Kruppel样因子6基因对巨噬细胞中胆固醇蓄积的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.013

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (51): 8269-8274.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.51.013

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Kruppel样因子6基因对巨噬细胞中胆固醇蓄积的影响

王慧清，张宗棨，黄文红，王晓菲，朱燕

上海交通大学医学院附属第三人民医院心电图室，上海市 201999

出版日期:2014-12-10 发布日期:2014-12-10
通讯作者: 朱燕，主治医师，上海交通大学医学院附属第三人民医院心内科，上海市 201999
作者简介:王慧清，女，1982年生，江苏省江阴市人，汉族，2006年徐州医学院毕业，医师，主要从事心脏电生理方面的研究。
基金资助:
国家青年科学基金项目(81200206)；上海市卫生局课题(2010073)

Effect of Kruppel-like factor 6 overexpression on cholesterol accumulation in macrophages

Wang Hui-qing, Zhang Zong-qi, Huang Wen-hong, Wang Xiao-fei, Zhu Yan

Department of Electrocardiogram, No. 3 People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201999, China

Online:2014-12-10 Published:2014-12-10
Contact: Zhu Yan, Attending physician, Department of Electrocardiogram, No. 3 People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201999, China
About author:Wang Hui-qing, Physician, Department of Electrocardiogram, No. 3 People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 201999, China
Supported by:
the National Science Fund for Distinguished Young Scholars, No. 81200206; the Project of Shanghai Health Bureau, No. 2010073

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明，Kruppel样因子6与巨噬细胞极化密切相关。但是，关于Kruppel样因子6在巨噬泡沫细胞形成中的作用尚不清楚。

目的：观察Kruppel样因子6过表达对氧化低密度脂蛋白刺激下的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)胆固醇蓄积及对ATP结合盒转运蛋白A1表达的影响。

方法：取Raw264.7巨噬细胞株分别转染慢病毒空载体和重组载体pCDH-KLF6，作为对照组和Kruppel样因子6组，另取稳定感染慢病毒空载体的Raw264.7巨噬细胞株和稳定感染重组载体pCDH-KLF6的Raw264.7巨噬细胞株均加入50 mg/L氧化低密度脂蛋白共孵育48 h后，得到氧化低密度脂蛋白组和Kruppel样因子6+氧化低密度脂蛋白组。

结果与结论：与对照组相比，氧化低密度脂蛋白组巨噬细胞内总胆固醇和胆固醇酯表达水平显著增加 (P <0.05)。与氧化低密度脂蛋白组巨噬细胞相比，Kruppel样因子6+氧化低密度脂蛋白组细胞内总胆固醇和胆固醇酯表达水平明显下降，胆固醇酯/总胆固醇明显降低(P <0.05)。而未加入氧化低密度脂蛋白处理的2组细胞内脂质表达水平少，且对照组与Kruppel样因子6组相比，细胞内脂质表达水平差异无显著性意义。提示Kruppel样因子6可能通过促进ATP结合盒转运蛋白A1的表达，抑制氧化低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬细胞胆固醇蓄积。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 巨噬泡沫细胞, Raw 264.7细胞, Kruppel样因子6, ATP结合盒转运体A1, 氧化低密度脂蛋白, 动脉粥样硬化, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recent studies have shown that Kruppel-like factor 6 (KLF6) gene is closely related to macrophage polarization. However, the role of KLF6 in the formation of macrophage foam cells is completely unknown.

OBJECTIVE: To investigate the effect of KLF6 gene on oxidized low density lipoprotein (ox-LDL)-induced cholesterol accumulation and expression of ATP binding cassette transporter A1 in RAW264.7 macrophages.

METHODS: RAW264.7 cell lines were transfected with lentiviral empty vector and recombinant vector carrying pCDH-KLF6, respectively, which acted as control group and KLF6 gene group. RAW264.7 cell lines stably transfected with lentiviral empty vector and recombinant vector carrying pCDH-KLF6 were cultured in 50 mg/L ox-LDL for 48 hours to establish ox-LDL group and ox-LDL+KLF6 group, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: The contents of total cholesterol and cholesterol ester in the ox-LDL group were significantly higher than those in the control group (P < 0.05) and the ox-LDL+KLF6 group (P < 0.05). In addition, the ratio of cholesterol ester to total cholesterol in the ox-LDL group was also lower in the ox-LDL+KLF6 group than the ox-LDL group (P < 0.05). However, the intracellular lipid level was lower in the control and KLF6 groups than in the two ox-LDL groups, and there was no difference between the control and KLF6 groups. These findings indicate that KLF6 can upregulate the expression of ATP binding cassette transporter A1 and inhibit the cholesterol accumulation induced by ox-LDL in RAW 264.7 macrophages．

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: lipoproteins, LDL, cholesterol, macrophages, Kruppel-like transcription factors

中图分类号:

R318

王慧清，张宗棨，黄文红，王晓菲，朱燕. Kruppel样因子6基因对巨噬细胞中胆固醇蓄积的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(51): 8269-8274.

Wang Hui-qing, Zhang Zong-qi, Huang Wen-hong, Wang Xiao-fei, Zhu Yan. Effect of Kruppel-like factor 6 overexpression on cholesterol accumulation in macrophages[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(51): 8269-8274.

图/表（结果） 3

2.1 稳定转染细胞株中Kruppel样因子6的表达水平实时PCR检测发现，Kruppel样因子6组(过表达组)Raw264.7巨噬细胞中Kruppel样因子6 mRNA的表达量较对照组平均高31.9倍，两者比较差异有显著性意义 (P < 0.05；图1A)。Western blot方法进一步检测2组细胞Kruppel样因子6蛋白的表达情况，发现在过表达组细胞株中Kruppel样因子6蛋白表达量较对照组平均增加31.8倍(P < 0.05，图1B)。说明稳定过表达Kruppel样因子6的Raw264.7细胞株构建成功。

2.2 过表达Kruppel样因子6对氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞内游离胆固醇及胆固醇酯表达水平的影响酶荧光学法检测结果显示，与对照组相比，氧化低密度脂蛋白组巨噬细胞内总胆固醇和胆固醇酯表达水平显著增加 (P < 0.05)。与氧化低密度脂蛋白组巨噬细胞相比，Kruppel样因子6+氧化低密度脂蛋白组细胞内总胆固醇和胆固醇酯表达水平明显下降，胆固醇酯/总胆固醇明显降低，且差异有显著性意义(P < 0.05)。而未加入氧化低密度脂蛋白处理的2组细胞内脂质表达水平少，且对照组与Kruppel样因子6组相比，细胞内脂质表达水平差异无显著性意义 (P > 0.05；表1)。

2.3 过表达Kruppel样因子6对巨噬细胞ATP结合盒转运蛋白A1 mRNA和蛋白表达的影响实时PCR结果显示，与对照组相比，Kruppel样因子6组巨噬细胞ATP结合盒转运蛋白A1 mRNA表达增加(P < 0.05)；而与对照组相比，氧化低密度脂蛋白组巨噬细胞ATP结合盒转运蛋白A1 mRNA的表达水平明显上升(P < 0.05)，且Kruppel样因子6+氧化低密度脂蛋白组细胞ATP结合盒转运蛋白A1 mRNA的表达水平较氧化低密度脂蛋白组显著增加 (P < 0.05；图2A)。并且Western blot结果显示，各组巨噬细胞ATP结合盒转运蛋白A1蛋白表达改变与mRNA上调变化一致。Kruppel样因子6+氧化低密度脂蛋白组巨噬细胞ATP结合盒转运蛋白A1蛋白表达较氧化低密度脂蛋白组细胞显著升高(P < 0.05；图2B)。

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引言

材料方法

设计：细胞分子生物学体外观察实验。

时间及地点：实验于2013年6月至2014年8月在上海交通大学附属第三人民医院中心实验室完成。

材料：

细胞：小鼠巨噬细胞株RAW264.7、293T人胚肾细胞株(293T细胞)均购自中科院上海细胞生物所细胞中心。

方法：

细胞培养：Raw264.7巨噬细胞及293T细胞均采用DMEM+体积分数10%胎牛血清培养基培养于37 ℃、体积分数5% CO₂饱和湿度培养箱。每24 h更换培养液，每两三天按照1∶3比例进行传代。

慢病毒表达载体的构建及鉴定：根据PubMed中查找的Kruppel样因子6(Mus musculus)基因信息(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/23849)及pCDH-CMV-MCS- EF1-copGFP载体多克隆位点信息，采用Primer Premier 5.0软件(加拿大Premier公司)设计合成PCR引物，上、下游引物分别引入限制性内切酶位点EcoRⅠ与BamHⅠ，序列为：F：5’- CCG GAA TCC ATG AAA CTT TCA CCT-3’，R：5’-CGC GGA TCC TCA GAG GTG CCT CTT-3’。培养293T细胞株，Trizol法提取RNA，反转录后引入上述引物进行Kruppel样因子6基因扩增。EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切pMIR-REPORT和上述PCR扩增产物，采用T₄DNA连接酶将线性化的pCDH-CMV-MCS- EF1-copGFP载体与Kruppel样因子6基因相连，转化大肠杆菌DH5 α，挑取单克隆，提取质粒，使用载体多克隆位点上游引物对重组质粒进行测序，分析插入片段序列信息(上海英骏生物技术公司)。对测序正确的重组表达载体命名为pCDH-KLF6。

慢病毒的包装及稳定细胞株的构建与筛选：取处于对数生长期的293T细胞，待其融合度达到80%时使用 Lipofectmaine 2000共转染表达载体pCDH-KLF6、psPAX2质粒和pMD2.G质粒(按照质量比4∶3∶1)到293T细胞，转染后6 h换回完全培养液，并于转染后48 h收集上清，8 000 r/min：离心10 min去除细胞沉淀，0.45 μm除菌滤膜过滤处理后加入1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物至终浓度为8 mg/L混匀，感染Raw264.7巨噬细胞(细胞密度达80%)48 h。嘌呤霉素筛选出稳定感染慢病毒空载体的Raw264.7巨噬细胞株(对照组)及重组载体pCDH-KLF6 Raw264.7巨噬细胞株(Kruppel样因子6组)。

氧化低密度脂蛋白干预：分别取对照组和Kruppel样因子6组Raw264.7巨噬细胞株(细胞密度达80%)加入 50 mg/L氧化低密度脂蛋白共孵育48 h后，分别得到氧化低密度脂蛋白组和Kruppel样因子6+氧化低密度脂蛋白组。

细胞内胆固醇表达水平测定^[21]：收集各组细胞，用PBS漂洗3次，用氯仿∶甲醇(体积比2∶1)的比例抽提细胞内的总胆固醇，按照胆固醇检测试剂盒说明书的步骤，采用酶荧光学法分别测定各组细胞内总胆固醇和游离胆固醇表达水平，总胆固醇与游离胆固醇之差为胆固醇酯的表达水平。BCA法检测各组细胞蛋白浓度；分别将各组细胞胆固醇量与蛋白浓度做出比值后，比较各组间的相对胆固醇浓度。

实时PCR法检测ABCA1 mRNA表达水平：收集各组细胞，按照Trizol说明书提取总RNA，应用分光光度计测定核酸浓度。取等量1 μg RNA分别按照PrimeScript^® RT reagent Kit Perfect Real Time及SYBR^® Premix Ex Taq^TM Ⅱ试剂盒说明书进行相应的反转录和实时荧光定量PCR反应。采用PCR-System-7500进行实时荧光定量PCR，反应结束后进行熔解曲线分析，将得出的Ct值按公式2^-^??Ct求出基因表达的相对变化量，再进行2组间比较。实验重复3次。PCR引物由上海生物工程技术有限公司合成：序列为：ABCA1：F：5’-AAA ACC GCA GAC ATC CTT CAG-3’，R：5’-CAT ACC GAA ACT CGT TCA CCC-3’；GAPDH： F：5’-ACC CAG AAG ACT GTG GAT GG-3’，R：5’-CAC ATT GGG GGT AGG AAC AC-3’。

Western blot检测ATP结合盒转运蛋白A1蛋白表达水平：提取各组细胞总蛋白，用Bradford法测蛋白含量^[22]。取20 μg蛋白上样到10% SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后电转移到PVDF膜上。5%脱脂牛奶封闭1 h，加入TBST稀释后的一抗，ATP结合盒转运蛋白A1和β-肌动蛋白一抗稀释比分别为1∶1 000和1∶2 000，4 ℃摇床孵育过夜。TBS-T漂洗5 min×3次，加入辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育1 h；TBS-T漂洗5 min×3次，ECL显色。采用Quantity One图像分析系统进行灰度扫描，以ATP结合盒转运蛋白A1蛋白与内参β-肌动蛋白的灰度值比值作为ATP结合盒转运蛋白A1蛋白的相对表达水平。

主要观察指标：Raw264.7巨噬细胞中Kruppel样因子6和ATP结合盒转运蛋白A1的表达水平，细胞内游离胆固醇及胆固醇酯的表达水平。

统计学分析：所有计量数据均以x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验，采用SPSS13.0统计软件(美国SPSS公司)进行统计学分析。以P <0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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动脉粥样硬化是一种严重危害人类生命健康的疾病，是心脑血管疾病的发病基础^[23-32]。血脂异常是一个重要的危险因素。由于血浆脂质水平升高促使大量脂质尤其是低密度脂蛋白胆固醇进入血管壁，并在局部沉积后经氧化修饰形成氧化低密度脂蛋白，激活血管内皮细胞，释放趋化因子，吸引循环中的单核细胞粘附继而进入血管壁分化为巨噬细胞，进而吞噬大量脂质后形成泡沫细胞^[33-40]。巨噬泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化斑块损伤形成、发展的关键，深入探索巨噬泡沫细胞在动脉粥样硬化形成过程中的机制对于早期阻断动脉粥样硬化发生发展具有重要意义。Kruppel样因子6基因是一个新发现的Kruppel样因子家族成员，在大多数组织、器官中均有表达，是一类具有锌指结构域的核转录因子，主要通过调控下游基因的转录而发挥其生物学功能，与生长发育、细胞分化、增生、凋亡、血管生成及组织修复等生理或病理过程有关^{[4，10，41-44]}。近年来大量研究证实了Kruppel样因子家族的一系列成员如Kruppel样因子2，4均与巨噬细胞极化、炎症和动脉粥样硬化形成密切相关^[45-48]。最新研究报道了Kruppel样因子6是巨噬细胞促炎信号的一个调节因子，能够调控巨噬细胞M1，M2表型转化，以及动脉粥样硬化密切相关的炎症递质基因如白细胞介素10，1的表达及释放^[19]。以上研究结果表明，Kruppel样因子6可能在动脉粥样硬化的发生发展中起到关键性的作用。但目前关于Kruppel样因子6在动脉粥样硬化病程中的具体病理作用及其调节机制均未见报道。文章分析过表达Kruppel样因子6抑制巨噬细胞内脂质聚集，降低细胞内胆固醇表达水平，减少泡沫细胞形成。既往研究表明泡沫细胞的形成与细胞胆固醇代谢失衡密切相关。胆固醇逆向转运过程是调节胆固醇稳态的关键环节，而胆固醇流出是胆固醇逆向转运的关键步骤^[9]。ATP结合盒转运蛋白A1是一种重要的细胞胆固醇外排蛋白，以ATP为能源介导细胞内游离胆固醇的流出，是泡沫细胞胆固醇流出的主要途径，具有抗动脉粥样硬化的重要作用^49]。以往研究将小鼠ATP结合盒转运蛋白A1基因敲除将会导致脂肪组织和巨噬细胞内大量的胆固醇沉积^[50]。并且，研究显示高表达ATP结合盒转运蛋白A1能够显著促进细胞内游离胆固醇流出，抑制泡沫细胞形成。然而，ATP结合盒转运蛋白A1功能障碍将导致细胞内游离胆固醇流出减少，大量的胆固醇沉积在巨噬细胞内成为泡沫细胞，继而促进动脉粥样硬化的发生发展^[51]。因此，调节ATP结合盒转运蛋白A1的表达是维持细胞胆固醇代谢平衡的关键。PPAR/LXR信号途径是调控ATP结合盒转运蛋白A1基因表达的关键信号途径^[52]。并且已有研究发现Kruppel样因子6通过靶向调控PPAR α、PPAR γ靶基因的表达，进一步调控脂代谢^[19^，^41]。重要的是，作者所在课题组通过生物信息学软件分析得知ATP结合盒转运蛋白A1基因启动子区含有多个Kruppel样因子6结合元件，提示Kruppel样因子6有可能通过与其结合调控ATP结合盒转运蛋白A1的表达，从而发挥抗动脉粥样硬化的作用，这一结果有待进一步实验验证。基于上述理论研究基础，实验发现过表达Kruppel样因子6能够促进细胞胆固醇转运蛋白ATP结合盒转运蛋白A1的转录和表达，这一研究不仅是对细胞内胆固醇稳态维持机制的阐明，也是对ATP结合盒转运蛋白A1参与动脉粥样硬化机制的探索。综上所述，Kruppel样因子6参与到斑块内巨噬细胞的脂质代谢中的具体机制。发现其可能通过促进ATP结合盒转运蛋白A1蛋白的表达加速巨噬细胞内胆固醇流出，减少泡沫细胞形成，延缓动脉粥样硬化的发生、发展，可为动脉粥样硬化等血管性疾病的防治提供新靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Kruppel样因子6基因对巨噬细胞中胆固醇蓄积的影响

Effect of Kruppel-like factor 6 overexpression on cholesterol accumulation in macrophages

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