叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺纳米载体转染螺旋神经节细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.21.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：新型阳离子纳米材料叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺易于合成和改性，稳定性好，结构及性能容易调控，已被作为基因治疗转染载体应用于多种疾病的研究。
目的：观察叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺转染体外培养小鼠内耳螺旋神经节细胞的可行性及特点。
方法：分别以叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺(实验组)、阳离子脂质体Lipofectamine™ 2000(对照组)作为载体，制备携带增强型绿色荧光蛋白的转染载体系统。将昆明小鼠螺旋神经节细胞分别培养于含实验组和对照组转染载体系统的DMEM/F-12培养基中，培养24 h后，MTT法观察载体系统的细胞毒性，倒置荧光显微镜观察细胞形态及绿色荧光蛋白表达强度，流式细胞仪检测细胞转染率。
结果与结论：两种载体分别转染后，螺旋神经节细胞形态均未发生明显改变，但两组载体对螺旋神经节细胞均有一定的毒性，实验组载体毒性较小且转染效率较高(P < 0.05)。结果说明叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺基因转染体外螺旋神经节细胞的转染效率及细胞毒性均优于传统的阳离子脂质体。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 纳米材料, 聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺, 阳离子脂质体, 基因转染, 螺旋神经节细胞, 绿色荧光蛋白, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: A new kind of polyethyenimine-polyethylene glycol (PEI-PEG) is apt to synthesis and modification, and has good stability, easily regulated structure and properties, which has been applied to a variety of diseases as gene transfer vectors.
OBJECTIVE: To study the feasibility and the characteristics of nanoparticles PEI-PEG as gene transfer vector for spiral ganglion cells of the inner ear of mice.
METHODS: Using PEI-PEG (experimental group) and lipofectamineTM 2000 (control group) as gene transfer vectors, with enhanced green fluorescent protein (EGFP) as tracing protein, spiral ganglion cells were transfected in vitro, the transfection rate and mean fluorescence strength were detected by fluorescence microscopy and flow cytometry. Toxicity effects of each vector on spiral ganglion cells were determined by spectroscopic measurement of MTT method.
RESULTS AND CONCLUSION: After transfection with two vectors, spiral ganglion cells had no changes in morphology. The transfection rate of PEI-PEG was statistically higher than that of liposome (P < 0.05). Also, the toxicity effects of PEI-PEG to spiral ganglion cells was lightly than that of liposome (P < 0.05). As a new gene transfer vector, PEI-PEG has a higher transfection rate and lower toxicity effects to spiral ganglion cells compared to liposome, and can serve as gene transferring system into cochlear nervous system.

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Key words: polyethylene glycols, polyethyleneimine, liposomes, spiral ganglion

中图分类号:

R318

陈观贵，徐亚丽. 叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺纳米载体转染螺旋神经节细胞[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(21): 3345-3349.

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图/表（结果） 3

参考文献

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引言

目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类，而非病毒载体可分为聚阳离子高分子和阳离子脂质体两类^[1-2] ，前者包括聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、壳聚糖等带正电荷的高分子材料，后者则是由中性脂质和带正电的脂质组成的脂质体。1995年Boussif等^[3]首先报道了聚乙烯亚胺可作为非病毒载体。转染效率是基于聚乙烯亚胺有较强的结合和压缩DNA能力，能使DNA逃脱内体的吞噬，免受核酸酶降解^[4] 。但聚乙烯亚胺作为基因递释载体还存在一定缺陷，首先是细胞毒性问题，在转染细胞时须谨慎调节聚乙烯亚胺与DNA的比例^[4] ；其次，聚乙烯亚胺-DNA复合物的溶解性较差，采用常规方法无法制备稳定的聚乙烯亚胺- DNA给药系统。研究表明，对聚乙烯亚胺进行聚乙二醇修饰，可提高聚乙烯亚胺-DNA的溶解性；屏蔽复合物表面的正电荷，在不显著降低转染效率的前提下提高聚乙烯亚胺-DNA复合物的物理稳定性，降低细胞毒性；利用聚乙二醇在复合物纳米粒子表面形成中性的水溶性壳层，避免粒子在血液中聚集，减少粒子在传输过程中被网状内皮系统及巨噬细胞清除，延长体内循环时间，获得更好的基因传输效率^[5-7] ；无免疫原性，不会引起机体免疫反应；通过控制粒径尺寸和表面性质可控制载体的生理行为；可根据需要灵活设计分子结构；遗传物质的释放可由聚合物基质降解速率决定等。
叶酸聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺(polyethyenimine- polyethylene glycol，PEI-PEG)作为新型非病毒载体，已被成功应用于多种细胞的转染及基因治疗研究中^[5-9] 。张璇等^[5]应用PEI-PEG共聚物为基因载体，介导血管内皮生长因子165基因转染脐静脉内皮细胞，发现转染率与接枝聚乙二醇的量及N/P有关，当PEI-PEG在N/P=30时转染率达到最大值；转染后血管内皮生长因子蛋白表达及mRNA水平均有显著提高，且可有效刺激内皮细胞增殖。抑制ROCK基因是一种针对阿尔茨海默病的基因治疗方法，Liu等^[6]合成PEI-PEG/ ROCK-II-siRNA复合体，转染C17.2神经干细胞，发现其可有效抑制ROCK-II mRNAs的表达，揭示了PEI-PEG载体应用于中枢神经系统疾病的研究前景。PEI-PEG在肿瘤治疗方面也有着良好的应用价值，Liu等^[7]发现经过枝化修饰的PEI-PEG载体可同时搭载治疗DNA和化疗药(阿霉素)转染肿瘤血管内皮细胞，增强肿瘤的治疗作用。段亚君等^[10]利用肿瘤细胞表面抗原G250的单克隆抗体和PEI-PEG，获得肿瘤靶向基因载体G250mAb-聚乙烯亚胺-聚乙二醇，该载体对HeLa细胞的基因转染效率达到70%，远高于对非肿瘤细胞NIH3T3 30%的转染效率，通过该基因载体将Nucleostemin (NS)基因的特异性短发夹RNA高效率地转入靶细胞HeLa，发现RNA干扰下调了细胞中NS的表达，显著抑制了HeLa细胞的增殖能力，引起HeLa细胞凋亡，表明该载体材料可靶向性、高效率转染HeLa细胞。以上研究均证明了是PEI-PEG是一种极有发展前景的非病毒载体。
螺旋神经节细胞是听觉通路的第一级神经元，大部分的感音性聋是由各种因素导致的耳蜗毛细胞死亡及螺旋神经节细胞凋亡所致^[11] ，因此螺旋神经节细胞的保护与修复对恢复听力起着重要的作用^[12] 。研究证明向内耳中导入相关治疗基因，比如神经生长因子基因，能有效减轻螺旋神经节细胞的凋亡，促进神经节细胞轴突的再生^[13-14] 。国内孙虹研究团队首先报道了纳米载体应用于内耳基因治疗，其使用羟基磷灰石纳米载体介导NT3基因转染体外培养的螺旋神经节细胞，而且介导耳蜗活体转染，证明可减轻耳蜗螺旋神经节细胞的兴奋性毒性损伤^[13] 。2011年10月至2012年12月，作者在体外观察了PEI-PEG对螺旋神经节细胞的转染效率、细胞毒性等，并与Lipofectamine 2000进行对比，以评价PEI-PEG应用于内耳基因治疗的前景。

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材料方法

设计：对比观察实验。

时间及地点：于2011年10月至2012年12月在广州医科大学附属第二医院神经病学实验室(BSL-2)完成。

材料：Lipofectamine™ 2000、DMEM培养(美国Invitrogen公司)；DMEM/F-12培养基(美国sigma公司)；PEI-PEG4.6、pEGFP-N3质粒(实验室保存)；倒置荧光显微镜(日本nikon公司)；鼠抗神经丝蛋白抗体NF-200、阿糖胞苷(美国sigma-Aldrich公司)；质粒提取试剂盒(美国QIAGEN公司)；紫外分光计(上海佑科 UV752)；化学发光酶标仪(美国Bio-Tek Elx800) 。

实验方法：

螺旋神经节细胞的制备及培养鉴定^[3]：出生后1-3 d的昆明小鼠(购自广东省动物实验中心)，用体积分数75%乙醇浸泡消毒30-60 s，快速断头，取出耳蜗置于4 ℃ Hank’s液中，显微镜下解剖耳蜗，暴露膜迷路，去除螺旋韧带、基底膜及血管纹，仅保留含有螺旋神经节的蜗轴螺旋管，依次用含0.125%胶原酶酶和含0.125%胰酶的Hank’s液37 ℃消化20-30 min。加入含体积分数10%胎牛血清DMEM/F-12终止消化，用吸管轻轻吹打2 min，500×g离心10 min，吸出上清，加入含100 U/mL青霉素的DMEM/F-12接种液，将细胞浓度调至10⁸L^-¹后，接种于多聚赖氨酸处理的6孔板，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中孵育约2 h后，加入终浓度为 5 µmol/L阿糖胞苷抑制非神经细胞生长。每日更换培养液。培养24-48 h，用鼠抗神经丝蛋白抗体NF-200(1∶3 000)为一抗，进行免疫组化鉴定，经DAB显色后观察。阳性反应细胞呈棕黄色，螺旋神经节细胞胞核及胞浆均着色，细胞表达阳性的即可判断培养的是螺旋神经节细胞。

质粒DNA(pDNA)的制备：pEGFP-N3质粒用大肠杆菌(广州医科大学附属第二医院神经病学实验室保存)扩增，质粒提取试剂盒提取纯化。制备的质粒通过紫外分光计检测含量(A_{260 nm}和A_{280 nm})，然后在1.0%琼脂糖凝胶中100 V电压40 min。根据A₂₆₀和A₂₈₀的比值来估计制备样品的DNA纯度，如果A₂₆₀/A₂₈₀=1.8-2，并且电泳后没有杂质条带的，表示DNA纯度较高，符合实验要求。将合格的质粒保存于-20 ℃冰箱中备用。

pDNA /Lipofectamine2000复合物的制备：预实验中，明确了转染螺旋神经节细胞时pDNA与脂质体的最佳比例为4∶10(本文未列出数据)。先将2 µg pDNA加入到100 µL无血清DMEM培养基中，然后将5 µL Lipofectamine 2000 加入100 µL无血清DMEM培养基中，分别室温静置10 min后两者混合，再室温作用20 min。

pDNA/PEI-PEG4.6复合物的制备：N/P比为聚合物中的氨基基团与DNA中的磷酸基团的摩尔比，预实验中N/P=15时转染效率最好(本文未列出数据)。在Eppendorf管中，将1 μg pDNA稀释在50 µL DMEM/F-12培养基中，振荡均匀，分别按N/P=15把相应量的聚乙烯亚胺-聚乙二醇加入到另外一管装有50 µL DMEM/F-12培养基的Eppendorf管中，然后把两溶液在室温下振荡5 min得到复合物。

细胞毒性实验(MTT法)：96孔板中每孔接种6 000个细胞，每孔体积200 µL，培养24 h后每孔加入150 µL不含血清含有150 ng pDNA/Lipofectamine 2000复合物或pDNA/ PEI-PEG4.6复合物的DMEM/F12培养液进行转染，继续培养24 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 µL，继续培养4 h，吸弃孔内培养上清液，加入150 µL二甲基亚砜，振荡10 min后，通过化学发光酶标仪测定在570 nm处的吸光值(A值)，计算细胞存活率。同时设置空白孔(DMEM/F12培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、DMEM/F12培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定3复孔。通过细胞的存活率来推定聚合物载体内在的细胞毒性，其值越大则细胞毒性约小，相对增殖百分率(%)=(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100% 。

转染效果检测：

转染过程：细胞以每孔1×10⁸ L^-¹的浓度接种在24孔板上培养48 h，待细胞丰度约70%，先用无血清的DMEM/F-12培养基清洗，再加DMEM/F-12无血清培养基，将50 µL pDNA/Lipofectamine 2000复合物或pDNA/ PEI-PEG4.6复合物加入每孔中，在37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱中转染6 h，加入含体积分数12%胎牛血清的DMEM/F-12培基，继续培育24 h。

倒置荧光显微镜观测：转染24 h后通过倒置荧光显微镜观测细胞的形态变化，观测表达质粒子在细胞中的瞬时表达。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无。

流式细胞仪观测：转染24 h后弃去上层培养液，细胞用500 µL Hank’s溶液悬浮，然后应用流式细胞仪Aria^TM系统计数阳性表达细胞的百分比(即转染效率)，每种细胞重复3次取平均值。

主要观察指标：PEI-PEG转染体外培养小鼠内耳螺旋神经节细胞的可行性及特点。

统计学分析：应用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，计数资料以百分比表示，两两比较卡方检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

感音性耳聋是耳蜗内的毛细胞及与其相联系的螺旋神经节细胞病变导致，因为哺乳动物的毛细胞及螺旋神经节细胞的再生能力非常低甚至不能再生，直接或间接的损伤均可导致永久性听力下降。所以感音性耳聋的药物治疗效果极其有限，目前治疗神经性聋的方法只限于电子助听装置和人工耳蜗植入，但人工耳蜗植入仅限于有一定数量听神经元存留的患者。研究证明，螺旋神经节数量保持在10%以上才能保证人工耳蜗植入的效果^[3] 。因此，受损的螺旋神经节细胞保护与修复对恢复听力起着至关重要的作用。螺旋神经节的发生及功能数量的维持离不开神经营养因子。由于神经营养因子等活性多肽相对分子质量大、半衰期短，因此直接在内耳治疗上面临难题，全身用药很难使药物在内耳保持有效治疗浓度，而通过圆窗注射等途径的局部用药方法，往往需多次反复用药而限制其应用。内耳基因治疗，即通过病毒或非病毒载体向内耳细胞转染入相关治疗基因，是一种极其发展前景的治疗手段。基因转染是基因治疗的关键技术，也是一直以来制约基因治疗成功开展的重要问题，而基因载体又是基因转染技术的关键因素。目前应用于基因治疗研究的基因转移载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。常用的病毒载体虽经遗传工程改造，去除了病原性而保留了基因转染效能，但制备困难、目的基因插入长度受限，还存在潜在的免疫反应和生物安全等问题。非病毒载体大多制作简单，免疫原性低，不与宿主基因整合，可重复应用，使用安全性能显著优于病毒载体，具有非常好的应用前景，目前最常用的两种非病毒载体是以Lipofectine 2000为代表的阳离子脂质体和纳米颗粒。
阳离子脂质体是磷脂和其他亲水亲组性物质分散于水中，由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的超微球状载体制剂。脂质体具有亲水性和疏水性双重特性，决定了脂质体可以较好地包裹亲水性物质和亲脂性物质，因此脂质体是目前运用较广泛的基因载体之一。尽管有了不少改良，但脂质体普遍存在制备重复性和储存稳定性较差的缺点，而且溶酶可以使进入细胞的脂质体降解，并且脂质体细胞毒性相对较高，可能会干扰细胞的代谢，这些特点限制了脂质体的应用^[15-16] 。纳米颗粒是一种粒径在 1-100 nm之间的超微粒子，具有表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等^[17] 。以纳米颗粒为基因转移载体的基本原理是将DNA、RNA、肽核苷酸、dsRNA和寡核苷酸等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，经细胞摄取后，纳米颗粒进入细胞内，释放基因治疗分子，发挥其基因治疗效能^[9] 。阳离子聚合物作为一种新型纳米载体树枝状聚合物，稳定性更好，结构及性能也更容易调控，是目前生物材料领域的研究热点，也应用于内耳基因治疗研究中^[18-19] 。孙虹研究团队使用羟基磷灰石纳米载体介导NT3基因能成功转染离体培养螺旋神经节细胞，但未分析转染效率及细胞毒性，其向实验性兴奋性耳蜗损害豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注羟基磷灰石-Pegfpc2-NT3，可见活体耳蜗神经元内有明显的NT3蛋白表达^[13] 。需要注意的是羟基磷灰石纳米载体是一种无机化学复合物纳米载体，在耳蜗内如何降解及转归仍有待进一步研究。而本实验中使用的PEG-PEI纳米载体可在体内自然降解，具备较低的细胞毒性，在体内循环时间长，无免疫原性，不会引起机体免疫反应，并且可根据细胞表面受体设计具备靶向性的分子结构。因此，PEI-PEG作为新型非病毒载体已成功应用于多种细胞的转染及基因治疗研究中，发现能转染包括神经干细胞、血管内皮细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞等多种体细胞^[5-9] ，但目前为止未发现PEI-PEG应用于转染耳蜗内细胞(包括螺旋神经节细胞和毛细胞等)的研究报告。本研究尝试观察PEI-PEG对螺旋神经节细胞的转染效率、细胞毒性等，以评价PEI-PEG应用于内耳基因治疗的前景。
转染效率及细胞存活率是权衡载体性能的主要指标之一，也是决定基因治疗可行性的指标之一。病毒载体介导转染螺旋神经节细胞的转染率一般为70%以上^[20] ，而非病毒载体转染效率远远低于病毒载体，这是制约非病毒载体应用于内耳基因治疗的主要因素^[19] 。国内学者报道应用阳离子脂质体作为载体，用NT-3基因转染耳蜗螺旋神经节细胞，发现对抑制耳蜗螺旋神经节细胞的退行性变有一定作用，证明了非病毒载体在耳蜗基因治疗中是可行的^[21] 。但阳离子脂质体转染效率较低，报道约为10%^[22] ，与本文作者研究的数据(11.2%)相当。该文研究中，PEI-PEG染效率(16.5%)比阳离子脂质体转染效率(11.2%)略高，差异有显著性意义。两种载体均对螺旋神经节细胞有一定的细胞毒性，螺旋神经节细胞存活率为85%，比Lipofectamine 2000的细胞存活率(73%)要高(P < 0.05)。并且，以后可以通过优化材料枝化修饰及优化实验条件，进一步提高转染效率及降低细胞死亡率^[23-24] 。
由此说明，Lipofectine和PEI-PEG都可以作为螺旋神经节细胞基因传输的载体，而PEI-PEG作为新的传输载体，各方面的性能都优于传统的阳离子脂质体，具有良好的研究价值，可作为基因载体用于耳蜗基因治疗研究。将来的研究中，还可以根据靶细胞表面受体的不同，在PEI-PEG添加特异性靶向分子，可以极大提高转染效率及降低细胞毒性^{[8, 25]} 。

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文章快阅

延伸阅读

阳离子脂质体是磷脂和其他亲水亲组性物质分散于水中，由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的超微球状载体制剂。脂质体具有亲水性和疏水性双重特性，决定了脂质体可以较好地包裹亲水性物质和亲脂性物质，因此脂质体是目前运用较广泛的基因载体之一。尽管有了不少改良，但脂质体普遍存在制备重复性和储存稳定性较差的缺点，而且溶酶可以使进入细胞的脂质体降解，并且脂质体细胞毒性相对较高，可能会干扰细胞的代谢，这些特点限制了脂质体的应用。纳米颗粒是一种粒径在1-100nm之间的超微粒子，具有表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等[17]。以纳米颗粒为基因转移载体的基本原理是将DNA、RNA、肽核苷酸、dsRNA和寡核苷酸等基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面，经细胞摄取后，纳米颗粒进入细胞内，释放基因治疗分子，发挥其基因治疗效能。阳离子聚合物作为一种新型纳米载体树枝状聚合物，稳定性更好，结构及性能也更容易调控，是目前生物材料领域的研究热点，也应用于内耳基因治疗研究中。孙虹研究团队使用羟基磷灰石纳米载体介导NT3基因能成功转染离体培养SGC，但未分析转染效率及细胞毒性，其向实验性兴奋性耳蜗损害豚鼠的耳蜗外淋巴腔灌注羟基磷灰石-Pegfpc2-NT3，可见活体耳蜗神经元内有明显的NT3蛋白表达。需要注意的是羟基磷灰石纳米载体是一种无机化学复合物纳米载体，在耳蜗内如何降解及转归仍有待进一步研究。而本实验中使用的PEG-PEI纳米载体可在体内自然降解，具备较低的细胞毒性，在体内循环时间长，无免疫原性，不会引起机体免疫反应，并且可根据细胞表面受体设计具备靶向性的分子结构。因此，PEI-PEG作为新型非病毒载体已成功应用于多种细胞的转染及基因治疗研究中，发现能转染包括神经干细胞、血管内皮细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞等多种体细胞，但目前为止未发现PEI-PEG应用于转染耳蜗内细胞（包括SGC和毛细胞等）的研究报告。本研究尝试观察PEI-PEG对SGC细胞的转染效率、细胞毒性等，以评价PEI-PEG应用于内耳基因治疗的前景。

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