基因转染脐带间充质干细胞与丝素蛋白构建组织工程脂肪

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.005

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (14): 2501-2508.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.14.005

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基因转染脐带间充质干细胞与丝素蛋白构建组织工程脂肪

刘毅，唐军，李世龙

解放军兰州军区兰州总医院全军烧伤整形外科中心，甘肃省兰州市 730050

收稿日期:2012-09-10 修回日期:2012-10-18 出版日期:2013-04-02 发布日期:2013-04-02
作者简介:刘毅☆，男，1964年生，江苏省盐城市人，汉族，1998年解放军第四军医大学毕业，博士，教授，主任医师，主要从事脂肪组织工程研究。 liuzhh20002003@yahoo.com.cn
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(30872689，30870268)；全军医学科研“十二五”重点课题(BWS11C061)。

Constructing tissue-engineered adipose with the combination of gene-transfected human umbilical cord mesenchymal stem cells and silk fibroin scaffold

Liu Yi, Tang Jun, Li Shi-long

Military Center of Burns and Plastic Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China

Received:2012-09-10 Revised:2012-10-18 Online:2013-04-02 Published:2013-04-02
About author:Liu Yi☆, Doctor, Professor, Chief physician, Center of Military Burns and Plastic Surgery, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of Chinese PLA, Lanzhou 730050, Gansu Province, China liuzhh20002003@yahoo.com.cn
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No.30872689, 30870268*; Key Program in Military Medical Science Research during the “Twelfth Five-year” Plan Period, No. BWS11C061

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前国内外构建组织工程脂肪的方法并不完善，虽然构建出了脂肪，但效果不理想。
目的：探讨一种新的构建组织工程脂肪的方法，观察携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白复合后在Wistar大鼠体内构建组织工程脂肪的能力。
方法：分离培养人脐带间充质干细胞，将携带重组人胰岛素基因慢病毒载体以最适MOI=10转染人脐带间充质干细胞，将转染组与未转染组(对照组)的人脐带间充质干细胞分别接种于丝素蛋白支架，移植于Wistar大鼠背部皮下。移植后12周取材，行荧光原位杂交技术鉴定、组织形态学和扫描电镜观察。
结果与结论：①油红O染色显示，两组移植物均呈阳性，证明移植物已在体内合成为脂肪组织，转染组脂肪样细胞数量明显高于对照组(P < 0.01)。②苏木精-伊红染色显示，两组移植物组织结构与正常脂肪组织相似，可见明显新生血管。转染组支架材料降解明显，炎性细胞浸润明显少于对照组，新生血管数量也多于对照组。③扫描电镜观察提示，转染组移植物内脂肪样细胞聚集成团，其结构与正常脂肪组织相似；对照组脂肪样细胞散在分布于支架孔隙内。④提示胰岛素基因能明显促进人脐带间充质干细胞成脂肪化，携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白支架复合后，在Wistar大鼠体内能构建出组织工程化脂肪组织，其结构类似正常脂肪组织。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 组织工程脂肪, 人脐带间充质干细胞, 丝素蛋白, 支架, 胰岛素, 基因转染, 慢病毒载体, 移植, Wistar大鼠, 体内实验, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: The method of construction of tissue-engineered adipose is imperfect at present. Although the tissue-engineered adipose can be constructed, the efficacy is not satisfactory.
OBJECTIVE: To study the new method of construction of tissue-engineered adipose, in order to observe capacity of human umbilical cord mesenchymal stem cells transferred with recombinant insulin gene lentiviral vector combined with silk fibroin scaffold in the construction of tissue engineering adipose in Wistar rats.
METHODS: Human umbilical cord mesenchymal stem cells were separated and cultured, and then transfected with recombinant insulin gene lentiviral vector (transfected group) by the best multiplicity of infection =10. The nontransfected human umbilical cord mesenchymal stem cells were regarded as control group. The human umbilical cord mesenchymal stem cells in the transfected group and the control group were seeded onto the silk fibroin scaffold and implanted into the subcutaneous layer of Wistar rats. At 12 weeks after implantation, the transplants were taken, and then identified with fluorescence in situ hybridization and observed with histomorphology and scanning electron microscopy.
RESULTS AND CONCLUSION: Oil red O staining showed the transplants in two groups were positive, suggesting that the transplants were synthesized in adipose tissue, and the number of fat-like cells in the transfected group was significantly higher than that in the control group (P < 0.01). Hematoxylin-eosin staining showed significant angiogenesis appeared in or around the new formed tissue, the structure of which was similar to natural adipose tissue. Silk fibroin scaffold in the transfected group was degraded significantly, the number of new vessels in the transfected group was more than that in the control group, and inflammatory cell infiltration in the transfected group was significantly less than that in the control group. Scanning electron microscopy results showed that fat-like cells in the trasnfected group congregated and the structure was similar to that of the normal adipose tissue; the fat-like cells in the control group scattered in the pore of the scaffold. Insulin gene could obviously promote human umbilical cord mesenchymal stem cells to differentiate into adipose; human umbilical cord mesenchymal stem cells transferred with recombinant human insulin gene lentiviral vector composite with silk fibroin scaffolds can construct tissue-engineered adipose in the Wistar rats, and its structure is similar to natural adipose.

Key words: stem cells, umbilical cord blood stem cells, tissue-engineered adipose, human umbilical cord mesenchymal stem cells, silk fibroin, scaffold, insulin, gene transfection, lentiviral vector, transplantation, Wistar rats, in vivo experiment, National Natural Science Foundation of China, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

刘毅，唐军，李世龙. 基因转染脐带间充质干细胞与丝素蛋白构建组织工程脂肪[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(14): 2501-2508.

Liu Yi, Tang Jun, Li Shi-long. Constructing tissue-engineered adipose with the combination of gene-transfected human umbilical cord mesenchymal stem cells and silk fibroin scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(14): 2501-2508.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 实验纳入6只Wistar大鼠，其中1只大鼠于移植3个月后未发现对照组移植物的存在，考虑被周围组织吸收，故将该只大鼠样本剔除。

2.2 丝素蛋白支架的大体及扫描电镜观察结果 丝素蛋白支架具有天然多孔三维空间结构，支架内部孔径大小均一，且相互交通，孔径为50-60 μm，孔隙率为90%，见图1。

2.3 对照组及转染组移植物大体观察结果 从图2可见，转染组移植物平均体积约0.5 cm×0.4 cm×0.5 cm，呈淡黄色，钳夹显示其质地较软，弹性与大鼠正常脂肪组织相似；对照组移植物平均体积约0.5 cm×0.8 cm× 0.3 cm，呈黄褐色，但质地较硬。

2.4 对照组及转染组移植物组织学观察结果 两组移植物油红O染色均呈阳性，证明移植物为脂肪组织。转染组移植物内含脂肪样细胞数量显著高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

苏木精-伊红染色结果观察，两组移植物结构与正常脂肪组织相似，脂肪样组织内及其周围可见新生血管，未降解的支架材料周围有炎性细胞浸润，见图3-5；转染组丝素蛋白材料降解明显，新生血管数量也明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1；对照组移植物内仍可见支架材料大体结构。

2.5 对照组及转染组移植物扫描电镜观察结果 扫描电镜观察，两组移植物内可见脂肪样细胞和新生血管。转染组移植物内脂肪样细胞聚集成团，其结构与正常脂肪组织相似；对照组脂肪样细胞则散在分布于支架材料孔隙内，见图4，5。

2.6 对照组及转染组移植物荧光原位杂交技术鉴定结果 荧光显微镜下观察，可见对照组移植物中无红、绿荧光信号(红色代表Y染色体，绿色代表X染色体)表达，表明该移植物可能为Wistar大鼠自身脂肪组织。而转染组移植物中细胞核同时显示一红一绿两个荧光信号，即移植物细胞有人X、Y基因表达，提示该移植物为外来物，并非Wistar大鼠自身所有，即本实验所构建的组织工程化脂肪，见图6。

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引言

材料方法

设计：体内对比观察实验。
时间及地点：于2010年9月至2011年9月在解放军兰州军区兰州总医院骨科研究所、动物科、医学科学实验中心和兰州大学电镜中心完成。
材料：
脐带：取自解放军兰州军区兰州总医院妇产科足月剖宫健康产妇，取材前均经产妇本人及其家属授权同意，且得到医院伦理道德委员会批准。
丝素蛋白支架：浙江大学闵思佳教授惠赠。
实验动物：SPF级雌性Wistar大鼠6只，体质量80-100 g，由兰州大学医学动物中心提供，生产许可证号：SCXK(甘)2009-0004。
转染人胰岛素基因脐带间充质干细胞-丝素蛋白复合物体内实验的主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments:

实验方法：
人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定：脐带取自健康足月顺产儿(解放军兰州军区兰州总医院妇产科提供，脐带采取前均征得产妇及其家属知情同意)，按本实验室建立的方法分离、培养及鉴定人脐带间充质干细胞^[5]。
丝素蛋白支架的处理与扫描电镜观察：将丝素蛋白支架剪切成1 cm×1 cm×0.2 cm大小，置于装有蒸馏水的玻璃瓶中，用γ射线灭菌，辐射剂量10 kGy；在超净台内用LG-DMEM细胞培养液浸泡24 h，更换培养液3次；取1块丝素蛋白支架，用4%戊二醛固定24 h，扫描电镜观察。
重组慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞：以最适MOI=10，病毒滴度为1.3×10⁸ TU/mL，按本实验室建立的方法进行重组慢病毒转染人脐带间充质干细胞^[6]：将培养的P3人脐带间充质干细胞以5×10⁵个/孔接种于6孔培养板中，次日以最适MOI=10感染慢病毒，病毒感染时所用培养基中预先加入polybrene(终浓度8 mg/L)；病毒加入后6 h，换新鲜不加polybrene的培养基，37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中继续培养。病毒感染后72 h收集细胞。
人脐带间充质干细胞与丝素蛋白支架复合培养：将 1 cm× 1 cm× 0.2 cm的丝素蛋白支架置24孔板中，分别取重组慢病毒转染的P3 人脐带间充质干细胞(转染组)和同代未转染的人脐带间充质干细胞(对照组)细胞悬液100 μL，细胞浓度3×10⁹ L^-1，滴在支架材料上，将孔板置37 ℃ CO₂ 恒温培养箱内静置三四小时；而后向24孔板中添加LG-DMEM培养基完全淹没细胞-支架复合物，再置于37 ℃ CO₂恒温培养箱内培养，24 h后更换为成脂诱导剂，培养5-7 d。
人脐带间充质干细胞-丝素蛋白支架复合物移植：将人脐带间充质干细胞-丝素蛋白支架复合物移植于Wistar大鼠背部皮下两侧，左侧为转染组，右侧为对照组。12周后，断颈处死大鼠，取出植入物。肉眼观察植入物形态、大小、色泽，钳夹判断质地；石蜡切片与冰冻切片，分别行苏木精-伊红染色、油红O染色、扫描电镜观察。
移植物鉴定：将上述样本的石蜡切片运用荧光原位杂交检测标本中的性染色体：①标本处理：将植入3个月后的移植物从Wistar大鼠体内取出，体积分数10%中性甲醛固定48 h以上，进行石蜡切片。常规脱蜡脱水：将石蜡切片置于65 ℃烤片机中烤片2 h以上，二甲苯脱蜡10 min(37 ℃)2次，再依次经体积分数100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、蒸馏水洗各3 min，90 ℃蒸馏水水浴20 min，2×SSC放置30 s。晾干后对切片进行消化：37 ℃下蛋白酶K消化15 min，体积分数10%中性甲醛中固定10 min，2×SSC洗5 min，依次经体积分数70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇各3 min，自然干燥玻片。②荧光原位杂交：取10 μL探针混合液(8 μL杂交液+2 μL探针)于上述处理的组织标本上，封固，置入杂交仪中，83 ℃变性5 min后，37 ℃杂交过夜。次日，将杂交后的切片置入(46±1)℃的2×SSC 洗10 min，(46±1)℃的0.1%NP-40/2×SSC洗5 min，然后室温下体积分数70%乙醇3 min，暗处自然干燥玻片，最后加10 µL二脒基苯基吲哚于杂交区域并盖上盖玻片，暗处放置 10-20 min，在荧光显微镜下选用合适的滤片组观察不同颜色的信号，通过IMStar软件进行图像合成。
移植物中脂肪样细胞数量与新生血管数量的定量分析：在160倍倒置显微镜下观察转染组(n=5)和对照组(n=5)移植物油红O染色后的脂肪样细胞数量，每个样本任选10个视野行统计学分析；在100倍倒置显微镜下观察转染组(n=5)和对照组(n=5)移植物苏木精-伊红染色后的新生血管数量，每个样本任选10个视野行统计学分析。
主要观察指标：移植物中脂肪样细胞数量与新生血管数量，扫描电镜观察结果。
统计学分析：统计学处理者为第二、三作者，数据以x±s表示，应用SPSS 13.0统计学软件对数据进行t检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

临床上常应用游离脂肪组织移植修复软组织缺损，但却面临着移植物液化、再吸收和油脂囊肿形成等问题，而且移植数月后，逐渐丧失脂肪细胞特性，并被成纤维细胞所替代，限制了移植组织中细胞的成活和增殖。脂肪组织工程为解决上述问题提出了一条新的思路。成功构建与移植组织工程脂肪的方案包括4个要素：①种子细胞的获取。②调控种子细胞增殖、分化的细胞因子。③与种子细胞具有良好生物相容性的三维支架。④受区具有与移植物建立血液循环的条件。

种子细胞是组织工程的核心，它是再生新组织的源泉。增殖和多向分化是组织工程种子细胞的两个最主要的细胞生物学指标。目前骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞是脂肪组织工程种子细胞的主要选择对象。但是骨髓间充质干细胞取材受限，由人体骨髓穿刺所得，为患者带来一定程度的痛苦，且细胞的扩增及分化能力随供体年龄的增长而明显下降，并有高度病毒感染的可能性。而脂肪间充质干细胞经体外大规模培养后存在明显的“衰老”现象，从而限制了它的移植效力。本文选用人脐带间充质干细胞为种子细胞，基于脐带为胚胎外组织含有大量多向分化的干细胞，细胞生长增殖快速，且为胎儿娩出后的“废弃物”，来源丰富，无伦理学问题^[7]；有研究表明，异体来源的成人间充质干细胞只表达MHCⅠ，而不表达MHCⅡ，用于异体移植修复软组织缺损具有美好前景^[1]；更主要的是人脐带间充质干细胞的增殖分裂模式容易使外源基因导入和表达，因此其成为脂肪组织工程理想的种子细胞^[8-10]。种子细胞的获取主要来源于同种异体的组织，尽管种子细胞免疫原性低，但是免疫反应仍是它所面临的局限性。目前，国外倡导并在进行于胎儿出生时即为其建立个人干细胞库，将很好解决免疫原性这一问题。

基因治疗是基于对活细胞遗传物质的改变而进行的医学治疗，最早应用于遗传性疾病如血友病的治疗，并取得了惊人的疗效。在作者以往的实验中发现，干细胞随着传代次数的增加，其成脂能力明显减弱，常规诱导后的脂肪细胞经胰酶消化后不易成活或成活率低下，这严重阻碍了脂肪组织工程的研究。随着现代分子生物学技术的发展，基因治疗技术为干细胞主动分化带来一线曙光，将胰岛素基因通过载体导入到干细胞，一方面解决成脂能力减弱及成活力低下的问题；另一方面旨在不使用诱导剂的情况下主动分化为成脂肪细胞。

种子细胞在体内外分化、增殖为脂肪细胞的过程中，需要一定的微环境和某些生长因子的调控才能发挥其定向分化的能力^[11]。胰岛素是调控种子细胞向脂肪细胞分化增殖的重要成分。目前研究发现，脂肪细胞的分化大致通过5条信号传导通路来调控，其通路之一则是通过胰岛素或胰岛素样生长因子1作用激活酪氨酸激酶途径。另外，胰岛素可促进新生血管的形成，有利于所构建组织工程脂肪的存活。本实验将携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞，为减少不必要的不良作用和实现重组人胰岛素体内外的定位和跟踪，选择了构建含增强绿色荧光蛋白的pLenti6.3- insulin-IRES-EGFP慢病毒表达载体^[12-13]。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达；能显著提高目的基因转导效率，转染率达90%以上^[6]。结果表明，慢病毒载体并不抑制人脐带间充质干细胞的增殖，且转染胰岛素基因的人脐带间充质干细胞可主动分泌胰岛素，并明显促进人脐带间充质干细胞增殖；在特定成脂诱导环境下，主动分泌的胰岛素明显促进人脐带间充质干细胞向脂肪细胞分化^[14]。

支架材料是构建组织工程化组织的关键因素。本实验选用的丝素蛋白支架材料，具有良好的机械特性和生物相容性、生物降解性，其来源丰富，价格低廉^[15]。Hofmann等^[16]实验表明，间充质干细胞能与丝素蛋白支架在体外良好复合，而且，丝素蛋白对前脂肪细胞具有良好的吸附作用，并能维持前脂肪细胞的正常形态与功能[^17]。在免疫原性方面，Wang等^[18]认为丝素蛋白支架在整个植入期间，所有支架耐受性良好且动物和移植物免疫反应均轻微。既往研究显示，50 μm为构建组织工程脂肪时丝素蛋白支架的最佳孔径^[19]。

本文扫描电镜显示，丝素蛋白支架具有天然多孔三维空间结构，支架内部孔径大小均一，相互交通，孔径50-60 μm，孔隙率为90%，人脐带间充质干细胞与支架材料紧密黏附，生长良好，并分泌细胞外基质，支架有利于细胞的生长^[20]。移植物组织形态观察显示：两组移植物内均可见脂肪样细胞和新生血管生成，转染组移植物内脂肪样细胞数量显著多于对照组(P < 0.01)，且成团聚集，其结构与正常脂肪组织相似；同时，也观察到未降解的支架材料周围有炎性细胞浸润，转染组降解速度快于对照组；究其原因可能是胰岛素基因的表达促进了移植物内脂肪细胞和新生血管的形成，并由于脂肪细胞合成代谢的促进而加速了支架材料的分解。

细胞标记一直是困扰组织工程技术修复机制研究的一大难题，寻找一种直观、长期稳定，又不影响细胞组织形成能力的标记方法非常重要。目前常用的细胞标记方法有性别决定基因Y染色体检测、A1，1’双十八烷-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羧花青-高氯酸盐、5-溴脱氧尿核苷、荧光原位杂交方法、绿色荧光蛋白基因转染、MRI共振示踪等^[21-23]。本实验选用的种子细胞为人脐带间充质干细胞，移植受体为Wistar雌性大鼠。由于人脐带间充质干细胞含有人的X、Y基因，故在实验中选用荧光原位杂交技术检测人X、Y染色体，结果表明，移植物内细胞的细胞核带有一红一绿荧光信号，提示移植物为外源性组织，而非实验动物自身组织。

总之，实验将携带重组人胰岛素基因慢病毒载体转染的人脐带间充质干细胞与丝素蛋白支架复合后，在Wistar大鼠体内成功构建出组织工程化脂肪组织。图2中，直尺测量处为转染组移植物，呈淡黄色，钳夹显示其质地较软，其外无明显纤维膜包被，弹性、外观与大鼠正常脂肪组织相似；对侧为对照组移植物，也呈淡黄色，但质地较硬，表面可见一薄层的纤维膜包被。由此可见，转染组移植物结构更接近于自然脂肪。但该组织工程化脂肪组织能否长期存活，并保持原有组织结构与功能有待于进一步深入研究。

基因转染脐带间充质干细胞与丝素蛋白构建组织工程脂肪

Constructing tissue-engineered adipose with the combination of gene-transfected human umbilical cord mesenchymal stem cells and silk fibroin scaffold

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