快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.19.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前常用的成脂刺激剂主要由胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛组成，该体系涉及处理因素多、诱导周期长且对细胞毒性大，不利于脂肪形成抑制效应的研究。
目的：建立快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系。
方法：大鼠全骨髓细胞原代培养，胰酶消化传代，富集形态均质的间充质干细胞，利用过氧化物酶体增殖物活化受体γ激动剂噻唑烷二酮类药物罗格列酮和吡咯列酮体外单独诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化，设立无糖、低糖和高糖DMEM三种基础培养体系，以经典的成脂刺激剂作为阳性对照，在诱导的不同时间点对分化细胞进行形态学观察和油红O染色。
结果与结论：与经典成脂刺激剂相比，罗格列酮或吡咯列酮单独均能诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，吡咯列酮诱导48 h和罗格列酮诱导72 h均可观察到富含脂滴或脂泡以及油红O染色的阳性细胞，吡咯列酮与罗格列酮的最佳诱导浓度分别为0.125 mmol/L和10 μmol/L，而高糖环境利于大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化。说明基于高糖培养环境的以吡咯列酮或罗格列酮做为成脂刺激剂的培养体系可快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 成脂分化, 快速诱导, 罗格列酮, 吡咯列酮, 噻唑烷二酮, 胰岛素增敏剂, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The commonly used adipogenic irritants consist of insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine and indomethacin. The system is not conducive to the study of adipogenesis inhibitory effect due to the disadvantages of multi-processing factors, long induction period and great cytotoxicity.
OBJECTIVE: To develop a rapid culture method to induce adipogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Rat whole bone marrow cells were primary cultured and passaged with trypsin digestion method. The homogeneous mesenchymal stem cells were enriched, and adipogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells were in vitro induced with thiazolidinediones (rosiglitazone and pioglitazone), the agonists of peroxisome proliferator-activated receptor γ. Glucose-free, low glucose and high glucose Dulbecco's modified Eagle's media were established, and the classic adipogenic irritants were as the positive control. Morphological observation and oil red O staining were performed to observe the differentiated cells at different time points.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the classic adipogenic irritants, the rosiglitazone and pioglitazone could induce the rat bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into adipocytes, and accumulations of lipid droplets or lipid vesicles and oil red O staining positive cells could be observed after induced with pioglitazone for 48 hours and rosiglitazone for 72 hours. The optional concentration of pioglitazone and rosiglitazone for adipogenic induction was 0.125 mmol/L and 10 μmol/L, respectively. High glucose could enhance the adipogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. The culture system with the adipogenic irritants of pioglitazone and rosiglitazone under the high glucose environment can rapidly induce the rat bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into adipocytes.

Key words: stem cells, bone marrow-derived stem cells, adipogenic differentiation, rapid induction, rosiglitazone, pioglitazone, thiazolidinediones, insulin sensitizer, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

石小青，华先良，温冠媚. 快速诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的培养体系[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(19): 3430-3436.

Shi Xiao-qing, Hua Xian-liang, Wen Guan-mei. In vitro rapid culture system to induce the adipogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(19): 3430-3436.

图/表（结果） 6

2.1 大鼠骨髓间充质干细胞形态学特征 原代培养早期，以悬浮、折光性强的圆形细胞为主，24 h后部分细胞完成贴附过程，呈圆形或类圆形外观，48 h后开始分裂增殖，先形成散在分布的细胞小团簇，大多呈现成纤维细胞的梭形外观，可通过多次换液去除悬浮细胞的造血细胞，72 h后全量换液，7-10 d后，贴壁细胞数目明显增多，胞体增大，呈长梭形，伴长而粗大的突起，有1-3个圆或椭圆形核，核仁清晰，2-5个不等，少数细胞为三角形或多角形；贴壁细胞多聚集成群，以克隆样方式生长，10-14 d后，多个克隆可汇合成均质的长梭形细胞单层，有明显的方向性，呈平行、旋涡状、辐射状排列。经消化传代后，细胞的生长周期一般为5-7 d，P₄、P₁₁的细胞仍可呈高度均质的梭形细胞群，平行或旋涡状方式生长，见图1。

2.2 大鼠骨髓间充质干细胞流式细胞鉴定结果 见图2。对分离和富集得到的大鼠骨髓间充质干细胞的流式分析表明，大鼠骨髓间充质干细胞(P₄)的表型为CD34^-CD45^-CD29⁺CD44⁺CD105⁺ CD166⁺，体外诱导可分化为脂肪、成骨和神经元样细胞。因此，从形态学、流式分析、体外分化潜能均支持分离富集得到的细胞群中含有骨髓间充质干细胞。

2.3 高糖、低糖、无糖培养体系对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响 结果发现，与无糖组相比，在诱导后第7天，低糖和高糖组胞浆内均可观察到含强折光性脂滴的脂肪细胞，第11天脂肪细胞明显增多，以高糖组尤为明显。未加任何成脂刺激剂的对照组，未观察到脂肪细胞。将诱导11 d的细胞固定后行油红O染色，可见胞浆内富含呈橘红色大脂滴和脂泡的成熟脂肪细胞。虽然无糖组也可检测到油红O染色阳性细胞，但脂滴呈细颗粒状、弥散性分布于胞浆，极少形成特征性的富含大脂滴或融合性脂泡的成熟脂肪细胞，见图3，4。

2.4 罗格列酮和吡格列酮诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化结果 第4代骨髓间充质干细胞经罗格列酮0.125，0.25 mmol/L单独诱导3 d和吡格列酮1，5， 10 μmol/L单独诱导48 h后，倒置-相差显微镜下可观察数量不等的脂滴或脂泡形成细胞，见图5。

油红O染色胞浆内脂滴或脂泡呈橘红色的成熟脂肪细胞，见图6。以0.125 mmol/L罗格列酮和10 μmol/L吡格列酮尤为明显，对照组未观察到含脂滴的脂肪细胞，见图7。

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引言

肥胖也已成为全球面临的严重的公共健康问题，它可以增加2型糖尿病、高脂血症、心血管等疾病的风险。肥胖的主要病理特征表现为脂肪细胞增殖和分化调控异常，如脂肪细胞过度肥大和异常增生^[1]。深入探讨脂肪发生和脂肪细胞形成的分子调控机制，对于干预肥胖相关性疾病有重要的指导意义。

目前，用于体外研究脂肪分化的细胞主要有鼠源性脂肪前体细胞株(如3T3-L1，3T3-F44A，ST2)和间充质干细胞^[2-3]。基于鼠源性脂肪前体细胞的研究，不仅发现了一系列诱导脂肪分化的关键调控因子(CCAAT/C/EBPs，PPARλ)，在阐明抑制脂肪分化的信号通路方面也有新进展^[4-6]。而间充质干细胞，尤其是骨髓间充质干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，在特定体外环境下，能分化为骨和脂肪等多种组织细胞类型，被认为是骨和脂肪的共同前体细胞。脂肪发生或脂肪细胞的形成涉及多个细胞学事件，典型的脂肪发生可以分为两个时相：决定相和终末分化相^[7]。

与鼠源性脂肪前体细胞株相比，骨髓间充质干细胞不仅能更好地模拟脂肪发生的两个时相，而且遗传学性状稳定，无需经过特殊筛选和克隆扩增^[8]。目前常用的成脂刺激剂主要由胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛组成，该体系涉及处理因素多、诱导周期长且对细胞毒性大，不利于脂肪形成抑制效应的研究，有必要建立一种诱导因素单一、快速、高效的成脂分化诱导体系。实验利用胰岛素增敏剂——噻唑烷二酮类药物(TZDs)单独进行成脂诱导，不仅优化了诱导条件，明显缩短了诱导周期为2-4 d，而且降低了细胞的死亡率，为基于骨髓间充质干细胞的前体脂肪细胞形成和前体脂肪细胞分化调控提供了可以借鉴的快速诱导体系。

材料方法

设计：动物实验，细胞形态学观察。

时间及地点：2011年7至12月在广州医学院基础学院病理生理学整体动物实验室进行实验。

材料：

实验动物：健康SD乳鼠30只，二三周龄，雄性，平均体质量(35±5) g，SPF级，由广东省实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK(粤)2008-0002。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

体外快速诱导建立大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化培养体系实验的试剂与药品：

Main reagents and drugs:

实验方法：

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养：采用全骨髓细胞原代培养法^[9]，SD乳鼠颈椎脱臼致死后，浸泡于体积分数75%乙醇2-4 min，无菌条件下充分分离双侧股骨，无血清培养液清洗其表面后移至无菌培养皿中，去除骨骺端暴露骨髓腔，用充满含血清培养液的注射器反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液到15 mL离心管中，离心半径12.5 cm，1 000 r/min，离心3 min，弃上清，用含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养液重悬，接种于T25培养瓶中，第10-14天待细胞生长汇合后，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后按1∶3的比例进行传代，连续传代扩增，富集形态均一的大鼠骨髓间充质干细胞，实验选用第4-10代的大鼠骨髓间充质干细胞(P₄- P₁₀)进行体外诱导。

流式细胞术分析：将P₄骨髓间充质干细胞消化、离心、重悬并调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。在制备好的细胞悬液中分别加入以下荧光素标记抗体：Fluorescein isothiocyanate(FITC)- mouse anti human(rat)CD44、CD45、CD166；Phycoerythrin(PE)- anti rat CD29、CD34、CD105 和 anti mouse (mu)H-2d 、PE-anti mu IgG2a、FITC-/PE-anti mu IgG1，4 ℃孵育30 min后，用含0.1%BSA的PBS洗涤、重悬细胞，移入专用测试管，应用流式细胞仪(FACSVantage)检测，联机专用软件Cell Quest分析。

大鼠骨髓间充质干细胞体外成脂诱导：

高糖、低糖、无糖培养条件对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响：以含高糖(含葡萄糖4.5 g/L，成脂诱导的最适合浓度)、低糖(含葡萄糖1 g/L)、无糖DMEM培养液的成脂诱导体系(胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、IBMX)诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化，采用“3+3”循环诱导及维持方案：细胞汇合成单层后再继续培养3 d，第4天加入成脂诱导培养液(AIM：胰岛素、吲哚美辛、地塞米松、IBMX)孵育3 d，然后更换为维持培养液(AMM：仅含10 mg/L胰岛素)维持3 d，为1个诱导周期，共进行3个周期，之后以成脂诱导培养液维持至第18-21天。分别在诱导前、诱导后第3，7，11天，3个循环后(3周)进行细胞形态学观察和油红O 染色。

噻唑烷二酮类体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化：在DMEM培养液中加入不同工作浓度的罗格列酮0.125，0.25和0.5 mmol/L和吡咯列酮1，5和 10 μmol/L，单独定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化，分别在诱导前(0 h)、诱导后24，48，72 h通过倒置-相差显微镜以及油红O染色对分化细胞进行鉴定。

油红O染色法：油红O是常用的亲脂性染料，与胞浆中的三酰甘油结合形成脂滴状，呈橘红色，可用于鉴定脂滴形成细胞或脂肪细胞。配制油红O染液：油红O干粉0.4 g加入到10 mL异丙醇(分析纯)中，密封，置于37 ℃水浴中加温，使其充分溶解，此为母液。母液以3∶2比例与三蒸水混匀并过滤，取滤液作为工作液。取细胞爬片用PBS冲洗3遍，用滤纸吸去多余水份，体积分数10%中性甲醛固定10 min，油红O染液中浸染20 min，之后用60%异丙醇洗去多余染液，三蒸水冲洗3次；Mayer氏苏木精复染5-10 min，1%盐酸稍分化，三蒸水漂洗10 min，倒置相差显微镜下观察并拍照。

主要观察指标：观察诱导不同时间点骨髓间充质干细胞的形态特征和油红O染色结果。

讨论

骨髓间充质干细胞是常用于研究脂肪细胞增殖分化及调控的体外细胞培养模型。骨髓间充质干细胞在体外通过胰岛素、地塞米松及IBMX(3-isobutyl-1- methylxanthine)的诱导模拟脂肪细胞分化过程，该法由于稳定性好，重复性与分化率高而已被广泛采用，不足的之处是涉及处理因素多、诱导周期长且细胞毒性大，尤其是不利于抑制脂肪分化方面的研究。Ninomiya等^[10]用罗格列酮替代了吲哚美辛的优化体系(DIMRo)联合诱导人骨髓骨髓间充质干细胞成脂分化，结果发现，该方法诱导成脂分化的时程缩短，由两三周明显缩短至七八天，且成脂率明显提高，经此方法处理第4天后，油红O染色显示人大鼠骨髓间充质干细胞分化为富含脂滴的脂肪细胞明显增多，荧光定量PCR可检测到一系列脂肪细胞分化的特异性标志基因如PPARγ、人脂肪型脂肪酸结合蛋白、脂蛋白酯酶的表达增加，以第7天尤为显著，western blot也检测到调控脂肪分化的转录因子PPARγ2蛋白的高表达，推测DIMRo加速大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化与PPARγ2表达提前与上调密切相关。

罗格列酮与比格列酮属于噻唑烷二酮类药物，作为一种胰岛素增敏剂被广泛用于治疗Ⅱ型糖尿病，其疗效已得到广泛认可，但长期使用导致疏松及骨质疏松性骨折的发生率增加已日益受到重视^[11]。噻唑烷二酮类是通过激活核转录因子PPARγ起作用的，PPARγ是噻唑烷二酮类的天然靶点^[12-13]。体内、外实验发现，噻唑烷二酮类显著增加大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化能力，呈明显剂量-依赖效应。大量研究表明，骨髓间充质干细胞向脂肪细胞和成骨细胞的分化之间存在密切的互反关系，不排除噻唑烷二酮类促成脂分化优势可通过削弱或抑制骨髓间充质干细胞成骨分化倾向凸显出来，从而导致成骨作用减弱^[10-15]，这可能是噻唑烷二酮类致骨质疏松的重要机制，同时也是选用噻唑烷二酮类做为成脂刺激剂的实验基础。Ninomiya等优化的成脂诱导体系虽然缩短了诱导骨髓间充质干细胞成脂分化时程和提高成脂分化效率，但仍无法解决多因素的影响，研究中发现罗格列酮单独无法诱导人骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。也有研究报道罗格列酮单独诱导小鼠脂肪前体细胞3T3-L1可分化为脂肪细胞；此外，国内方海宁等^[16]观察不同糖浓度下吡格列酮对大鼠骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的影响，分别在高糖和正常糖浓度的成脂诱导体系如地塞米松、IBMX、胰岛素等加入不同浓度的吡格列酮联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞3周，与正常糖浓度相比，高糖组脂肪细胞数量增多，LPL、PPARγmRNA 表达也明显上调。在两种糖浓度下，吡格列酮均可明显增强成脂刺激剂的成脂诱导效应，表现为脂肪细胞分化明显增多，细胞体积也明显增大，以高糖组尤为显著。由此，高糖环境利于骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化，而吡格列酮则表现为明显的协同作用，呈明显剂量依赖性。噻唑烷二酮类药物致骨质疏松涉及多种机制的综合作用，其中也涉及骨髓间充质干细胞成脂分化增强，而参与脂肪分化调控的重要的核转录因子PPARγ有望成为防治骨质疏松的药物靶点^[17]，因此，探讨噻唑烷二酮类药物对骨髓间充质干细胞成脂诱导效应，对骨质疏松机制研究和临床防治有重要指导作用。

基于此，实验通过全骨髓培养，胰酶消化连续传代富集到形态均一、具有严格生长方向性的骨髓间充质干细胞。为了保证细胞的多向分化潜能，主要选用第4至第10代之间的细胞进行体外诱导^[18]。通过体外实验，对无糖、低糖和高糖诱导体系如地塞米松、胰岛素、IBMX、吲哚美辛等诱导大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化能力进行了比较，结果发现，除无糖培养体系外，低糖和高糖均可诱导骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞，而高糖明显优于低糖，这与方海宁等报道的结果相符，然而不影响其诱导时程，仍需两三周。随后，实验选择高糖培养基作为基础培养基，分别观察不同浓度的罗格咧酮与吡咯列酮单独诱导大鼠骨髓间充质干细胞的成脂分化效应，结果发现，吡咯列酮诱导48 h与罗格咧酮诱导3 d后，倒置相差显微镜及油红O染色均可观察成熟的脂肪细胞，吡咯列酮与罗格咧酮的最佳浓度分别为 0.125 mmol/L和10 μmol/L，罗格列酮的浓度比Ninomiya等所用的浓度(1 μmol/L)高10倍，由此，单独用药的浓度要明显高于联合用药组，可见，单独或联合使用噻唑烷二酮类均可促进骨髓间充质干细胞分化进程，具体机制尚不明确^[19-20]。此外，实验也发现，外源性噻唑烷二酮类并不影响成脂刺激剂包括地塞米松、胰岛素、IBMX、吲哚美辛等诱导成脂效应，而且，随着细胞代数增加超过第10代，骨髓间充质干细胞向脂肪分化的能力会衰减甚至消失，因此尽量选取代数较低的细胞进行诱导，同时还应考虑到骨髓间充质干细胞的种属差异以及噻唑烷二酮类衍生物对细胞的选择性，否则会得到截然相反的结果。

因此，实验在大鼠骨髓间充质干细胞层面建立了单独采用噻唑烷二酮类快速诱导脂肪分化的培养体系，可望为基于大鼠骨髓间充质干细胞作为细胞模型开展脂肪形成和分化调控或药物的筛选提供了实验基础。至于，能否适用于人骨髓或其他组织来源的骨髓间充质干细胞？罗格列酮和吡咯列酮以外的其他噻唑烷二酮类衍生物是否也发挥类似效应？具体又是通过何种信号通路进行调控？仍需进一步深入探讨。