I型神经纤维瘤病萎缩区椎体终板软骨细胞体外分离培养及表型鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.46.004

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (46): 7396-7400.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.46.004

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I型神经纤维瘤病萎缩区椎体终板软骨细胞体外分离培养及表型鉴定

刘学光¹，邱勇²，孙振中¹，钱邦平²，王守丰²

¹无锡市第九人民医院骨科、无锡市手外科医院，江苏省无锡市 214064；²南京大学附属南京鼓楼医院脊柱外科，江苏省南京市 210008

修回日期:2014-10-04 出版日期:2014-11-12 发布日期:2014-11-12
通讯作者: 孙振中，主任医师，无锡市第九人民医院、无锡市手外科医院，江苏省无锡市 214064
作者简介:刘学光，男，1984年生，安徽省蚌埠市人，汉族，2011年南京大学毕业，硕士，医师，主要从事脊柱外科、创伤骨科研究。
基金资助:
江苏省自然科学基金(BK 2010109)

Culture and identification of chondrocytes isolated from the vertebral endplate of patients with type I neurofibromatosis associated with atrophic changes in vitro

Liu Xue-guang¹, Qiu Yong², Sun Zhen-zhong¹, Qian Bang-ping², Wang Shou-feng²

¹Department of Orthopedics, Wuxi No. 9 People’s Hospital (Wuxi Hand Surgery Hospital), Wuxi 214064, Jiangsu Province, China; ²Department of Spine Surgery, Drum Tower Hospital, Nanjing University Medical College, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China

Revised:2014-10-04 Online:2014-11-12 Published:2014-11-12
Contact: Sun Zhen-zhong, Chief physician, Department of Orthopedics, Wuxi No. 9 People’s Hospital (Wuxi Hand Surgery Hospital), Wuxi 214064, Jiangsu Province, China
About author:Liu Xue-guang, Master, Physician, Department of Orthopedics, Wuxi No. 9 People’s Hospital (Wuxi Hand Surgery Hospital), Wuxi 214064, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK 2010109

摘要/Abstract

摘要：

背景：以往主要是针对肋软骨、关节软骨、鼻中隔软骨、耳软骨等透明软骨进行研究，而对人椎体终板软骨的体外培养尚不多见。

目的：探讨Ⅰ型神经纤维瘤病伴萎缩性脊柱侧凸患者萎缩区椎体终板软骨细胞体外分离培养的可行性，并对其生物学特性进行观察。

方法：对术中取得的7例Ⅰ型神经纤维瘤病伴萎缩性脊柱侧凸患者顶椎区椎体终板软骨采用两步酶消化结合组织块法进行体外分离培养。细胞传代后倒置相差显微镜下观察细胞形态；Ⅱ型胶原免疫组化染色对软骨细胞进行鉴定；MTT比色法测定细胞增殖情况，描绘第2代软骨细胞的生长曲线。

结果与结论：软骨组织培养2周后周围开始有软骨细胞爬出，再经1周左右可以传代。随着传代次数的增加，软骨细胞逐渐由多角形、圆形、三角形和不规则形变为梭形，折光性下降。Ⅱ型胶原免疫组化染色可见细胞核周围被染成棕褐色。MTT比色法检测显示，第2代终板软骨细胞的生长曲线近似倒“S”形，在第4-7天进入快速增殖期，细胞呈对数生长；到第8-13天达平台期，细胞增殖停止；从第14天开始出现生长抑制。结果显示采用两步酶消化结合组织块法能够培养出纯度高，活性好的终板软骨细胞。第2代终板软骨细胞在第4-7天活力最好，增殖力旺盛，可以作为研究Ⅰ型神经纤维瘤病伴萎缩性脊柱侧凸发病机制的观察点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 软骨细胞, 神经纤维瘤病, 细胞培养, 终板, 表型, 江苏省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have mainly focused on costal cartilage, articular cartilage, nasal septal cartilage, and auricular cartilage, but in vitro culture of human vertebral endplate cartilage is still rarely reported.

OBJECTIVE: To discuss the feasibility of culture of vertebral endplate chondrocytes from type I neurofibromatosis associated with scoliosis patients in vitro and to study the biological characters of the chondrocytes.

METHODS: Through two-step enzymatic digestion and tissue culture, the chondrocytes from the vertebral endplate of seven type I neurofibromatosis patients isolated and cultured in monolayer and passaged to observe the changes of cell morphology under inverted phase contrast microscope. Collagen type II expression was detected by immunocytochemistry to identify whether the cells had chondrocyte characters. The growth kinetics was detected by using MTT colorimetric assay to draw the growth curve of passage 2 chondrocytes.

RESULTS AND CONCLUSION: A few chondrocytes crawled from the cartilage after 2 weeks culture and cells were passaged at 3 weeks. Along with passage going on, the phenotype of chondrocytes was changed from polygonal, round, triangle, and irregular shapes to fusiform. The collagen type II expression in passage 2 cells was positive by immunohistochemical staining. MTT test showed the growth curve of the passage 2 chondrocytes presented a transverse “S”. Cells were found logarithmic growth at days 4-7, reached platform stage at days 8-13, and decreased at day 14. It is an effective and simple procedure by two-step enzymatic digestion and tissue explant method to culture vertebral endplate chondrocytes with high purity and good viability from type I neurofibromatosis patients associated with scoliosis in vitro. Passage 2 chondrocytes from the vertebral endplate exhibit the best viability at days 4-7, which can be used as targets for research of pathogenesis of type I neurofibromatosis with atrophic scoliosis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: neurofibromatosis 1, chondrocytes, cells, cultured

中图分类号:

R318

刘学光，邱勇，孙振中，钱邦平，王守丰. I型神经纤维瘤病萎缩区椎体终板软骨细胞体外分离培养及表型鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(46): 7396-7400.

Liu Xue-guang, Qiu Yong, Sun Zhen-zhong, Qian Bang-ping, Wang Shou-feng. Culture and identification of chondrocytes isolated from the vertebral endplate of patients with type I neurofibromatosis associated with atrophic changes in vitro [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(46): 7396-7400.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：实验于2009年8月至2011年3月在南京大学医学院附属南京鼓楼医院实验室完成。

材料：DMEM培养液(低糖，pH 7.2，Gibco)，胎牛血清(Gibco)，0.2%Ⅱ型胶原酶(Gibco)，0.25%胰蛋白酶- 0.02%EDTA(Gibco)，双抗(青霉素、链霉素)(Sigma)，噻唑蓝(MTT)试剂盒(南京凯基)，二甲基亚砜(南京凯基)，兔抗人Ⅱ型胶原抗体(一抗，武汉博士德)、山羊抗兔IgG(二抗，北京博奥森)，链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合体(SABC)免疫组织化学试剂盒(北京博奥森)，DAB显色试剂盒(北京博奥森)，CO₂细胞培养箱(Thermo Forma)，倒置相差显微镜及照相系统(Olympus)，酶标仪(Sunrise)。

实验方法：

软骨细胞的分离与培养：在7例Ⅰ型神经纤维瘤病伴萎缩性脊柱侧凸患者行前路骨骺阻滞手术时取得顶椎区椎体终板软骨，将术中获得的标本置于无菌PBS中，带入实验室后，在超净台内仔细去除终板软骨两侧的结缔组织和骨组织，无菌PBS冲洗干净。先用手术刀将终板软骨切成小的薄片，再用眼科剪将软骨片剪成细小颗粒，在37 ℃的恒温摇床上，先用约10倍体积的0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA消化30 min，PBS冲洗干净，再用10倍体积的0.2%Ⅱ型胶原酶消化5 h。当消化液由清逐渐变混浊，软骨块变得蓬松后，再次用PBS冲洗。将经过两步酶消化处理后的软骨块均匀贴在25 cm²培养瓶下壁，然后放置在培养箱内20-30 min，待软骨块贴牢培养瓶下壁后，加入5 mL完全培养基(含青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/L)，置于含体积分数为5%CO₂、恒温37 ℃、饱和湿度条件的培养箱内培养，第1次换液在培养1周后，以后每周2次换液。当细胞增殖到铺满培养瓶底的80%-90%后传代，传代时加入 1 mL 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，边消化边在显微镜下观察，当70%左右的贴壁细胞被消化下来时，加入 2 mL培养基终止消化，用吸管吹打3次，使贴壁细胞完全脱落下来成为单细胞悬液，计数后离心，按1∶2或1∶3传代。

软骨细胞的形态学观察及表型鉴定：

相差显微镜观察：传代后每日在倒置相差显微镜下观察软骨细胞的形态学变化，并拍摄照片。

软骨细胞的鉴定(SABC免疫组化法)：将盖玻片提前用体积分数为75%乙醇浸泡过夜后置于6孔培养板内，用细胞爬片技术，把第2代软骨细胞按2.4×10⁵/孔接种于放有盖玻片的培养板内培养，待细胞培养至70%融合时取出爬片，用50 g/L多聚甲醛固定20 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡 5 min，体积分数为3%过氧化氢去离子水孵育15 min，灭活内源性过氧化物酶，再用山羊血清室温封闭20 min，甩去多余液体。滴加1∶100的一抗，4 ℃条件下过夜(阴性对照以PBS代替一抗)，然后PBS冲洗3次。滴加1∶100的二抗，37 ℃恒温孵育20 min，PBS冲洗3次。滴加SABC，再次37 ℃恒温孵育20 min。PBS冲洗4次。DAB显色(按说明书流程操作)，蒸馏水洗涤，苏木精复染5 min，充分水洗。梯度乙醇脱水，二甲苯透明、封固。

描绘生长曲线(MTT法)：取第2代软骨细胞计数后接种于96孔培养板中，每孔细胞数为1.6×10⁴，每组设6个复孔，共接种15组，空白调零孔加0.1 mL完全培养基，置于细胞培养箱中培养，72 h后第1次换液，以后隔天换液。每天取出6孔进行检测，加入MTT(1 g/L)溶液50 μL，37 ℃孵育 4 h，弃去上清液，加入150 μL二甲基亚砜溶解紫蓝色结晶，摇床振摇5 min，置于570 nm波长酶标仪测定吸光度值。将各孔吸光度值减去空白调零孔吸光度值，取每组6孔的均值。以时间为横轴，吸光度值为纵轴绘制第2代软骨细胞生长曲线。

主要观察指标：软骨细胞的形态及生长状态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

Ⅰ型神经纤维瘤病患者骨骼异常的发病率高达50%，营养不良性改变是Ⅰ型神经纤维瘤病患者骨骼异常的主要特征^[18]。对于其发病机制，以前的推测主要有硬脊膜扩张因素、肿瘤破坏因素、骨密度因素等^[18-19]。Bernick等^[20]通过对NF1^prx1(NFt ^+/^-)小鼠生长板软骨细胞的研究认为，其增殖率降低，并同时存在细胞分化缺陷。椎体终板是位于椎间盘与椎体间的一层薄的纤维软骨，在脊柱纵向生长发育过程中椎体的生长需通过终板软骨的软骨内骨化来完成。如果椎体终板软骨存在功能异常，必将引起椎体的生长发育障碍，最终导致脊柱畸形。体外细胞培养技术，是在无菌，适宜的温度、湿度以及一定营养条件下，模拟机体内的生理环境，使活体的结构成分在体外环境中得以生存和生长，并维持其结构和功能。本文通过体外培养Ⅰ型神经纤维瘤病伴萎缩性脊柱侧凸患者椎体终板软骨细胞的方法可以从细胞水平探索椎体终板软骨细胞的生物学特性，从而为进一步研究Ⅰ型神经纤维瘤病伴萎缩性脊柱侧凸发病原理提供条件。

3.1 终板软骨细胞的分离培养随着对软骨细胞体外分离技术研究的深入，软骨细胞消化方法随之出现，其中常用方法之一便是应用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶的两步酶消法。但单纯采用两步酶消法分离软骨细胞，存在以下不足：①传统的两步酶消化法消化时间较长，一般需过夜，在一定程度上不利于细胞的生长。②Ⅱ型胶原酶在消化软骨细胞的过程中消化时间无法掌握。③软骨细胞容易出现退变现象，造成实验结果不准确。④软骨细胞的生长周期长，延误实验进程且容易被污染等，因此两步酶消法体外分离培养软骨细胞的方法依然存在挑战。Manning等^[21]利用细菌胶原酶和胰蛋白酶联合消化法首次分离得到软骨细胞，此后软骨细胞的体外培养技术不断改进并渐趋成熟。张艳等^[22]利用不同浓度Ⅱ型胶原酶分别消化肋软骨和人残耳软骨标本16 h，细胞获得率分别为(0.464±0.09)×10⁶/g和(1.54±0.14)×10⁶/g。宋卫东等^[23]改良了软骨细胞培养方法，先用0.25%胰蛋白酶消化软骨片0.5 h，继以0.30%胶原酶消化4 h，将细胞悬液和未过滤下来的软骨片共同培养，所得细胞活性率为100%。黄爱兵等^[24]采用同样的方法处理人髂软骨，细胞得率为(0.51±0.15)×10⁶/g，存活率达到90%。田峰等^[25]应用改良分步消化法培养兔膝关节原代软骨细胞，缩短了消化时间，同时其细胞生长及形态变化均无改变，可以顺利获取大量纯净的软骨细胞。本实验借鉴目前常用的两步酶消化法处理软骨组织，先用胰酶进行非特异性消化30 min，除去在修剪软骨的过程中可能混入的杂质，同时可以使软骨块表面变得疏松，以利于Ⅱ型胶原酶的消化，接着再用Ⅱ型胶原酶消化5 h，溶解细胞间基质，将消化液过滤并与组织块共同培养。

3.2 终板软骨细胞的鉴定软骨由细胞外基质和软骨细胞构成，软骨细胞在软骨的生长及功能代谢中起着重要作用，是软骨组织的主要细胞成分。细胞外基质是软骨细胞生长和代谢的场所，也是评价细胞生物学功能活性的主要指标^[26-29]。Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖是两大特异性软骨细胞基质成分^[30-33]，Ⅱ型胶原是软骨细胞分泌的主要成分之一，Ⅱ型胶原的合成与分泌是评估软骨细胞维持其分化表型的一项重要指标^[34]。因此通过对Ⅱ型胶原的免疫组化染色，说明本法分离所获得的终板软骨细胞具有良好的软骨细胞生物学特性。

3.3 MTT比色法检测细胞增殖情况生长周期的测定对于设计实验方案非常重要，从细胞生长曲线的形状也可获得其增殖潜力的信息。本实验研究表明第2代终板软骨细胞的潜伏期为1-3 d，在这一期间细胞可有活动，增殖缓慢，少见分裂相。指数增生期在第4-7天，此期是活力最好的时期，是进行各种实验最好的和最主要的阶段。到第8-13天时，细胞数量达到饱和密度，进入缓慢增殖期。此时若不传代，由于细胞的相互接触而产生接触抑制、代谢产物积累、pH值降低，细胞会发生中毒，进入生长抑制期。因此，与椎体终板软骨细胞相关的实验研究观察点定在第4-7天较为合适。

本研究表明，采用两步酶消化结合组织块法体外分离培养Ⅰ型神经纤维瘤病伴脊柱侧凸患者萎缩区椎体终板软骨细胞，操作简单，切实可行，能在短时间内获得纯度高、活性好的软骨细胞，为更深入地从细胞水平研究Ⅰ型神经纤维瘤病伴萎缩性脊柱侧凸提供了可靠有效的方法。实验结果显示第2，3代细胞增殖能力旺盛，其指数生长期是在第4-7天，这个时期细胞增殖活力强，是进行相关实验研究的最佳时期。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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