软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞微团培养成软骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.017

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (1): 100-105.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.01.017

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞微团培养成软骨

邵博，龚忠诚，刘慧，凌彬，克热木，尹小朋，胡露露，王冰，宁晓婷，林兆全

新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科，新疆医科大学口腔医学院，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

修回日期:2013-12-10 出版日期:2014-01-01 发布日期:2014-01-01
通讯作者: 龚忠诚，博士，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科，新疆医科大学口腔医学院，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 通讯作者：林兆全，主任医师，新疆医科大学第一附属医院颌面肿瘤外科，新疆医科大学口腔医学院，新疆维吾尔自治区口腔医学研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市830054
作者简介:邵博，男，1986年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，新疆医科大学在读硕士，主要从事口腔颌面外科学研究。并列第一作者：龚忠诚，男，1974年生，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市人，汉族，博士，副主任医师，主要从事颞下颌关节的临床与基础研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2011211A068)，项目名称：PLLA/PDLA三维支架与滑膜间充质干细胞构建颞下颌关节盘的实验研究

Chondrocyte supernatant induces chondrogenesis and pellet cultivation of rat synovial mesenchymal stem cells

Shao Bo, Gong Zhong-cheng, Liu Hui, Ling Bin, Ke Re-mu, Yin Xiao-peng, Hu Lu-lu, Wang Bing, Ning Xiao-ting, Lin Zhao-quan

Oncology Department of Oral & Maxillofacial Surgery, the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Province, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Revised:2013-12-10 Online:2014-01-01 Published:2014-01-01
Contact: Gong Zhong-cheng, Oncology Department of Oral & Maxillofacial Surgery, the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Province, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Corresponding author: Lin Zhao-quan, Chief physician, Oncology Department of Oral & Maxillofacial Surgery, the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Province, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Shao Bo, Studying for master’s degree, Oncology Department of Oral & Maxillofacial Surgery, the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Province, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Gong Zhong-cheng, M.D., Associate chief physician, Oncology Department of Oral & Maxillofacial Surgery, the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University, Stomatology College of Xinjiang Medical University, Stomatology Research Institute of Xinjiang Province, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China Shao Bo and Gong Zhong-cheng contributed equally to this work.
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2011211A068

摘要/Abstract

摘要：

背景：滑膜间充质干细胞在体外具有多向分化的能力，有望成为软骨组织工程中治疗软骨缺损的种子细胞，在其向软骨细胞分化过程中，合适的生长因子起了重要作用。
目的：利用富含生长因子的软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化，并对其鉴定。
方法：采用消化法分别获得SD大鼠滑膜间充质干细胞、软骨细胞。收集软骨细胞上清液离心、过滤冻存备用。培养滑膜间充质干细胞至第3代后离心成微团，并用软骨细胞上清液进行成软骨诱导分化，通过形态学观察、免疫组织化学法、RT-PCR检测进行鉴定。
结果与结论：滑膜间充质干细胞使用软骨细胞上清液成软骨诱导21 d后，微团可见似软骨样组织。免疫组化法进行Ⅱ型胶原鉴定，基质能被Ⅱ型胶原染色，细胞染色呈现棕黄色。RT-PCR结果显示诱导后的微团表达软骨特异性基因Ⅱ型胶原和蛋白聚糖。证实软骨细胞分泌的可溶性因子可以诱导大鼠滑膜间充质干细胞向软骨方向分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 诱导, 滑膜间充质干细胞, 软骨形成, 软骨细胞, 可溶性因子, 生长因子, 种子细胞, 三维培养, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Synovial mesenchymal stem cells have the ability of multilineage differentiation in vitro, which are expected to be seed cells for the treatment of cartilage defects in cartilage tissue engineering. Appropriate growth factors are critical for the chondrocyte differentiation of synovial mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To study the role of secreted factors by chondrocytes to induce chondrogenesis of synovial mesenchymal stem cells.
METHODS: The synovial mesenchymal stem cells and chondrocytes were harvested from rat knee joints and cultured through the digestion method. The supernatant was collected from chondrocytes, and centrifuged, filtered and cryopreserved. The third passage synovial mesenchymal stem cells centrifuged as pellets were cultured in the chondrocyte supernatant for 21 days. And the cells morphology was examined and the type II collagen and aggrecan were detected through immunohistochemistry and RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The synovial mesenchymal stem cell pellets cultured in the chondrocyte supernatant became cartilage-like tissue after 21 days. The type II collagen was detected positively in the matrix of synovial mesenchymal stem cell pellet immunohistochemically. RT-PCR examination showed that the type II collagen and aggrecan expressed in the synovial mesenchymal stem cellpellet cultured in the chondrocyte supernatant. It suggested that synovial mesenchymal stem cell could be induced to differentiate into chondrocytes depending on soluble factors secreted by chondrocytes.

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Key words: chondrocytes, synovial membrane, mesenchymal stem cells, cell culture, cell differentiation, tissue engineering

中图分类号:

R394.2

邵博，龚忠诚，刘慧，凌彬，克热木，尹小朋，胡露露，王冰，宁晓婷，林兆全. 软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞微团培养成软骨[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(1): 100-105.

Shao Bo, Gong Zhong-cheng, Liu Hui, Ling Bin, Ke Re-mu, Yin Xiao-peng, Hu Lu-lu, Wang Bing, Ning Xiao-ting, Lin Zhao-quan. Chondrocyte supernatant induces chondrogenesis and pellet cultivation of rat synovial mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(1): 100-105.

图/表（结果） 4

2.1 细胞形态学观察结果 倒置显微镜下观察，原代滑膜间充质干细胞培养24 h，大部分贴壁，部分伸展生长。48 h首次换液，可见有少量细胞贴壁生长，胞体呈短小梭形外还存在较多形态多样的细胞，胞核呈卵圆形位于细胞中央。随培养时间延长，细胞渐渐得到纯化，形态多样的细胞已明显减少，细胞大多呈梭形，纺锤样，边缘光滑，集落逐渐增大，呈平行排列或漩涡状具有一定的方向性，与纤维细胞的形态学特征一致(图1A)。原代细胞5-7 d 可传代，传代后细胞呈梭形，形态大小较一致(图1B，C)。原代软骨细胞未贴壁前呈圆球形，悬浮状态，4-7 h基本贴壁，24 h基本贴壁，部分细胞开始伸展，细胞体积较小(图1D)，部分细胞出现分裂相，当细胞传至第2代后，细胞呈长梭形，多角、可呈明显的“铺路石”，部分细胞集落已形成复层(图1E)。

2.2 滑膜间充质干细胞诱导前后细胞增殖曲线绘制 细胞增殖曲线呈现“S”形，接种3 d内细胞处于停滞期，3-6 d为对数增长期，7 d达到生长峰，至第9天细胞增殖速度变缓，进入平台期。向软骨细胞诱导后细胞生长较为缓慢(图2)。

2.3 苏木精-伊红染色及甲苯胺蓝染色 向软骨细胞诱导后细胞微团外形成球状，细胞基质和细胞核染成蓝色。细胞胞浆呈紫红色，胞核呈褐紫色，可见成熟的软骨凹陷形成(图3A)。甲苯胺蓝染色后可见胞核深蓝色，细胞外基质蓝染(图3B)，对照组未染色。

2.4 免疫组化检测结果 诱导组Ⅱ型胶原免疫组织化学结果为阳性，可见胞质被染成棕褐色的阳性细胞，并且可见成熟的软骨小凹(图3C)。说明成软骨诱导后滑膜间充质干细胞可表达软骨的特异性Ⅱ型胶原，证实软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞具有成软骨的潜能。

2.5 RT-PCR检测结果 滑膜间充质干细胞使用软骨细胞上清液诱导21 d后，软骨特异性基因Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因的相对表达都显著提高(图4A)。在使用GAPDH内参进行相对定量分析后，结果显示诱导滑膜间充质干细胞在Ⅱ型胶及蛋白多糖的表达均高于对照组(图4B)。说明在RT-PCR检测中软骨细胞上清液诱导的滑膜间充质干细胞在基因水平表达软骨的特异性标记物，表达量明显高于对照组。

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引言

材料方法

设计：随机分组设计，体外细胞学对比观察。

时间及地点：实验于2011年8月至2012年10月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞研究室完成。

材料：

实验动物：健康雄性SD大鼠，体质量180-220 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，SPF级，生产许可证号：SCXK(新) 2003-001。

实验过程中对动物的处置遵守《关于善待实验动物的指导性意见》相关要求。

实验方法：

滑膜间充质干细胞的分离和原代培养^[5]：取SD大鼠，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg达到麻醉效果后，用体积分数75%乙醇严格消毒术区，于双侧膝关节关节腔取出滑膜组织，浸泡于含1 000 U/mL 链霉素和青霉素的双抗H-DMEM中，低温下转移(冰盒)，移入超净工作台。使用含1 000 U/mL双抗无菌PBS冲洗滑膜组织3次，用眼科剪将其剪成约1 mm× 1 mm大小的组织块。加入10倍体积的0.4%Ⅰ型胶原酶，于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度条件下进行4 h消化，待絮状物大部分消失后，100目铜网过滤，吸取滤过液，1 200 r/min离心5 min，弃上清液，无菌PBS洗涤3次，用含体积分数10%胎牛血清的H-DMEM高糖培养基(含200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L抗坏血酸，100 U/mL青霉素，100 mg/L 链霉素)，以2×10⁵/cm²的密度接种于培养皿中，置37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，此为原代滑膜间充质干细胞(课题组已完成所培养大鼠滑膜细胞的成骨、成脂肪、成软骨诱导实验，证实其为滑膜间充质干细胞，文章目前暂未发表，但可证明)。48 h后首次换液，此后每48 h换液1次。待细胞达80%-90%融合时，以1∶3 进行传代培养并用于后续实验。

软骨细胞培养^[6-9]：取双侧膝关节、髋关节软骨，将软骨切成小块，浸泡于含双抗的H-DMEM中，低温转移(冰盒)，移入超净工作台。PBS冲洗3次，每次5 min。使用含1 000 U/mL双抗无菌PBS浸泡20 min后，用眼科剪将其剪成约1 mm×1 mm大小的组织块。加入3倍体积0.2%的Ⅱ型胶原酶，放置摇床内以37 ℃、60 r/min过夜消化(>12 h)。消化后的悬液经120目铜网过滤，吸取滤过液移入15 mL离心管，1 200 r/min(离心力257×g)离心8 min弃上清液，用H-DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清、200 mmol/L左旋谷氨酰胺，100 μmol/L抗坏血酸，100 U/mL青霉素，100 g/L 链霉素)，置37 ℃，体积分数为5%的CO₂培养箱进行原代培养，48 h后首次换液。此后每48 h换液1次。待细胞达80%-90%融合时，以1∶4 进行传代培养并用于后续实验。取第2代软骨细胞上清液，2 000 r/min离心10 min后，取上清液过滤，-80 ℃冻存后备用。

软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞成软骨分化：取第2代已达到90%融合的滑膜间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞。计数后1×10⁶个细胞以1 200 r/min、8 min离心成pellet于15 mL离心管中。置入37 ℃，含体积分数5%CO₂的细胞培养箱中培养，每个离心管中加入1 mL软骨细胞上清液。每两三天换液1次，培养21 d后进行检测。以使用普通培养基培养的滑膜间充质干细胞为阴性对照组。

细胞增殖曲线：取第3代滑膜间充质干细胞和软骨向诱导后的细胞，消化法消化细胞后，调整细胞悬液浓度为2×10⁷ L^-¹接种于96孔板，每孔100 μL，设5组复孔，常规培养，每3 d换液1次。每孔滴加10 μL CCK8液。滴加后2 h后测量每孔A值，连续测量8 d，每天计数5孔细胞，取均值绘制细胞生长曲线。

滑膜间充质干细胞Giemsa 染色^[10-11]：当细胞长至60%-70%汇合时，弃去上清液，PBS冲洗2次，每次5 min，加体积分数50%甲醇液浸没细胞，静置2 min，弃甲醇后静置10 min，无水甲醇快速洗1遍，加未稀释的Giemsa染液覆盖细胞5 min，加ddH₂O稀释4倍，轻轻晃动2 min，最后加去离子水使浮渣浮起，弃去后清洗至细胞成紫红色即可镜下观察。

苏木精-伊红染色：二甲苯脱蜡2次，每次5 min，不同体积分数乙醇梯度脱水(100%×1次、95%×2次、80%×1次)各5 s，蒸馏水浸泡5 min。苏木精染色5 min，蒸馏水冲洗1 min，盐酸乙醇分化，蒸馏水冲洗。PBS返蓝1 min，伊红染色8 min，脱水，透明，中性树脂封固。Leica DM3000显微镜拍照。

甲苯胺蓝染色：二甲苯脱蜡2次，每次5 min，不同体积分数乙醇梯度脱水(100%×1次、95%×2次、80%×1次)各5 s，蒸馏水浸泡5 min。使用甲苯胺蓝染液常温染色 15 min，蒸馏水冲洗3次，乙醇梯度脱水，透明，中性树脂封固。Leica DM3000显微镜拍照。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：各组培养21 d后的的细胞，用40 g/L多聚甲醛固定过夜，梯度脱水，浸蜡，包埋，切片。PBS冲洗2遍，每次5 min。在体积分数3%H₂O₂中室温浸泡10 min。蒸馏水冲洗1次，PBS冲洗1次。 0.01 mol/L枸橼酸95 ℃ 10 min冷却至室温。用蒸馏水、PBS各冲洗1次，加入兔抗大鼠Ⅱ型胶原单克隆抗体(1∶150)，4 ℃过夜。PBS冲洗3次，每次3 min。加入Ig-G抗体-HRP多聚体工作液 37 ℃孵育25 min，PBS冲洗2次。DAB显色、苏木精复染，中性树脂封固，显微镜下观察。以未诱导的滑膜间充质干细胞为对照组。

诱导后滑膜间充质干细胞RT-PCR检测细胞表型：TRIzol法提取软骨、诱导软骨细胞总RNA。每个样品设计3个复孔进行检测。按照说明书的步骤将提取的总RNA反转录成cDNA，进行RT-PCR检测。

引物序列分别为Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ)上游引物为F：5’-GAG GGC AAC AGC AGG TTC AC-3’，下游引物为R：5’-GCC CTA TGT CCA CAC CAA ATT C-3’，扩增产物大小为178 bp。蛋白多糖(Aggrecan)上游引物为F：5’- TGG CAT TGA GGA CAG CGA AG-3’，下游引物为：R: 5’- TCC AGT GTG TAG CGT GTG GAA ATA G-3’，扩增产物大小为90 bp。GAPDH上游引物为F：5’-GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G-3’，下游引物为：R: 5’-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA-3’，扩增产物大小为143 bp。GeneBank验证。引物由大连宝生物公司设计、合成，RT-PCR由荧光定量PCR仪自动采集内参基因和目的基因与的Ct值。

各个基因的基因表达量根据Livak公式计算^[12]。扩增后产物在琼脂糖凝胶中电泳。采用凝胶分析系统拍摄。

计算公式：ΔCT(test)= CT(target, test)–CT(ref, test) ；ΔCT(calibrator)= CT(target, calibrator)–CT(ref, calibrator) ；ΔΔCT= ?CT(test)–?CT(calibrator)； 2-ΔΔCT =表达量的比值。

主要观察指标：细胞形态、增殖率，RT-PCR和免疫组化鉴定软骨细胞上清液诱导滑膜成软骨潜能。

统计学分析：每组实验重复3次，各组数据用x(_)±s表示，采用SPSS 18.0软件进行统计学处理，对增殖率及RT-PCR结果进行两独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

成熟的软骨有很低的自我修复能力，归因于其内在性质——缺乏神经分布和血管供应，另一个限制因素是软骨细胞的有丝分裂潜能较低^[13]。小的缺损可以通过软骨细胞移植恢复，大的缺损可以通过下层纤维软骨恢复^[14]。然而,在许多情况下需要对缺损进行手术干预。通过组织工程技术修复软骨组织，为软骨缺损的修复提供了一个新的思路。

作者这次实验从大鼠膝关节处获取滑膜组织，成功分离并于体外培养。在胚胎学中，滑膜是在关节局部派生的间充质细胞，在某种程度上支持了关节生物力学和生物化学的需要^[15-16]。本实验培养第3代后的滑膜间充质干细胞形态呈纤维样、纺锤样并呈漩涡状排列，符合纤维细胞的形态学特征；通过细胞增殖曲线可见细胞增殖速度稳定，细胞活性活跃；可至少传8代以上；且细胞传代和低温冻存不影响滑膜来源细胞的分化潜能，并且保持显著的自我更新能力。Sakaguchi^[2]将滑膜间充质干细胞与骨膜间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨骼肌间充质干细胞进行了比较，证实滑膜间充质干细胞的成软骨能力明显强于其他组织来源的间充质干细胞，从而满足工程化组织或器官的生成。

目前已有研究表明添加特定细胞的上清液可诱导干细胞成骨、上皮样组织等方向分化^[17]。在软骨组织中包含有多种生长因子，通过自分泌或着旁分泌的方式在软骨细胞生长和分化中起着重要的作用。软骨分泌的特定生长因子对软骨细胞的生长和分化具有重要作用^[18]。用于软骨组织工程的生长因子主要包括转化生长因子β^[19-21]、胰岛素样生长因子^[22-23]、骨形态发生蛋白^[21^，^24]、软骨源性形态发生蛋白(CDMP)等^[25]，他们可促使间充质干细胞向软骨分化，使软骨特异性的分子上调，例如Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖、聚糖、二聚糖和核心蛋白聚糖^[26]。软骨组织工程细胞因子的研究主要集中在种子细胞的诱导和促进细胞增殖及表型维持方面。因此本实验用富含生长因子的软骨细胞上清液，模拟软骨细胞在分化过程中的微环境，促使滑膜间充质干细胞向软骨分化，RT-PCR结果证实滑膜间充质干细胞合成软骨细胞特征性的细胞外基质成分：Ⅱ型胶原和蛋白聚糖并表达基因。软骨细胞自身可分泌生长因子如转化生长因子β1、骨形态发生蛋白等促进滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化^[27]，而滑膜间充质干细胞与新形成的软骨细胞通过接触式共培养，可被进一步诱导向软骨细胞分化，合成更多的软骨细胞外基质成分。说明滑膜间充质干细胞合成软骨细胞与添加软骨细胞上清液，保持软骨的微环境有关。

软骨细胞特异性的表达Ⅱ型胶原，约占90%，因此检测Ⅱ型胶原成了检测软骨细胞的特异性指标^[28]。本实验通过第2代软骨细胞的上清液诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化，这样可以单独研究软骨细胞上清液直接作用于滑膜间充质干细胞，并诱导其向软骨方向分化。

在软骨分化过程中，软骨细胞生长的环境在二维下，细胞多为扁平，易发生迁移和细胞骨架的改变。而在三维环境中培养，细胞可维持其骨架，防止细胞去分化。目前已有研究证实，三维条件培养下的软骨细胞可高表达Ⅱ型胶原和SOX9这两种软骨细胞特异基因^[29]，并且在三维培养下细胞与细胞之间的信号可以相互传递^[30]，有效增加了细胞分化的潜能。但是这背后的机制和作用效果并没有被完全阐明。因此本实验采取三维法培养，其可有助于滑膜间充质干细胞向软骨方向分化。

在前期实验中作者已证明滑膜间充质干细胞在添加特定生长因子后可诱导成软骨分化，证明了滑膜间充质干细胞具成软骨的潜能。这次实验在前期试验基础上，单独使用软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞，诱导21 d后，微团较前体积有所增长，并且表明光滑具有一定弹性，阴性对照组微团较散，触之较软，不成型。单从外形无法鉴定是否成软骨，故又使用免疫组化和RT-PCR对其检测，检测发现诱导21 d后的微团染色显示，细胞胞质及细胞间基质均被黄染，与对照组细胞不能被染色形成对照，并且RT-PCR结果显示诱导后的微团表达Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA。

综上所述，实验在基因及蛋白水平上初步证明了大鼠软骨细胞提供微环境可诱导滑膜间充质干细胞向软骨细胞方向分化，其中软骨细胞分泌的可溶性因子起了至关重要的作用，为优化和扩大种子细胞源提供了一种实用的策略，并为后续实验奠定了基础。但其具体机制还有待于进一步探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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软骨细胞上清液诱导滑膜间充质干细胞微团培养成软骨

Chondrocyte supernatant induces chondrogenesis and pellet cultivation of rat synovial mesenchymal stem cells

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