白细胞介素17在肾移植排斥反应中的表达及意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.014

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (51): 8275-8280.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.014

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白细胞介素17在肾移植排斥反应中的表达及意义

孙曙¹，李州利²，蔡明²，王强²，金海龙²，陈昌庆²，刘志佳²，孔祥瑞²，李聪然²，石炳毅²

¹解放军军事医学科学院，北京市 100039；²解放军第309医院全军器官移植研究所，北京市 100091

出版日期:2014-12-10 发布日期:2014-12-10
通讯作者: 石炳毅，博士生导师，主任医师，解放军第309医院全军器官移植研究所，北京市 100091
作者简介:孙曙，男，1981年生，安徽省寿县人，汉族，军事医学科学院在读硕士，主要从事器官移植与移植免疫方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81171753)

Expression and significance of interleukin-17 in rejection after kidney transplantation

Sun Shu¹, Li Zhou-li², Cai Ming², Wang Qiang², Jin Hai-long², Chen Chang-qing², Liu Zhi-jia², Kong Xiang-rui², Li Cong-ran², Shi Bing-yi²

¹Military Medical Science Academy of PLA, Beijing 100039, China; ²Organ Transplant Institute, the 309^th Hospital of PLA, Beijing 100091, China

Online:2014-12-10 Published:2014-12-10
Contact: Shi Bing-yi, Doctoral supervisor, Chief physician, Organ Transplant Institute, the 309th Hospital of PLA, Beijing 100091, China
About author:Sun Shu, Studying for master’s degree, Military Medical Science Academy of PLA, Beijing 100039, China
Supported by:
theNational Natural Science Foundation of China, No. 81171753

摘要/Abstract

摘要：

背景：白细胞介素17是一种强效的炎性细胞因子，在急性排斥反应研究中较多，而在慢性排斥反应以及急性和慢性共同研究甚少。

目的：通过研究白细胞介素17表达与移植肾发生排斥反应的相关性，探索白细胞介素17表达与排斥反应的关系。

方法：选取解放军第309医院肾移植后穿刺及复查患者47例，根据患者病情分为肾功能稳定组(n=20)、急性排斥组(n=15)和慢性排斥组(n=12)，另取健康体检人员15人作为正常组。应用实时荧光定量PCR检测4组受试对象外周血单个核细胞中白细胞介素17 mRNA的相对表达水平，分析其与血清肌酐和排斥时间的相关性。

结果与结论：与正常组相比，急性排斥组与稳定组患者白细胞介素17 mRNA的表达水平差异有显著性意义；而慢性排斥组患者白细胞介素17 mRNA较稳定组升高了2.89倍(P < 0.01)。急性排斥组及慢性排斥组患者白细胞介素17 mRNA表达水平与肌酐、移植后排斥时间均无明显相关性。提示白细胞介素17在排斥反应中存在显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 移植, 白细胞介素17, 肾移植, 急性排斥反应, 慢性排斥反应, 实时荧光定量PCR, 单个核细胞, 血清肌酐, 排斥时间, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Interleukin-17 is a potent inflammatory cytokine, which has been greatly reported in acute rejection research but little in chronic rejection or acute and chronic rejection research.

OBJECTIVE: By studying the correlation between interleukin-17 and renal allograft rejection, to explore the asociation between interleukin-17 and rejections.

METHODS: In accordance with the inclusion criteria strictly, health physical examination persons (15 caess) and kidney transplantation recipients (47 caess) were choosed and divided into four groups: normal group (15 cases), stable renal function group (20 cases), acute rejection group (15 cases), and chronic rejection group (12 cases). The relative expression levels of interleukin-17 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of these four groups were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Then differences between four groups were compared and the correlations with the serum creatinine and the rejection time were analyzed.

RESULTS AND CONCLUSION: The expression levels of interleukin-17 mRNA in the acute rejection and stable renal function groups were signfiicantly different from that in the normal group. The expression level of interleukin-17 mRNA in the chronic rejection group was increased by 2.89 times, showing a significant difference from the stable group (P < 0.01). In the acute and chronic rejection groups, the expression level of interleukin-17 mRNA had no significant correlation with serum creatinine level and postoperative rejection time. These findings indicate that interleukin-17 is of significance in renal allograft rejection.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: interleukins, graft rejection, kidney transplantation, lymphocytes

中图分类号:

R318

孙曙，李州利，蔡明，王强，金海龙，陈昌庆，刘志佳，孔祥瑞，李聪然，石炳毅. 白细胞介素17在肾移植排斥反应中的表达及意义[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(51): 8275-8280.

Sun Shu, Li Zhou-li, Cai Ming, Wang Qiang2 Jin Hai-long, Chen Chang-qing, Liu Zhi-jia, Kong Xiang-rui, Li Cong-ran, Shi Bing-yi. Expression and significance of interleukin-17 in rejection after kidney transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(51): 8275-8280.

图/表（结果） 3

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引言

自1954年美国成功施行世界第一例肾移植手术，肾移植已经经历了60年的发展，肾移植患者的人/肾存活率均得到明显提高^[1-2]，如何更有效地保护移植肾功能，最大程度延长移植肾存活时间，使得移植肾处于免疫耐受是临床移植医生及实验人员研究的最终目标^[3]。当前，影响移植肾功能的因素主要是急性和慢性排斥反应。参与移植物排斥的效应细胞有很多，如B和T淋巴细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞等，但起主要作用的是淋巴细胞^[4-13]。目前临床上确诊排斥反应的方法主要依靠移植肾病理活检^[14]，但由于移植肾穿刺可能导致穿刺部位血肿的形成、肉眼血尿、移植肾损伤等并发症以及患者的抵触心理等一系列问题^[15]，因此寻找一种无创性、特异性的早期诊断排斥反应的指标，有效保护移植肾功能，提高肾移植的人/肾存活率和生存期，是临床医生所关注的热点。由于急性排斥和慢性排斥具有一定的关联^[16]，反复发生的急性排斥反应可导致慢性排斥反应的发生，因此联合研究急性排斥和慢性排斥有助于临床医生及实验研究人员更好地理解排斥的本质，寻找诊断和治疗排斥反应的新方向。过去的研究集中在Th1/Th2细胞^[17-18]。近年来，在对自身免疫性疾病及肿瘤的很多研究中发现，白细胞介素17等炎症性细胞因子发挥着重要的作用^[19-20]。同时还发现白细胞介素17也参与了器官移植排斥反应的发生^[21-35]。白细胞介素17是一种强效的致炎细胞因子，主要是由Th17细胞分泌，通过促进髓系免疫细胞和间质细胞产生粒细胞集落刺激因子和白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等细胞因子以及化学趋化因子(如单核细胞趋化蛋白1和巨噬细胞炎症蛋白2)等促进组织炎症发生，并促进中性粒细胞的分化、成熟和趋化作用，在排斥反应中可能发挥着重要作用。因此试验拟通过研究肾移植受者外周血单个核细胞中白细胞介素17转录水平，了解白细胞介素17在肾移植排斥反应中的表达水平，探讨其在肾移植排斥反应中的作用以及在诊断排斥反应中的作用。

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材料方法

设计：病例对照、回顾性分析研究

时间及地点：试验于2012年1月至2014年1月在解放军第309医院全军器官移植研究所泌尿外科完成。

对象：收集2012年1月至2014年1月在解放军第309医院进行肾移植后穿刺及复查患者47例及健康对照者(对照组)15名。肾移植后穿刺及复查患者分为肾功能稳定组(n=20)、急性排斥组(n=15)和慢性排斥组(n=12)。

纳入标准：

移植肾功能稳定组：①肾移植后肾功能稳定，无明显波动。②未患有肿瘤。③无感染。④急性和慢性排斥反应的发生。

急性排斥组：①血肌酐升高。②经超声引导下移植肾活检病理证实。

慢性排斥组：①血肌酐缓慢升高。②出现尿蛋白。③移植肾病理诊断证实。

正常组：①肝肾功能正常。②无肿瘤。

排除标准： ①在抽取血标本前已使用大剂量激素或单克隆抗体等可能影响T细胞计数的药物。②合并肿瘤。③同时存在感染和排斥、诊断不明确、临床资料不全者。

肾移植患者于穿刺前收集外周血标本5 mL，其他对象于体检及复查时收集外周血5 mL。所有参与对象均知情同意。试验获得解放军第309医院医学伦理学委员会的批准。

方法：

外周血单个核细胞的分离：将抽取的肝素钠抗凝血 5 mL与5 mL的PBS充分混匀，将混匀液缓慢沿管壁叠加于7.5 mL淋巴细胞分离液界面上。水平离心2 000 r/min× 20 min。离心后可见液体分3层，在上层和中层之间有一以外周血单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，用弯头滴管将白色云雾层慢慢吸到另一试管中，然后加入5倍以上体积的PBS充分洗涤，1 500 r/min水平离心10 min×2次。末次离心后，弃上清，加入1 mL Trizol，室温至少放置5 min以充分裂解细胞，然后将标本保存于-80 ℃以备后续试验。

实时荧光定量PCR检测白细胞介素17 mRNA的表达：向上述每加入1 mL Trizol的标本中加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡混匀15 s，室温放置2.0-3.0 min，4 ℃，12 000×g离心15 min。用移液枪慢慢吸取上层水相，置于新的离心管中。向以上步骤吸取的液体中加入0.5 mL异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10 min，4 ℃，12 000×g离心10 min，吸去上清，可见白色沉淀。用新鲜配置的1 mL体积分数75%乙醇充分溶解白色沉淀，轻微振荡，然后4 ℃，7 500×g离心5 min，弃上清。风干5-10 min，注意不要过度干燥致不易溶解，用30 μL不含RNA酶的水溶解RNA，水浴加热 55-60 ℃，10-15 min。每管10 μL分浆于-80 ℃冻存；每个标本取出一管进行RNA浓度检测。在微管中配置混合液(OligodT Primer 1 μL，Dntp Mixture 1 μL，RNA，加不含RNA酶的水至10 mL)，65 ℃保温5 min后，冰上迅速冷却。在另一微管中配置反转录液(即前述配置的上述反应液 10 μL，5×Primer Script Ⅱ Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Prime Script Ⅱ Rtase 1 μL，加不含RNA酶的水至 20 μL)。混匀。42 ℃孵育50 min，70 ℃孵育15 min。反转录结束后迅速将微管放置在冰上冷却，生成的cDNA液保存在-20 ℃。白细胞介素17和GAPDH引物由生工生物工程股份有限公司合成。

白细胞介素17正向：5’-CGG CTG GAG AAG ATA CTG GT-3’，反向：5’-TTA GTC CGA AAT GA GGC TGT C-3’；GAPDH正向：5’-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3’，反向：5’-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3’。在冰上配置PCR反应液(SYBR Premix ExTaq(TliRNaseH Plus)(2×)10.0 μL，PCR正向引物(10 μmol/L)0.4 μL，PCR反向引物(10 μmol/L)0.4 μL，DNA模板(25 ng)1.0 μL/ 0.5 μL，灭菌蒸馏水8.2 μL/8.7 μL)。采取两步扩增法进行实时PCR反应：95 ℃预变性30 s；95℃ 5 s，60 ℃ 20 s，39个循环，95 ℃ 0 s，65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s。根据Real-time PCR原始检测结果，按照2^-^△△Ct相对定量计算公式，以GAPDH基因为内参，正常组为参照组。

主要观察指标：实时荧光定量PCR检测4组对象外周血单个核细胞中白细胞介素17 mRNA的相对表达水平及其与血清肌酐和排斥时间的相关性。

统计学分析：数据的分析处理采用SPSS 17.0数据统计软件，数据以x(_)±s或中位数表示，组间均数之间比较正态数据采用t 检验或F 检验，非正态数据采用秩和检验，组内因素采用相关分析，定性数据采用卡方检验，以P < 0.05为差异有显著意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

肾移植后出现急性和慢性排斥反应对肾移植受者的肾功能以及移植肾的存活率有严重影响，因此深入研究和探索排斥反应的发生机制和发展过程对于认识移植免疫有重要意义，并且将极大地促进临床移植治疗地进展，挽救更多患者的生命。排斥反应的实质是受者机体针对异体来源器官的免疫反应，即机体通过以淋巴细胞为主的多种免疫细胞，识别并活化增殖，直接对移植物产生细胞杀伤或通过分泌细胞因子来介导的炎症反应损伤移植物的过程。因此，有效抑制淋巴细胞的增殖活化或抑制细胞因子的大量释放，是预防排斥反应发生的关键。目前的研究表明，细胞免疫主要参与急性排斥反应的发生，而体液免疫主要与慢性排斥反应的关系较密切。但不论是急性排斥还是慢性排斥的发生，均有大量炎性及特异性的细胞因子参与。因此有研究通过阻断细胞因子或其作用的受体来达到预防和治疗排斥反应，且通过检测一些特异性细胞因子来诊断排斥反应。传统的抗排斥治疗集中在Th1/Th2轴，但是在一些动物模型研究中发现，清除Th1细胞并不能完全避免排斥反应，Th2细胞分泌的细胞因子也参与了移植排斥反应。近年来，研究发现Th17细胞以及其分泌的的白细胞介素17与移植排斥反应密切相关，发生急性排斥反应时移植物中白细胞介素17mRNA与排斥反应的严重程度相关。

白细胞介素17主要是由Th17细胞分泌的，在其他CD4⁺ T细胞，CD8⁺ T细胞，自然杀伤细胞和中性粒细胞等也均有表达^[36-37]，但主要由Th17细胞分泌^[23]。白细胞介素17的主要作用是防御病原体，特别是真菌感染和细菌感染。在细菌感染过程种发现白细胞介素17的释放可以促进炎症反应，导致中性粒细胞的聚集，甚至在某些腹腔感染过程种可以形成脓肿。甚至及在特定条件导致脓肿形成。目前研究发现Th17细胞参与了排斥反应的发生，其主要方式可能是分泌促进炎症损伤的细胞因子，促进炎症的发生和进展。其在急性排斥反应的基础和临床研究中已被大量文献报道^[38-47]，证实白细胞介素17参与了急性排斥反应的发生，在机体发生急性排斥反应时表达升高，在对心脏移植物和肺移植物肺泡灌洗液中的白细胞介素17 mRNA水平与急性排斥反应程度的等级呈正相关。肿瘤性疾病研究中发现，白细胞介素17对肿瘤发生、发展和演进均具有重要的作用^[48-53]，参与了血管形成，局部炎症微环境的维持等。排斥反应与肿瘤疾病具有一定的相关性，即肿瘤是由于肿瘤细胞处于机体免疫相对较弱或免疫逃逸等因素使机体针对肿瘤处于耐受状态。而排斥反应是由于机体免疫趋于相对较强，移植物被识别并诱发强烈的免疫反应，处于一种免疫失衡的状态。因此研究肿瘤发生发展的过程中可以给临床移植研究一些启发，如何通过对移植物微环境进行调节，使得移植物可以像肿瘤一样，逃逸机体的免疫监视，更易于达到免疫耐受。因此在急性和慢性排斥反应中，研究白细胞介素17的作用，可能对更好的认识移植排斥反应发生的机制和过程，对于临床抗排斥反应的治疗具有十分重要的临床意义。

目前有关白细胞介素17在排斥反应中的报道主要集中于急性排斥，在慢性排斥反应中白细胞介素17的研究较少，而急性排斥和慢性排斥具有一定的联系，有报道认为反复的急性排斥可以导致移植器官间质纤维化，移植器官逐步丧失功能即发生慢性排斥。并且国内外很少有报道关于急性排斥和慢性排斥的共同研究。因此，作者通过设计本实验，研究肾移植急性和慢性排斥反应受者外周血单个核细胞中的白细胞介素17的转录水平表达，了解白细胞介素17在肾移植受者急性和慢性排斥反应中的作用，并探讨白细胞介素17与排斥反应的相关性。

本实验对急性和慢性排斥组排斥时间进行分析比较，发现慢性组排斥时间明显长于急性排斥组，这与慢性排斥发生的时间相对于急性排斥时间晚一致。然后，以肾移植后功能正常组作为参照发现，白细胞介素17mRNA在急性排斥组与稳定组相比，差异无显著性意义。而白细胞介素17 mRNA在慢性排斥组中的表达较稳定组升高了2.89倍，差异有显著性意义。由于急性排斥反应多集中在移植物及引流淋巴结局部，因此外周血单个核细胞相对多的是未接触抗原刺激的免疫细胞，尚未直接参与移植物排斥反应，而既往研究认为多数采用病理标本检测mRNA，因此易于得到阳性结果，但是其在诊断时间、操作难度均不优于病理结果，因此对于诊断急性排斥反应意义不大。并且外周血单个核细胞中mRNA水平可能由于急性排斥反应诊断前患者多数已按照经验给予抗排斥冲击治疗，掩盖了外周血单个核细胞中促炎因子的改变而出现阴性结果。同时本研究发现，白细胞介素17 mRNA水平在慢性排斥相关，可能原因是慢性排斥反应一直存在，外周血单个核细胞中识别移植物抗原的免疫细胞归巢增多，并且治疗过程中可能的掩盖因素较少，具有明显的相关性。

综上所述，实验探索了白细胞介素17 mRNA在肾移植排斥反应受者外周血单个核细胞中的表达情况并分析了其与血清肌酐、排斥时间等因素的相关性，对将来研究快速检测慢性排斥反应具有重要意义，并提示了白细胞介素17在诊断及防治排斥反应提供一个新的临床思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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白细胞介素17在肾移植排斥反应中的表达及意义

Expression and significance of interleukin-17 in rejection after kidney transplantation

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