独活寄生汤拆方通过Wnt/β-catenin信号通路抑制软骨细胞炎症反应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2885

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (35): 5589-5594.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2885

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独活寄生汤拆方通过Wnt/β-catenin信号通路抑制软骨细胞炎症反应

李慧1，马玉环1，许丽梅2，王圣杰1，许云腾2，何晓娟1，贾良良2，曾建伟2，王丽丽2，李西海2，3，叶蕻芝2，4

1福建中医药大学药学院，福建省福州市 350122；2福建中医药大学中西医结合研究院，福建省福州市 350122；3福建省康复重点实验室，福建省福州市 350122；4福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建省福州市 350122

收稿日期:2019-12-20 修回日期:2019-12-24 接受日期:2020-02-12 出版日期:2020-12-18 发布日期:2020-10-16
通讯作者: 李西海，博士，研究员，福建中医药大学中西医结合研究院，福建省福州市 350122
作者简介:李慧，女，1993年生，内蒙古自治区包头市人，汉族，福建中医药大学在读硕士，主要从事骨关节炎相关研究。
基金资助:
中国博士后科学基金第60批面上资助(2016M600625)；中国博士后科学基金第10批特别资助(2017T100591)

Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription inhibits chondrocyte inflammatory response throughbased on Wnt/beta-catenin signaling pathway

Li Hui1, Ma Yuhuan1, Xu Limei2, Wang Shengjie1, Xu Yunteng2, He Xiaojuan1, Jia Liangliang2, Zeng Jianwei2, Wang Lili2, Li Xihai2, 3, #br# Ye Hongzhi2, 4#br#

1College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine; 2Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine; 3Fujian Key Laboratory of Rehabilitation; 4Fujian Provincial Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Elderly Diseases

Received:2019-12-20 Revised:2019-12-24 Accepted:2020-02-12 Online:2020-12-18 Published:2020-10-16
Contact: Li Xihai, MD, Researcher, Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China; Fujian Key Laboratory of Rehabilitation, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
About author:Li Hui, Master candidate, College of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China
Supported by:
China Postdoctoral Science Foundation (60^th batch of general funding), No. 2016M600625; China Postdoctoral Science Foundation (10^th batch of special funding), No. 2017T100591

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

Wnt/β-catenin信号通路：是一条在生物进化中极为保守的通路。在正常细胞中，β-catenin只是作为一种细胞骨架蛋白在胞膜处与E-cadherin形成复合体对维持同型细胞的黏附、防止细胞的移动发挥作用。只有当细胞外Wnt信号分子与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合激活胞内散乱的蛋白导致GSK-3β失活，进而使β-catenin磷酸化降解，当解离的β-catenin达到一定浓度时细胞功能发生异常，表现为病理状态。

独活寄生汤拆方：由中药独活、桑槲寄生、防风、秦艽、细辛、肉桂心组成具有祛风湿、止痹痛的祛湿止痛方，处方比例为3︰2︰2︰2︰2︰2。

背景：Wnt/β-catenin信号通路在骨关节炎的炎症反应病理过程中扮演着重要角色，而独活寄生汤拆方可有效抑制软骨细胞的炎症反应，但其具体作用机制尚不明确。有待进一步深入研究。

目的：探讨独活寄生汤拆方是否可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制由脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应。

方法：①取SD雄性大鼠，采用机械Ⅱ型胶原酶消化法获取膝关节软骨细胞，倒置相差显微镜观察软骨细胞的形态结构，Ⅱ型胶原免疫组化鉴定软骨细胞。②用不同质量浓度的独活寄生汤拆方(300，400，500 mg/L)干预由脂多糖(10 μg/L)诱导的软骨细胞炎症模型，干预8 h后，采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定各组软骨细胞培养液中白细胞介素1β、肿瘤坏子因子α水平，确定独活寄生汤拆方干预浓度。③将第2代软骨细胞分为4组：空白组含正常培养液；模型组培养液中含10 μg/L脂多糖；独活寄生汤拆方组培养液中含10 μg/L脂多糖和400 mg/L独活寄生汤拆方；抑制剂组培养液中含10 μg/L脂多糖和10 mg/L Dickkopf-1。干预8 h后，采用Western blot法检测β-catenin、Wnt-4、Frizzled-2、GSK-3β、CKI-ε的蛋白表达量。

结果与结论：①软骨细胞鉴定：获取的软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色胞浆呈棕黄色，具备软骨细胞典型特征；②ELISA结果显示：模型组培养液中白细胞介素1β和肿瘤坏子因子α水平均高于空白组，400 mg/L独活寄生汤拆方干预后两种炎症因子水平较模型组显著降低，所以确定独活寄生汤拆方干预浓度为 400 mg/L；③Western blot结果显示：模型组β-catenin、Wnt-4、Frizzled-2、CKI-ε的蛋白表达量均高于空白组，而GSK-3β蛋白表达量低于空白组；独活寄生汤拆方组和抑制剂组β-catenin、Wnt-4、Frizzled-2、CKI-ε蛋白表达量低于模型组，而GSK-3β蛋白表达量高于模型组。④结果表明：独活寄生汤拆方可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制由脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应。

ORCID: 0000-0003-3530-5683(李慧)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 独活寄生汤拆方, 软骨细胞, Wnt/β-catenin 信号通路, Wnt-4, Frizzled-2, β-catenin, GSK-3β, CKI-ε

Abstract:

BACKGROUND: ThePrevious studies have shown that the Wnt/β-catenin signaling pathway plays an important role in the pathogenesis and prognosis of chondrocyte inflammation, and the effective inhibition of chondrocyte inflammatory response byDuhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription remains to be further studied.

OBJECTIVE: To investigate whether Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription can inhibit the inflammatory response of chondrocytes induced by lipopolysaccharide via the Wnt/β-catenin signaling pathway.
METHODS: Male Sprague-Dawley rats were used to obtain knee joint chondrocytes by mechanical-type II collagenase digestion. The morphology and structure of chondrocytes were observed by inverted phase contrast microscope. Chondrocytes were identified by type II collagen immunohistochemistry. Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription with different mass concentrations (300, 400, 500 mg/L) was used to deal with the chondrocyte inflammation model induced by lipopolysaccharide (10 μg/L). After 8 hours of intervention, the ELISA method was used to determine the expression of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α in the cell culture fluid to determine the intervention concentration of Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription. The second-generation chondrocytes were divided into four groups, followed by culture with normal medium in blank group, 10 μg/L lipopolysaccharide in model group, 10 μg/L lipopolysaccharide plus 400 mg/L Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription in 400 mg/L Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription group, and 10 μg/L lipopolysaccharide plus 10 mg/L Dickkopf-1 in inhibitor group. After 8 hours of intervention, the expression levels of β-catenin, Wnt-4, Frizzled-2, GSK-3β and CKI-ε were detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: Chondrocyte identification results showed that the cytoplasm of chondrocytes was brown-yellow, with the typical characteristics of chondrocytes. ELISA results showed that the expression levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were higher in the model group than in the blank group, and the expression levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were significantly reduced in the 400 mg/L Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription group compared with the model group. Therefore, the intervention concentration of Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription was determined to be 400 mg/L. The results of western blot showed that the expression levels of Wnt-4, Frizzled-2, β-catenin and CKI-ε in the model group were higher than those in the blank group, whereas the expression of GSK-3β protein was lower than that in the blank group. The expression levels of Wnt-4, Frizzled-2, β-catenin and CKI-ε proteins in the Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription group and the inhibitor group were lower than those in the model group, whereas the protein expression level of GSK-3β was higher than that in the model group. All the findings indicate that Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription can inhibit lipopolysaccharide-induced chondrocyte inflammation by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway.

Key words: Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription, chondrocytes, Wnt/β-catenin signaling pathway, Wnt-4, Frizzled-2, β-catenin, GSK-3β, CKI-ε

中图分类号:

李慧, 马玉环, 许丽梅, 王圣杰, 许云腾, 何晓娟, 贾良良, 曾建伟, 王丽丽, 李西海, 叶蕻芝. 独活寄生汤拆方通过Wnt/β-catenin信号通路抑制软骨细胞炎症反应[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(35): 5589-5594.

Li Hui, Ma Yuhuan, Xu Limei, Wang Shengjie, Xu Yunteng, He Xiaojuan, Jia Liangliang, Zeng Jianwei, Wang Lili, Li Xihai, Ye Hongzhi. Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription inhibits chondrocyte inflammatory response throughbased on Wnt/beta-catenin signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(35): 5589-5594.

图/表（结果） 4

2.1 软骨细胞形态观察原代软骨细胞为小圆形，培养 24 h后，细胞基本贴壁，见图1A；培养4 d后，贴壁细胞体积逐渐变大，少数细胞开始拉长凸起，见图1B；培养6 d后，软骨细胞核清晰，可见一两个核仁，见图1C；第1代软骨细胞主要呈圆形或者椭圆形，细胞具有密度依赖性，见图1D，E；第2代软骨细胞生长迅速，胞浆丰富，细胞长势呈明显的“铺路石状”，见图1F。因此，取第2代软骨细胞用于后续的实验研究，结果稳定，可信度较高。

2.2 软骨细胞Ⅱ型胶原免疫组化鉴定与阴性组相比，阳性组软骨细胞的胞浆被染为棕黄色，细胞核未被着色，提示培养的细胞具备软骨细胞的典型特征，含有丰富的Ⅱ型胶原，见图2。

2.3 独活寄生汤拆方干预浓度的确定 5组白细胞介素1β的表达量分别为：空白组(0.084±0.001) ng/L、模型组(0.095±0.003) ng/L、独活寄生汤拆方低浓度组(0.084± 0.007) ng/L、独活寄生汤拆方中浓度组(0.082±0.001) ng/L、独活寄生汤拆方高浓度组(0.082±0.002) ng/L，其中模型组高于空白组(P < 0.01)，独活寄生汤拆方低、中、高浓度组低于模型组(P < 0.01)，见图3A。

5组肿瘤坏死因子α的表达量分别为：空白组(6.211±0.318) ng/L、模型组(9.472±2.471) ng/L、独活寄生汤拆方低浓度组(7.307±0.580) ng/L、独活寄生汤拆方中浓度组(6.471±0.408) ng/L、独活寄生汤拆方高浓度组(8.142±1.678) ng/L，其中模型组高于空白组(P < 0.05)，独活寄生汤拆方中浓度组低于模型组(P < 0.05)，差异均有显著性意义，所以选择独活寄生汤拆方中浓度为干预浓度，见图3B。

2.4 软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键调控因子的蛋白表达与空白组相比，模型组β-catenin、Wnt-4、Frizzled-2、CKI-ε蛋白表达量明显增多，而GSK-3β蛋白表达量明显减少(P < 0.01，P < 0.05)；与模型组相比，独活寄生汤拆方组和抑制剂组β-catenin、Wnt-4、Frizzled-2、CKI-ε蛋白表达量明显减少(P < 0.01，P < 0.05)，而GSK-3β蛋白表达量明显增加(P < 0.01，P < 0.05)，见图4。

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引言

骨关节炎是一种由增龄、劳损、肥胖、关节先天异常等诸多因素所导致的关节软骨退变疾病，其中炎症反应在其发展过程中起着至关重要的作用^[1-2]。现有的临床治疗原则主要是以缓解疼痛和改善功能为目的，但并不能从根本上阻断骨关节炎病情的发展。因此，如何通过调控炎症信号通路来抑制软骨细胞炎症反应，将成为防治骨关节炎的有效途径之一。

独活寄生汤源自唐代孙思邈的《备急千金要方》，由独活、桑寄生、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂心、防风、川芎、当归、干地黄、杜仲、人参、芍药、甘草等共15味中药组成，具有延缓软骨退变、减轻炎症反应的功效，在临床上被广泛应用于骨关节炎的治疗^[3-5]。复方中的独活、桑槲寄生具有补肾强筋功效，防风、秦艽、细辛、肉桂心具有祛风、镇痛的功效。因此，此次实验遵循“法依病机、拆方依法”的拆方研究思路，将这六味药效相似的中药组合成为祛湿止痛方，即为独活寄生汤拆方，为寻找复方中起主要作用的药物或有效成分提供线索。

Wnt信号通路与骨关节炎的炎症反应关系密切，从而影响着骨关节炎的病理进程。其中β-catenin是该信号通路中的核心因子，在细胞质、细胞核及细胞膜均有分布，当它在细胞内积累到一定浓度时会促进下游炎症因子白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的分泌，Wnt4过表达可抑制软骨细胞增殖并干扰其成熟[7-8]，是一条依赖Wnt细胞外信号和β-连环蛋白(β-catenin)核内信号发挥作用的信号传导通路，它与骨关节炎炎症反应是相互作用的，Wnt信号通路可直接介导炎症发生过程，而炎症反应又可以激活Wnt信号通路[6]。首先Wnt蛋白与细胞膜上的卷曲蛋白(frizzled)结合从而激活下游靶标，然后将Axin募集至细胞膜，导致β-catenin与Axin-GSK-3β-CK1-APC的复合体遭到解离，未磷酸的β-catenin被游离出来，当β-catenin达到一定浓度时，则激活其下游白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α炎症因子等的表达[7-8]所以Wnt/β-catenin信号通路是骨关节炎的潜在靶点。。Dickkopft相关蛋白1作为Wnt/β-catenin该信号通路的生理性拮抗剂，可以有效抑制Wnt通路中调控因子的表达发生异常。前期研究发现独活寄生汤拆方可有效抑制软骨细胞炎症反应，但是否通过调控Wnt/β-catenin信号通路有待进一步深入研究。

该实验以脂多糖诱导的软骨细胞炎症模型为研究对象，确定独活寄生汤拆方干预浓度，通过其对Wnt/β-catenin信号通路关键调控因子表达的影响，探讨独活寄生汤拆方抑制软骨细胞炎症反应的作用机制，为临床应用提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计分组对照体外细胞观察实验。

1.2 时间及地点实验于2018年3至12月在福建中医药大学实验动物中心和福建中医药大学中西医结合研究院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物清洁级4周龄SD雄性大鼠20只购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物合格证号：SCXK(沪)2012-0001。清洁级医学实验动物环境设施：福建中医药大学实验动物中心[使用许可证号：SYXK(闽) 2009119-00017]。实验动物处理方法符合《关于善待实验动物的指导性意见》(中华人民共和国科学技术部颁发)。

1.3.2 实验药物独活寄生汤拆方各味药均购于福建中医药大学承创堂，独活、桑寄生、防风、秦艽、细辛、肉桂心按比例为3︰2︰2︰2︰2︰2称取适量，用体积分数为70%的乙醇回流提取2次，合并滤液，浓缩、干燥。用含体积分数10% FBS的DMEM培养液配置50 g/L的独活寄生汤拆方提取物，0.22 μm无菌型微孔滤膜过滤，4 ℃冰箱保存。

1.3.3 主要试剂及仪器 Ⅱ型胶原(美国Abcam公司)；DAB检测试剂盒(北京博士德公司)；白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α酶联免疫吸附法检测试剂盒(美国R&D公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(强) (碧云天公司)；Wnt-4抗体、Frizzled-2抗体、β-catenin抗体、GSK-3β抗体、CKI-ε抗体(美国 Santa Cruz 公司)；显影液(碧云天公司)。光学显微镜(Olympus，日本TKO光学仪器株式会社)；低温高速离心机(64R型，美国BECKMAN公司)；全自动酶标仪(BIO-TEKELX80O型，美国BIO-Tek公司)；化学发光成像系统(美国Bio-RAD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 软骨细胞分离与培养 SD大鼠麻醉成功后无菌条件取膝关节软骨，PBS~~重复漂~~洗3次，将软骨切碎至1 mm³大小，放入含2 g/L的Ⅱ型胶原酶培养皿中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中消化，每隔2 h吸取一次上清液，离心 (1 000 r/min，5 min)，加入含体积分数为10% FBS的DMEM培养液，轻轻吹打至细胞悬浮，置于培养瓶原代培养，重复4次。之后每隔2 1 d更换一次培养液，细胞长满至~~培养瓶底~~80%-90%时，用胰酶消化后传代，获得第1代软骨细胞，继续培养并传代，获得第2代软骨细胞，倒置显微镜下观察细胞形态。

1.4.2 Ⅱ型胶原免疫组化鉴定软骨细胞取第2代软骨细胞接种于含有细胞爬片的6孔板中，培养48 h后，PBS洗涤3次，用40 g/L多聚甲醛固定30 min；0.5%曲拉通X-100处理15 min，PBS洗涤3次；体积分数3% H₂O₂处理10 min，蒸馏水洗涤3次；5% BSA封闭1 h；滴加兔抗Ⅱ型胶原多克隆抗体(1︰200)，阴性组用PBS代替，4 ℃冰箱过夜，PBS洗3次；加入山羊抗IgG(1︰1 000)，置于37 ℃培养箱孵育30 min，PBS洗3次，DAB显色10 min，自来水漂洗；苏木素复染，自来水漂洗、晾干、封固，光学显微镜下观察软骨细胞。

1.4.3 ELISA法检测软骨细胞白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α表达取第2代软骨细胞接种于6孔板中，分为5组：①空白组：含体积分数10%FBS的DMEM培养液；②模型组：培养液中含有10 μg/L脂多糖；③独活寄生汤拆方低浓度组：培养液中含有300 mg/L独活寄生汤拆方和10 μg/L脂多糖；④独活寄生汤拆方中浓度组：培养液中含有400 mg/L独活寄生汤拆方和10 μg/L脂多糖；⑤独活寄生汤拆方高浓度组：培养液中含有500 mg/L独活寄生汤拆方和10 μg/L脂多糖。各组干预8 h后，吸取培养液，依据ELISA试剂盒操作步骤进行加样，完成后使用酶标仪(450 nm波长)进行检测。

1.4.4 Western Blot检测软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键调控因子的蛋白表达取第2代软骨细胞分为4组：①空白组：含有体积分数10%FBS的DMEM培养液~~正常培养基~~；②模型组：培养液中含有10 μg/L脂多糖；③独活寄生汤拆方组：培养液中含有10 μg/L脂多糖和400 mg/L独活寄生汤拆方；④抑制剂组：培养液中含有10 μg/L脂多糖和10 mg/L Dickkopf-1。干预8 h后，PBS洗3次，每孔加入200 μL的蛋白裂解液(RAPI︰PMSF=100︰1)，置于4 ℃冰箱裂解 30 min，用细胞刮刀刮去裂解物并收集，4 ℃离心 (14 000 r/min，30 min)，吸取上清液，得到总蛋白。采用BCA 法测定蛋白浓度，按照定量结果，每孔上样20 μg，以12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，将蛋白半干转至PVDF膜上，TBST荡洗PVDF膜，加入封闭液室温孵育2 h，再分别加入β-catenin、Wnt-4、Frizzled-2、GSK-3β、CKI-ε、β-actin抗体4 ℃孵育过夜；用TBST洗膜3次。加入二抗，室温孵育1 h，用TBST洗膜3次；加入适量ECL显影液反应1 min，曝光、显影。应用Image Lab图像处理软件分析目的蛋白与内参β-actin灰度值的比值。

1.5 主要观察指标 ①软骨细胞形态及Ⅱ型胶原蛋白在细胞内的表达及分布；②干预后各组软骨细胞培养液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α表达；③干预后各组软骨细胞内β-catenin、Wnt-4、Frizzled-2、GSK-3β、CKI-ε蛋白表达。

1.6 统计学分析应用SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P < 0.01或P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

独活寄生汤是临床上治疗风寒湿痹日久之证常用名方治疗骨关节炎常用的复方，具有祛湿、止痛、益肝肾、补气血等功效[9-11]。因“药有个性之专长，方有合群之妙用”，所以对中药复方进行的拆方被广泛研究并被广泛应用[12]。在此拆方中，独活可以通过调节一氧化氮合酶及环氧化酶2，抑制脂多糖诱导细胞产生肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、一氧化氮等炎症因子，从而达到抗炎目的[13]；秦艽可以减轻鼠的炎症肿胀模型程度[14]；防风中的升麻素苷具有解热、抗凝血等作用[15]。故此次实验通过对独活寄生汤进行精简拆方研究，为进一步对拆方后的新处方进行药效学的验证及研究打下基础，以期待研制处方更加精练、效果更加显著、符合现代中药特色的抗骨关节炎药物。
软骨细胞是软骨组织中仅有的单一唯一细胞成分，它可以其可分泌大量的Ⅱ型胶原及蛋白多糖，经Ⅱ型胶免疫组化可以证实该实验所培养细胞为软骨细胞。脂多糖是革兰阴性杆菌外膜的主要成分，它可以通过与软骨细胞表面脂多糖受体结合蛋白相结合而干扰正常的引起软骨细胞功能炎症反应，从而促进炎症细胞因子的释放，最终表现为早期骨关节炎[16-18]。在炎症早期阶段，炎症细胞因子起着关键作用，白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α能够刺激软骨细胞生成基质金属蛋白酶等炎性递质分泌，降解关节软骨，导致软骨退变，加重骨关节炎病情[19]。此次实验以脂多糖诱导软骨细胞为炎症细胞模型为研究对象，用浓度梯度法优化对独活寄生汤拆方对干预软骨细胞的干预浓度进行选择，结果显示独活寄生汤拆方干预浓度为400 mg/L时，明显抑制对软骨细胞培养液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的抑制作用相对最显著表达量，所以选择400 mg/L作为独活寄生汤拆方的干预骨关节炎软骨细胞的最佳浓度。
Wnt通路存在于各种生命体中，控制着细胞的发育过程，包括增殖、分化、迁移、凋亡等[20-21]。Wnt/β-catenin是Wnt中的经典信号通路，主要涉及到Wnt家族中多个成员在细胞膜上与Frizzled及LRP5/6受体进行相应的结合，从而形成多蛋白复合物的复杂过程[20-21]。这一过程涉及到多个蛋白的活化，包括Axin、GSK-3β蛋白。在缺少Wnt配体的情况下，Axin、APC、GSK-3β调控蛋白可以组成一个复杂的复合体，通过磷酸化及泛素化来降解β-catenin。CKI-ε是Wnt通路正向调节因子，当Wnt信号被激活时，Wnt配体中的一些家族成员与相应受体结合可活化CKI-ε，经过多次生物信号传递过程，最终抑制GSK-3β对β-catenin的磷酸化降解[22-23]。因此，有效地调控Wnt/β-catenin信号通路是减轻炎症反应的一个关键途径，Wnt/β-catenin信号通路是治疗骨关节炎的潜在靶点，其中β-catenin、wnt-4、Frizzled-2、GSK-3β、CKI-ε基因在该信号通路中维持平衡发挥重要的作用。Western blot结果显示，与空白组相比，经脂多糖诱导的软骨细胞炎症模型中，β-catenin、wnt-4、Frizzled-2、CKI-ε蛋白表达上升，而GSK-3β蛋白表达下降；用独活寄生汤拆方干预炎症软骨细胞后，软骨细胞中发现β-catenin、wnt-4、Frizzled-2、CKI-ε蛋白表达明显下降，而GSK-3β蛋白表达明显上升。提示独活寄生汤拆方可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制炎症反应的进一步发展。
综上所述，独活寄生汤拆方通过调控Wnt/β-catenin信号的关键调控因子可以有效抑制软骨细胞炎症反应，维持软骨基质稳态环境，保护对关节软骨起保护作用，为临床上处方中药复方精简研究及防治骨关节炎找到科学性的突破点提供新的思路。此次实验仅对体外软骨细胞进行了研究，未在大鼠体内进行再次验证，因此之后将对在骨关节炎大鼠模型作进一步探讨，以期更加明确独活寄生汤拆方抑制治疗骨关节炎的作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

独活寄生汤拆方通过Wnt/β-catenin信号通路抑制软骨细胞炎症反应

Duhuo Jisheng Decoction Disassembled Prescription inhibits chondrocyte inflammatory response throughbased on Wnt/beta-catenin signaling pathway

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