发情间歇期的成年雌性杂种犬，采用戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉，消毒铺巾。耻骨上作下腹正中切口，显露子宫及附件，游离上段阴道，获取大小约1.5 cm×1 cm阴道组织。置入双抗液中浸泡5 min，解剖显微镜下仔细分离阴道黏膜和平滑肌层，尽量去除黏膜下组织。将分离好的阴道黏膜切成1 cm×0.2 cm的细条状，采用1.2 U/mLDispase酶4 ℃过夜消化，标本转移至超净工作台中。眼科镊分离阴道黏膜上皮层，0.25%胰酶37 ℃消化阴道上皮组织8 min，含体积分数10%胎牛血清的DMEM终止消化，吸管反复吹打，1 000 r/min离心7 min，弃上清，D-Hanks液漂洗2次后加入KSFM培养液重悬，细胞浓度为5.0×10⁹ L^-¹细胞接种于一次性培养瓶中。置体积分数5% CO₂、37 ℃饱和湿度培养箱中培养，3 d后首次换液，此后两三天换液1次。细胞生长达70%融合时进行传代培养，弃培养基，PBS漂洗2次，去除未贴壁细胞，采用0.25%胰蛋白酶常温消化7 min，含体积分数10%胎牛血清的DMEM终止消化，吸管反复吹打，1 000 r/min离心5 min，弃上清，D-Hanks液漂洗2次后加入KSFM培养液重悬，以1∶2传代培养，此后每四五天传代1次。

阴道平滑肌细胞的培养：分离平滑肌层，采用眼科剪剪成匀浆状，0.1% Ⅱ型胶原酶37 ℃振荡消化3 h。反复吹打絮状组织块后150目筛网过滤，获得单细胞悬液，离心，漂洗后加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬，以2×10⁵/cm²种植于一次性塑料培养瓶中，置于培养箱中培养。每2 d换液1次，传代时采用0.25%胰蛋白酶消化5 min，按照1∶3传代。
细胞形态学观察及生长曲线测定：倒置显微镜下每日观察细胞形态及生长情况。取第2代阴道上皮细胞和平滑肌细胞，细胞计数，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种于96孔培养板上，每孔0.1 mL，培养7 d，每天任选3个孔计数，取平均值。以培养天数为横轴，细胞平均数为纵轴绘制细胞生长曲线。

细胞免疫化学染色：分别取第3代阴道上皮细胞和平滑肌细胞，制作细胞爬片，40 g/L多聚甲醛固定后采用细胞角蛋白AE1/AE3抗体和平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫化学染色，磷酸盐缓冲液漂洗后与含生物素标记的二抗体反应，DAB显色，复染后镜检。

细胞周期检测：选择第7代培养的上皮细胞和平滑肌细胞，消化后制成细胞悬液，采用预冷的体积分数70%乙醇固定，碘化丙啶染色后流式细胞仪检测。

主要观察指标：①犬阴道上皮细胞及阴道平滑肌细胞生长特征。②犬阴道上皮细胞及阴道平滑肌细胞免疫化学染色鉴定结果。③细胞周期检测结果。

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讨论

阴道组织工程的基本原理为获取少量自体组织后体外培养扩增获得足够的种子细胞(阴道上皮细胞和平滑肌)，种植于一种生物相容性良好并可被机体吸收的人工合成支架材料(或无细胞基质上)形成细胞支架复合物(组织工程化阴道)，植入阴道缺损部位，细胞在基质降解吸收的过程中分泌新的细胞外基质，形成具有正常结构和功能的阴道组织^[17-18]。

采用组织工程技术修复替代阴道缺损的方法有两种：一种为直接植入同种或异种无细胞基质(如阴道无细胞基质，小肠黏膜下层)，利用周围正常阴道组织的再生能力沿着植入的无细胞基质爬行形成新的阴道组织^[19-21]；另一种为首先获取少量自体阴道组织，体外培养获得足够的阴道上皮细胞和平滑肌细胞后种植到无细胞基质内外表面，体外培养一段时间后移植到宿主体内修复和替代阴道缺损^[22]。

De Filippo等^[23]研究表明，单纯采用无细胞基质修复兔阴道缺损虽能形成完整的上皮层，但缺乏平滑肌层，修复长段缺损时易形成组织塌陷、狭窄；而通过体外培养兔阴道上皮细胞和平滑肌细胞后种植到管状化PGA聚合材料内外表面，采用生物反应器体外培养7 d构建组织工程化阴道后成功修复了兔长段阴道缺损。该研究小组体外培养阴道上皮细胞和平滑肌细胞后采用荧光标记染色后追踪观察证实修复的细胞来源于体外培养扩增的阴道上皮细胞和平滑肌细胞，平滑肌细胞在构建具有收缩功能的工程化阴道组织中发挥重要作用。因此，建立阴道上皮细胞和平滑肌细胞的体外培养体系以获得足够活性良好的种子细胞是阴道组织工程的关键^[24]。

本研究结果表明采用分步消化分离法和无血清培养体系也能成功培养犬等大动物的阴道上皮细胞。但原代培养中应注意以下几个关键点：①阴道黏膜上皮为复层鳞状上皮，只有基底层细胞具有较强的增殖能力，首选采用Dispase酶过夜冷消化完整分离上皮层，保留较多的基底层细胞而不损伤细胞活性是成功培养的前提。②采用无血清角化细胞培养液可有效抑制成纤维细胞生长，而且添加的表皮生长因子等成分能显著促进上皮细胞增殖、抑制其分化，是体外快速稳定培养上皮细胞的关键。③性成熟间歇期取材，因阴道黏膜上皮随体内性激素水平调控而不同程度角化，故在犬发情间歇期取材细胞角化层少，可获得较多的基底层细胞。取材后尽量去除黏膜下层的结缔组织，仅保留较薄的黏膜层是获得良好消化效果的关键。

实验中犬阴道上皮细胞原代培养24 h后大部分细胞开始贴壁，48 h细胞基本贴壁伸展，72 h后细胞增殖明显，说明分离消化的阴道上皮细胞具有良好的活性。5 d后细胞呈对数生长，排列紧密呈典型的铺路石状，未见成纤维细胞混杂。采用上皮细胞角蛋白AE1/AE3抗体染色阳性，进一步证实实验培养的为高纯度的阴道上皮细胞。连续传代6代，细胞扩增70余倍未见细胞老化凋亡，可获得足够活性良好的上皮细胞用于工程化组织构建。阴道平滑肌细胞在阴道组织工程中也起重要作用。实验中阴道平滑肌细胞培养24 h后大部分细胞贴壁伸展，细胞形态呈梭形，36 h后细胞呈对数生长，倒置显微镜下呈典型的“峰和谷”样，可连续传代6-8次，平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体染色阳性，证实培养的细胞为阴道平滑肌细胞。以上结果表明：犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外稳定培养扩增，能获得足够活性良好的种子细胞，为构建阴道工程化组织奠定了基础。