玻璃酸钠及胎盘间充质干细胞和诱导的软骨细胞膝关节腔内注射：
修复膝骨关节炎

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.018

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (50): 8140-8146.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.50.018

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玻璃酸钠及胎盘间充质干细胞和诱导的软骨细胞膝关节腔内注射：
修复膝骨关节炎

李治¹，赵伟¹，刘伟²，周晔²，贾京桥³，杨立枫¹

沈阳医学院附属中心医院，1骨科，2产科，辽宁省沈阳市 110024；3辽宁省维尔克干细胞生物科技有限公司，辽宁省本溪市 117000

收稿日期:2014-10-10 出版日期:2014-12-03 发布日期:2014-12-03
通讯作者: 杨立枫，副主任医师，沈阳医学院附属中心医院骨科，辽宁省沈阳市 110024
作者简介:李治，男，1973年生，汉族，辽宁省沈阳市人，吉林大学在读博士，主任医师，主要从事干细胞治疗脊髓及神经损伤的研究。
基金资助:
辽宁省科技厅科研项目(2012225014)

Intra-articular injection of sodium hyaluronate versus placenta-derived mesenchymal stem cells-differentiated chondrocytes for treatment of knee osteoarthritis

Li Zhi¹, Zhao Wei¹, Liu Wei², Zhou Ye², Jia Jing-qiao³, Yang Li-feng¹

1Department of Orthopedics, 2Department of Obstetrics, Fengtian Hospital of Shenyang Medical University, Shenyang 110024, Liaoning Province, China; 3WELLCARE Stem Cell Biotechnology Co., Ltd., Benxi 117000, Liaoning Province, China

Received:2014-10-10 Online:2014-12-03 Published:2014-12-03
Contact: Yang Li-feng, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Fengtian Hospital of Shenyang Medical University, Shenyang 110024, Liaoning Province, China
About author:Li Zhi, Studying for doctorate, Chief physician, Department of Orthopedics, Fengtian Hospital of Shenyang Medical University, Shenyang 110024, Liaoning Province, China
Supported by:
the Project of Liaoning Science and Technology Department, No. 2012225014

摘要/Abstract

摘要：

背景：胎盘间充质干细胞已被证实具有较强的增殖能力，能向神经细胞、血管内皮细胞、表皮细胞以及胰岛样细胞等诱导分化，但向软骨细胞诱导分化并修复膝骨关节的研究不多。
目的：人胎盘间充质干细胞体外诱导软骨细胞膝关节腔内注射修复兔膝骨关节炎，并比较璃酸钠和胎盘间充质干细胞膝关节腔内注射的修复效果。
方法：①选新西兰大白兔制作骨关节炎模型，左后肢膝关节炎造模后石膏固定5.5周，镜下观察关节软骨情况。②利用Ⅳ型胶原酶消化分离培养人胎盘间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面标志物，证实为胎盘间充质干细胞。取第3代胎盘间充质干细胞进行实验，将胎盘间充质干细胞加入软骨诱导培养基向软骨细胞分化，倒置显微镜观察结果。③将大白兔随机分成玻璃酸钠膝关节腔内注射组、胎盘来源间充质干细胞膝关节腔内注射组和诱导软骨细胞膝关节腔内注射组，分别给予膝关节腔内注射，连续5周取膝关节软骨镜下观察，比较软骨修复情况。
结果与结论：体外诱导培养的人胎盘间充质干细胞增殖形成大量贴壁细胞，贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态；应用软骨诱导培养基培养后，细胞只保持微团，不继续增殖形成贴壁细胞，微团基部无贴壁细胞，显示人胎盘间充质干细胞可以分化为软骨细胞。苏木精-伊红染色镜下观察发现，各组兔膝关节软骨细胞均有修复，诱导软骨细胞膝关节腔内注射后兔膝关节软骨修复情况较好，优于玻璃酸钠和胎盘间充质干细胞膝关节腔内注射组。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 胎盘间充质干细胞, 玻璃酸钠, 软骨细胞, 膝骨关节, 动物模型, 细胞培养, 体外诱导, 苏木精-伊红染色, 胶原酶, 细胞微团

Abstract:

BACKGROUND: Placenta-derived mesenchymal stem cells have been shown to have a strong proliferative capacity, which can be induced to differentiate into nerve cells, vascular endothelial cells, epithelial cells and islet-like cells, but there are few studies about the chondrogenic differentiation in the treatment of knee osteoarthritis.
OBJECTIVE: To compare the intra-articular injection of sodium hyaluronate and placenta-derived mesenchymal stem cells-induced chondrocytes for treatment of knee osteoarthritis.
METHODS: (1) Knee osteoarthritis models were established in the left hind of New Zealand white rabbits. After
5.5 weeks of plaster fixation, the articular cartilage was observed under microscope. (2) Human placenta-derived mesenchymal stem cells were isolated and cultured using IV collagenase digestion, and flow cytometry was used to detect cell surface markers to identify the placenta-derived mesenchymal stem cells. Passage 3 placenta-derived mesenchymal stem cells were cultured in chondrocyte induction medium and observed under inverted microscope. (3) The rabbits were randomly divided into sodium hyaluronate group, placenta-derived mesenchymal stem cells group, and induced chondrocyte group, and then intra-articular injection of sodium hyaluronate, placenta-derived mesenchymal stem cells, and induced chondrocyte was given, respectively. After 1-5 weeks, the knee cartilage was taken and observed under microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: In vitro cultured human placenta-derived mesenchymal stem cells proliferated to produce a large amount of adherent cells with typical mesenchymal cell morphology; after culture in inducing culture medium, cells presented with micelles and could not proliferate to form adherent cells. There were no adherent cells on the micelles base, showing human placenta-derived mesenchymal stem cells can differentiate into chondrocytes. Under hematoxylin-eosin staining, rabbit articular cartilage was repaired in all the groups, but the intra-articular injection of chondrocytes differentiated from placenta-derived mesenchymal stem cells were better than the intra-articular injection of sodium hyaluronate and placenta-derived mesenchymal stem cells.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cells, chondrocytes, osteoarthritis, knee

中图分类号:

R394.2

李治，赵伟，刘伟，周晔，贾京桥，杨立枫. 玻璃酸钠及胎盘间充质干细胞和诱导的软骨细胞膝关节腔内注射：
修复膝骨关节炎[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(50): 8140-8146.

Li Zhi, Zhao Wei, Liu Wei, Zhou Ye, Jia Jing-qiao, Yang Li-feng. Intra-articular injection of sodium hyaluronate versus placenta-derived mesenchymal stem cells-differentiated chondrocytes for treatment of knee osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(50): 8140-8146.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

骨性关节炎是骨科临床上的常见病，膝关节是骨性关节炎最常累及的部位之一，以往的治疗方法大多只能短期缓解症状，而人工关节置换的治疗创伤较大。玻璃酸钠又称透明质酸钠，是由葡萄糖醛酸和乙酰氨基己糖组成双糖单位聚合而成的一种黏多糖，是关节滑液的主要成分，也是软骨基质的成分之一，在关节腔润滑、覆盖屏障及缓冲应力方面发挥作用，已经成为治疗膝骨性关节炎的有效药物^[1-2]。

骨髓间充质干细胞由于在体外培养方法简单，增殖速度较快，能分化脂肪、神经和内皮等多种组织细胞，可用于修复组织损伤，是目前种子细胞研究的热点^[3]，由于成人和胎儿体内存在的骨髓间充质干细胞含量低，随着年龄增长细胞增殖能力也逐渐下降，细胞数量逐渐降低^[4]，而且捐献者数量有限，取材为有创侵入性操作，限制了骨髓间充质干细胞的研究^[5-8]。

胎盘是在胎儿分娩后的废弃物，人胎盘间充质干细胞(human placental mesenchymal stem cell，hPMSC)是来源于中胚层的多能干细胞，具有较好的增殖能力和多向分化潜能，免疫原性低，来源充足，细胞数量较多，已经成为组织工程的重要细胞来源^[9-11]。以往研究证明胎盘间充质干细胞表达CD44、CD29，不表达CD34、CD106^[12]，与骨髓间充质干细胞表达的特异性表面标记相同，可以向多个胚层细胞系转化^[13]。

本实验从足月胎盘中获取胎盘间充质干细胞，利用Ⅳ型胶原酶消化分离培养，流式细胞仪检测细胞表面标志物，将第3代胎盘间充质干细胞加入软骨诱导培养基，向软骨细胞诱导分化，比较玻璃酸钠、胎盘来源间充质干细胞和诱导的软骨细胞膝关节腔内注射修复兔膝关节软骨情况，为临床上治疗人膝关节炎软骨损伤提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外对比实验。

时间及地点：实验于2013年10月至2014年5月在沈阳医学院附属中心医院实验室完成。

材料：

胎盘：经沈阳医学院附属中心医院伦理委员会批准，在产妇知情同意的情况下，胎盘组织由沈阳医学院附属中心医院产科获取临床正常剖宫产之足月健康产妇的新鲜胎盘组织，产妇身体健康，梅毒、HIV、CMV、HBSAg、HCV检测均为阴性，无传染性疾病及妊娠并发症史。

培养基：软骨诱导培养基(chondrogenesis differentiation medium)，含10 μg/L 转化生长因子β3，100 μg/L胰岛素，10^-⁷ mol/L地塞米松，6.25 mg/L转铁蛋白，50 μg/L维生素C，H-DMEM培养基等。

实验动物：选新西兰大白兔60只，体质量2.5-3.0 kg，雌雄不限。由沈阳药科大学提供，许可证号：SCXK(辽) 2014-0002。饲养于沈阳医学院附属中心医院动物实验室，湿度60%，温度(22±1) ℃，应用紫外线灯进行空气消毒，流动净化空气，单兔单笼饲养。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

兔给予左侧膝关节伸直位石膏加铝板固定5.5周，密切观察防止动物左腿被石膏卡压坏死。

方法：

胎盘间充质干细胞的获取：利用Ⅳ型胶原酶消化分离培养人胎盘间充质干细胞^[14]。在无菌条件下取胎盘的胎儿面蜕膜组织，用磷酸盐缓冲液反复冲洗，冲洗干净无血迹后用剪刀将其剪碎，剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎片，然后加入1%Ⅳ型胶原酶10 mL，37 ℃水浴消化30 min。消化完成后用DMEM中止消化，充分均匀吹打后用100目筛网过滤，然后将过滤得到的细胞悬液离心(1 200 r/min离心 5 min)，弃上清，加入完全培养基(含低糖DMEM，体积分数为10%胎牛血清，1%双抗)10 mL，计数板计数后调整细胞浓度，以3×10⁸ L^-¹的细胞浓度接种至细胞培养瓶中，置于37 ℃、含体积分数5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养，3 d后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每三四天换液1次，待细胞生长铺满至瓶底80%-90%时按常规方法进行传代。倒置显微镜下观察细胞形态。

胎盘间充质干细胞的鉴定：取第3代胎盘间充质干细胞，以0.25%胰酶消化3 min后制成单细胞悬液，分别加入抗人CD44、CD90、CD73、CD105、CD14、CD34和CD45的单克隆抗体，冰上避光反应20 min，PBS洗2次后离心 5 min(4 ℃，1 000 r/min)，弃上清，加入2 mL冷PBS吹打混匀，用流式细胞仪检测其细胞表面标志物。

胎盘间充质干细胞体外诱导成软骨细胞：用胰酶将胎盘来源间充质干细胞洗下，生理盐水离心洗涤2次。用MSC Attachment medium将细胞重悬至1.6×10¹⁰ L^-¹，小心滴不同数量的重悬细胞至24孔板中央，周围加生理盐水，置于生物安全柜培养2 h(目的是形成微团)。然后加入软骨诱导培养基1.0-2.0 mL，置于37 ℃、含体积分数5% CO₂的培养箱中培养，两三天换液。

细胞培养14 d后，用40 g/L多聚甲醛固定，阿利新蓝染色，数码相机照相。倒置显微镜观察细胞形态。

实验动物造模、分组及膝关节腔内注射：选新西兰大白兔制作骨关节炎模型，给予左侧膝关节伸直位石膏加铝板固定，5.5周后模型制作完成。骨关节炎模型制作成功后，镜下观察损伤关节软骨情况。

按随机数字表法将新西兰大白兔随机分为3组，每组20只。A组玻璃酸钠膝关节腔内注射组；B组胎盘来源间充质干细胞膝关节腔内注射组；C组胎盘来源间充质干细胞诱导的软骨细胞膝关节腔内注射组。

各组分别给予直视下膝关节腔内注射。A组：玻璃酸钠注射液专用注射器0.2 mL膝关节腔内注射；B组：胎盘来源间充质干细胞(第3代)1.5×10⁵ L^-¹，使用微量注射器，膝关节腔内注射0.2 mL，C组：胎盘来源间充质干细胞诱导的软骨细胞1.5×10⁵ L^-¹，使用微量注射器，膝关节腔内注射0.2 mL。注射1周后取膝关节软骨镜下观察，连续取5周，比较软骨修复情况。

苏木精-伊红染色：兔膝骨关节炎造模后以及膝关节腔内注射1-5周后关节软骨情况应用苏木精-伊红染色镜下观察，数码相机照相。

主要观察指标：胎盘间充质干细胞的鉴定以及诱导分化软骨细胞的形态，各组膝关节腔内注射后关节软骨修复情况。

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讨论

种子细胞的来源一直是限制软骨组织工程发展的主要瓶颈，目前常用的种子细胞有很多，如胚胎干细胞、脂肪干细胞、脐带间充质干细胞以及肌肉、滑膜取材分离的干细胞等，这些细胞在研究过程中均有一些缺陷存在，使其不能满足临床治疗需要^[15-16]。胎盘来源获得的间充质干细胞体积大，细胞数量多，科研成本低廉，不涉及伦理问题，而且胎盘间充质干细胞增殖能力强，免疫原性弱，具有向软骨细胞分化的能力，是组织工程研究较为理想的种子细胞^[17-20]。

胎盘间充质干细胞的分离培养有多种方法，本文采用胶原酶消化法分离培养，3 d后成功分离培养胎盘间充质干细胞，倒置显微镜观察显示，细胞增殖形成大量贴壁细胞，细胞形态为纺锤体型，折光性强，与骨髓间充质干细胞具有相似的细胞形态。流式细胞检测，分离培养的胎盘间充质干细胞表达干细胞表面标志物，CD90、CD44、CD105和CD73阳性表达，造血干细胞的标志物CD34、CD14和CD45不表达。

国内外相关研究发现，胎盘间充质干细胞移植可以提高兔骨缺损的修复^[21]。卢遥等^[22]研究兔胎盘来源间充质干细胞修复兔桡骨节段性骨缺损的能力，并将胎盘来源间充质干细胞与骨髓基质干细胞构建的组织工程化骨进行比较，X射线评分比较差异均无统计学意义(P > 0.05)，胎盘来源间充质干细胞与骨髓基质干细胞构建的组织工程化骨都可以较快的修复长骨临界大小节段性骨缺损，具有相似的生物学特性和成骨特性。

钱寒光等^[23]观察胎盘间充质干细胞联合丝素蛋白/羟基磷灰石材料修复节段性骨缺损的效果，植入后4周时新骨已开始形成，8周时骨缺损部分修复，12周时有部分新生骨组织形成板层骨，骨小梁形成，内可见大量成骨细胞，影像学检测骨缺损区完全修复，说明丝素蛋白/羟基磷灰石材料与胎盘间充质干细胞联合移植能够较好修复兔桡骨缺损。

以上实验均应用胎盘间充质干细胞促进兔骨缺损修复，与本实验方法相似。本文将玻璃酸钠、胎盘来源间充质干细胞以及诱导软骨细胞膝关节腔内注射修复软骨情况进行比较，诱导的软骨细胞膝关节腔内注射3周，关节软骨表面光滑、平整，无充血、无糜烂，关节软骨4层结构清晰，软骨表层以及中层增厚，尤其以表层增厚明显，表细胞增多，细胞排列较规整，潮线清晰。5周后关节软骨表层以及中层细胞成熟，细胞排列整齐，潮线清晰，完整可见。诱导软骨细胞膝关节腔内注射后兔膝关节软骨修复情况较好，优于玻璃酸钠和胎盘间充质干细胞膝关节腔内注射组。

总之，关节软骨损伤后自我修复能力有限^[24-25]，目前临床上用于治疗软骨损伤或关节退行性改变的方法和药物的远期治疗效果不佳，均难以达到满意的疗效。组织工程方法修复治疗软骨损伤或并节退行性改变是目前研究的热点^[26-27]。胎盘间充质干细胞具有大规模培养的可能，可以成为组织工程的理想种子细胞。胎盘间充质干细胞诱导的软骨细胞对兔膝关节炎修复作用较好，但此实验尚处于初级阶段，还需要进一步深入研究。

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大量的体外实验证明，在不同诱导条件下，脐血间充质干细胞不仅可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞等，还可以向外胚层和内胚层来源的神经元样细胞和肝细胞样细胞分化。

成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞：脐血间充质干细胞向中胚层来源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化的实验研究较多，除了培养基有所不同外，使用的诱导剂大致相同。在IMEM中加入地塞米松、维生素H可以诱导传代后的人脐血间充质干细胞向成骨细胞分化。在高糖DMEM中加入胰岛素、转铁蛋白、牛血清蛋白、丙酮酸钠、维生素H等可诱导脐血间充质干细胞向成软骨细胞分化。在含10%浓度兔血清的IMDM培养基中加入重组人胰岛素、地塞米松、吲哚美辛，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤可诱导脐血间充质干细胞向脂肪细胞分化。

神经细胞：在IMDM培养基中加入碱性成纤维生长因子(bFGF)、酸性成纤维生长因子(aFGF)、维甲酸、2-巯基乙醇、环磷酸腺苷(cAMP)、维生素H、氢化可地松、脑源性生长因子(BONF)、神经生长因子(NGF)等可诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化。

肝细胞:以IMDM为培养基加入肝细胞生长因子(HGF)、地塞米松可诱导脐血间充质干细胞向肝细胞分化。在上述培养基的基础上又加入了成纤维生长因子，发现63.6%的细胞逐渐变小、变圆，12天以后甲胎球蛋白、白蛋白、尿素值逐渐升高，表明诱导分化成为肝细胞。

骨骼肌细胞：在体外诱导因素的作用下，脐血间充质干细胞也可定向分化为骨骼肌细胞。从脐带血中分离出间充质干细胞，培养传代移入加有马血清、地塞米松和氢化可的松的培养基中，3天后表达MyoD和成肌素myogcnin早期成肌细胞标记，6周后表达肌球蛋白重链，表明脐血间充质干细胞具有分化为骨骼肌细胞的潜能。

心肌细胞:国内有学者用5-氮杂胞嘧啶核苷作为诱导剂在体外将脐血间充质干细胞诱导分化为心肌细胞。但因为5-氮杂胞嘧啶核苷是生物制剂，对细胞有毒性作用，所以大剂量应用时发现有半数以上心肌细胞死亡，又有学者用条件培养液作为诱导剂成功诱导出心肌细胞。

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玻璃酸钠及胎盘间充质干细胞和诱导的软骨细胞膝关节腔内注射： 修复膝骨关节炎

Intra-articular injection of sodium hyaluronate versus placenta-derived mesenchymal stem cells-differentiated chondrocytes for treatment of knee osteoarthritis

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修复膝骨关节炎