转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.018

中国组织工程研究

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 上一篇下一篇

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞

王体俊¹，王昌耀¹，夏长所¹，隋爱华²，王英振¹

青岛大学医学院附属医院，1关节外科，2中心实验室，山东省青岛市 266003

收稿日期:2013-03-19 修回日期:2013-05-23 出版日期:2013-07-02 发布日期:2013-07-02
通讯作者: 王英振，硕士，博士生导师，青岛大学医学院附属医院关节外科，山东省青岛市 266003 wangyingzhenqd@163.com
作者简介:王体俊★，男，1983年生，安徽省淮南市人，汉族，2013年青岛大学毕业，硕士，主要从事骨外科的基础与临床研究。 wtj111@126.com
基金资助:
山东省自然科学基金项目(编号：2009ZRB14311)。

Bone marrow stem cells co-transfected with transforming growth factor beta 3 and bone morphogenetic protein 2

Wang Ti-jun¹, Wang Chang-yao¹, Xia Chang-suo¹, Sui Ai-hua², Wang Ying-zhen¹

1Department of Joint Surgery, 2Central Laboratory, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 366003, Shandong Province, China

Received:2013-03-19 Revised:2013-05-23 Online:2013-07-02 Published:2013-07-02
Contact: Wang Ti-jun★, Master, Department of Joint Surgery, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 366003, Shandong Province, China wtj111@126.com
About author:Wang Ying-zhen, Master, Doctoral supervisor, Department of Joint Surgery, Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 366003, Shandong Province, China wangyingzhenqd@163.com
Supported by:
Natural Science Foundation of Shandong Province, No. 2009ZRB14311*

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子，提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。
目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体，观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。
方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体，并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞，以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA和蛋白进行检测。
结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d的骨髓间充质干细胞发绿色荧光，转染效率达90%以上。RT-PCR和Western blot结果显示，转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达，且两种基因具有协同促表达作用。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 转化生长因子β3, 骨形态发生蛋白2, 重组慢病毒, 成骨, 骨髓间充质干细胞, 转染, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Bone morphogenetic protein 2 and transforming growth factor β are important factors in bone regeneration, increasing the expressions of bone morphogenetic protein 2 and transforming growth factor β can promote the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
OBJECTIVE: To construct the lentivirus vector carrying bone morphogenetic protein 2 and transforming growth factor β3, and to observe the expression of lentivirus vector in bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: The recombinant lentiviral vectors carrying transforming growth factor β3, bone morphogenetic protein 2 and green fluorescent protein were constructed with recombinant lentiviral technology, and then the recombinant lentiviral vectors were used to transfect the passage 3 rabbit bone marrow mesenchymal stem cells in vitro cultured (transfection group). The bone marrow mesenchymal stem cells transfected with single gene lentivirals (single gene transfection group) carrying transforming growth factor β3 and bone morphogenetic protein 2 or single lentivirals were as control (control group). At 1 week after trasfection, the total RNA and protein were extracted from each group for detection.
RESULTS AND CONCLUSION: The green fluorescence bone marrow mesenchymal stem cells transfected with transforming growth factor β3 and bone morphogenetic protein 2 gene for 3 days could be observed under fluorescence microscope, and the transfection efficiency was over 90%. Reverse transcription-PCR and Western blot results showed the mRNA and protein expressions of transforming growth factor β3 and bone morphogenetic protein 2 in the transfection group were higher than those in the single gene transfection group and the control group. The results indicate that lentivirus can successfully transfect transforming growth factor β3 and bone morphogenetic protein 2 into the bone marrow msenchymal stem cells and achieve its high expression, and these two genes have the synergistic effect of promoting expression.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, transforming growth factor β3, bone morphogenetic protein 2, recombinant lentivirus, osteogenesis, bone marrow mesenchymal stem cells, transfection, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

王体俊，王昌耀，夏长所，隋爱华，王英振. 转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.018.

Wang Ti-jun, Wang Chang-yao, Xia Chang-suo, Sui Ai-hua, Wang Ying-zhen. Bone marrow stem cells co-transfected with transforming growth factor beta 3 and bone morphogenetic protein 2[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.27.018.

图/表（结果） 5

2.1 分离培养的兔骨髓间充质干细胞的形态原代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形，有胞浆突起，少部分呈多角形。培养第3天形成多个细胞克隆，细胞呈成纤维细胞样，呈平行排列或漩涡状生长，见图1。

传代培养后的细胞呈均匀性分布生长，且生长迅速，约2 d即可铺满全层，见图2。慢病毒转染后1周，细胞克隆扩大直至铺满培养瓶底面。

2.2 慢病毒介导的转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的转染效率每孔细胞随机取3个40倍视野对所有细胞和绿色荧光蛋白阳性细胞计数，计算绿色荧光蛋白阳性细胞百分率，每个感染复数的转染效率为3个视野的平均绿色荧光蛋白阳性细胞百分率。当骨形态发生蛋白2基因转染组感染复数为40、转化生长因子β3基因转染组感染复数为40、双基因转染组感染复数为55时，各组转染效率均可达90%，见图3。
2.3 慢病毒转染后骨髓间充质干细胞的生长情况慢病毒转染后72 h转染率达到最高，荧光达到最亮，光镜下培养板内细胞胞质内出现大量颗粒物质，细胞形态开始由梭行逐渐变为不规则形状，细胞立体感增加，出现较明显的病毒效应，出现少部分细胞漂浮，贴壁细胞胞质内颗粒增多，见图4。

2.4 慢病毒转染后骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β3基因的表达于转染后1周提取各组细胞的总RNA，进行RT-PCR检测，结果分别在456 bp和486 bp检测到骨形态发生蛋白2和转化生长因子β3的条带，并且双基因转染组的条带较骨形态发生蛋白2基因转染组和转化生长因子β3基因转染组亮，基因表达量高(P < 0.05)，见图5，6。

2.5 慢病毒转染后骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β3蛋白的表达转染后1周行Western blot检测，实验各组均检测到转染目的蛋白的表达，见图7，其中转化生长因子β3基因转染组和骨形态发生蛋白2基因转染组吸光度值较双基因转染组小 (P < 0.05)，见图8。提示转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞内均可稳定表达，当上述两种基因同时转染至细胞内时，其表达量高于单基因转染，体现二者具有协同作用。

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引言

材料方法

设计：随机分组，体外对比观察实验。

时间及地点：于2011年12月至2012年10月在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：普通级新西兰兔4只，4周龄，雌雄不拘，体质量400-500 g，购自青岛市实验动物和动物实验中心，许可证号：SCXK(鲁)20090007。

携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2双基因的重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞实验中所用试剂：

实验方法：

兔骨髓间充质干细胞的原代培养：根据兔骨髓间充质干细胞的原代培养法^[10]，在无菌条件下，取新西兰兔股骨及胫骨，剔除股骨头周围软组织，剪去两侧干骺端，用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM培养基将骨髓冲出，吹打成悬液，分装接种于25 cm²培养瓶中，置于体积分数5%CO₂、37 ℃培养箱中培养，此为原代细胞。24 h后首次换液，去除未贴壁悬浮细胞，以后每隔1 d换液1次，1周后，细胞融合度达到80%-90%，2.5 g/L胰酶消化细胞，调整细胞浓度至1×10⁶ L^-¹分瓶接种，继续培养。收集第3代细胞，用于细胞转染。

携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体的构建：pIRES-骨形态发生蛋白2-转化生长因子β3由青岛大学医学院中心实验室提供。慢病毒包装由上海吉玛公司完成。

实验分组与目的基因转染：取第3代骨髓间充质干细胞，分4组：骨形态发生蛋白2基因转染组、转化生长因子β3基因转染组、空白组、双基因转染组。将细胞接种于6孔板，第2天换液，各孔培养液先予不含胎牛血清的培养基冲洗2遍，根据感染复数值计算各孔需要加入的带有目的基因的慢病毒量(病毒滴度为1×10⁹ UT/mL)，将所需的病毒分别加入培养液中，每孔加入的液体总量为2 mL，分别滴加至各孔，摇匀使病毒液与细胞充分接触，置于37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度的孵箱中培养，12-24 h移去病毒液，加入完全培养基，常规培养，待细胞达到80%融合时传代。于转染后3 d取各转染组细胞放至荧光显微镜下观察细胞荧光。并对表达绿色荧光蛋白的细胞进行计数，测算出相应的感染复数值，以计算转染效率。

RT-PCR检测骨形态发生蛋白2和转化生长因子β3基因在各组中的表达：取病毒转染后1周的各组骨髓间充质干细胞，Trizol法提取细胞总RNA，测定RNA浓度，反转录试剂盒对1 μg的RNA进行反转录获得cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增目的片段。PCR引物由上海生工生物有限公司合成。骨形态发生蛋白2上游引物：5’-CCA ACC ATG GAT TCG TGG TG-3’，下游引物：5’-GGT ACA GCA TCG AGA TAG CA-3’；转化生长因子β3上游引物：5’-TGG CTG TTG AGA AGA GAG TCC-3’，下游引物：5’-TGC TTC AGG GTT CAG AGT GTT-3’；内参GAPDH上游引物：5’-GCC TGG AGA AAG CTG CTA AGT A-3’，下游5’-CGT TGT CAT ACC AGG AAA TGA G-3’。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，98 ℃变性10 s，62 ℃(内参60 ℃)退火30 s，72 ℃延伸45 s，38个循环(内参36个循环)。最后72 ℃延伸10 min。扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳分离后再用Quantity one 4.6软件测吸光度值来定量。

Western blot检测骨形态发生蛋白2和转化生长因子β3蛋白的表达：取病毒转染后1周的各组细胞，用PBS冲洗3遍，用细胞刮子使细胞脱壁，PBS重悬洗涤离心，收获细胞。细胞沉淀加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂混合液(100∶1)冰上裂解1 h，超声裂解，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液加入上样缓冲液95 ℃水浴 10 min。-80 ℃保存。比色法测定蛋白浓度，定量上样进行8%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳1.5-2.0 h。转膜后加一抗稀释液(骨形态发生蛋白2抗体：1∶1 000；转化生长因子β3抗体：1∶200)4 ℃过夜，第2天PBS-T洗膜，PBS-T洗膜10 min×3次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)在37 ℃孵育1 h，PBS-T洗膜5 min×3次，1×PBS洗膜5 min×3次，化学发光试剂显色1 min左右，置于暗盒内，X射线显影、定影后曝光。应用Quantity one 4.6软件测量各条带的吸光度值。以β-actin作为内参照。

主要观察指标：各组骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β3的表达。

统计学分析：由第一作者采用Quantity one 4.6软件进行吸光度分析，结果用x(_)±s表示，所有数据在SPSS 19.0中以独立样本t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞在不同诱导条件下可向成软骨、成骨、成脂肪细胞等分化^[11-14]，且具有取材方便、便于分离、体外增殖能力强、不存在免疫排斥及疾病传播等优点，是目前骨组织工程中应用最为广泛的种子细胞^[15]。研究证实单纯骨髓间充质干细胞作为种子细胞向成骨细胞分化较慢，需要细胞因子及特定微环境的诱导，而且成骨分化后细胞表型的维持也需要细胞因子的作用^[16]。

目前研究表明骨形态发生蛋白2是成骨诱导能力最强的因子之一，是调控骨髓间充质干细胞向成骨方向定向分化的主要因子，并且已开始应用于临床^[17]。骨形态发生蛋白2是骨生长的启动因子，来源于骨及骨源性细胞，是骨代谢的旁分泌产物^[18]。但其诱导新骨形成也需要一些生长因子的参与，以促进软骨细胞和成骨细胞的增殖和分化，诱导软骨和骨基质的合成，从而促进骨形成^[19-20]。

转化生长因子β在病理性瘢痕(增生性瘢痕、瘢痕疙瘩)的形成中扮演着相当重要的角色^[21-22]，其中转化生长因子β3是创伤愈合过程中重要的调控因子，且前期研究已证实转化生长因子β3比转化生长因子β1更加优越的诱导能力。转化生长因子β虽无异位成骨能力，但它能增加骨形态发生蛋白的诱导成骨量，其主要通过促进间充质干细胞及骨细胞的分裂增殖、促进骨细胞产生Ⅰ型胶原、抑制软骨细胞生成Ⅱ型胶原、增强基质钙化以及对周围的成骨细胞的趋化作用等来增加骨形态发生蛋白的诱导成骨能力。

成骨是一个复杂的多因素参与的过程^[23]，除了骨形态发生蛋白等生长因子外，细胞外基质也发挥一定作用，最近有研究证实转化生长因子β信号通路中相应蛋白(Smad2蛋白分子)在成骨细胞的形成过程中起到至关重要的调控作用，可以通过调节多种细胞因子促进成骨细胞的增殖分化，其在骨代谢的调节网络中占有重要地位。

近年的研究表明骨形态发生蛋白2作为成骨诱导分化因子，主要在骨创伤愈合早期发挥作用，而转化生长因子β3主要在愈合后期调节成骨细胞的增殖，促进骨质的形成和成熟。因此，骨形态发生蛋白2和转化生长因子β3的联合应用可能形成积极的骨生长代谢反馈机制，使良好的诱导成骨效应长久保持。实验旨在将骨形态发生蛋白2、转化生长因子β3基因共转染入骨髓间充质干细胞，从分子水平及蛋白水平检测其表达情况，旨在为临床中应用基因学方法治疗骨缺损提供新的思路。

利用病毒载体系统将外源性基因导入种子细胞是当今骨缺损基因治疗研究的热点，包括反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和痘病毒等^[24-26]。近年来，新建立的慢病毒载体系统被广泛应用于各类基因治疗实验研究^[27-28]，它不仅能感染分裂期细胞，也可感染非分裂细胞，且对淋巴细胞、干细胞和多种原代细胞等难转染的细胞具有较高的转染效率。通过慢病毒载体系统，外源基因高效导入宿主细胞后，会整合到宿主细胞基因组DNA中，从而在细胞中稳定长期目的基因。更重要的是，慢病毒转染体系不会产生细胞损伤及免疫反应^[27]。

实验利用慢病毒将骨形态发生蛋白2及转化生长因子β3基因共转染至骨髓间充质干细胞，并设单基因转染及未转染对照。RT-PCR和Western blot结果显示：在基因和蛋白水平均可见骨形态发生蛋白2和转化生长因子β3的共表达，而且表达量明显高于单基因转染组，并且可以稳定传代，说明慢病毒载体确实已稳定整合到宿主细胞基因组DNA中，且将外源基因稳定传给子代骨髓间充质干细胞，从而达到外源基因的稳定高效表达，而不是一过性释放或仅局限于一代细胞的瞬时表达。稳定长期的基因表达对于构建组织工程骨修复长段骨缺损，特别是对由于肿瘤切除、骨不连和关节置换翻修造成的较为严重的骨缺损十分重要。实验证实在细胞繁殖分化的同时可持续表达目的产物，提示在维持稳定的诱导环境下，骨形态发生蛋白2和转化生长因子β3可共转染入骨髓间充质干细胞，可能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化。这为临床提高假体表面的骨长入与整合，提高假体-骨界面接触，提高人工关节假体生存率，改善关节置换后远期疗效，防止关节假体松动提供了实验依据。

骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化是一个复杂的过程，许多因素决定其转归，生长因子对细胞的作用不是单一的过程，是一种复杂的网络式的调节，生长因子对细胞作用的量效关系、时效关系、细胞因子之间的相互作用及反馈调节尚需进一步研究。因此，合理有效的利用细胞生长因子在体外促进骨髓间充质干细胞的增殖、分化，表达成骨细胞表型，在成骨组织工程中有着不可替代的作用。

综上所述，当转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2共转染时，基因及蛋白的表达量都较单基因转染的表达量强，因此，骨形态发生蛋白2的异位骨诱导作用弥补了单基因转化生长因子β3的不足，使转化生长因子β3的诱导增殖能力增强，而转化生长因子β3能增加骨形态发生蛋白2的诱导能力。它们之间相互作用、相互促进，实现良好的协同作用，但是在这一过程中转化生长因子β3如何实现促进形态发生蛋白2为基础的诱导，有待于进一步研究探讨。

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞

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