颗粒软骨加α-氰基丙烯酸正丁酯胶结合3D打印技术辅助制作个性化耳支架

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2321

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (34): 5520-5525.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2321

• 组织工程软骨材料Tissue-engineered cartilage • 上一篇下一篇

颗粒软骨加α-氰基丙烯酸正丁酯胶结合3D打印技术辅助制作个性化耳支架

张帆¹，李高峰²，胡益高²，蔡立宏³

1湘潭爱思特医疗美容门诊部，湖南省湘潭市 411100；2湖南省人民医院(湖南师范大学附属第一医院)整形激光美容科，湖南省长沙市 410005；3长沙市第三医院放射影像科，湖南省长沙市 410007

收稿日期:2019-12-12 修回日期:2019-12-14 接受日期:2020-01-18 出版日期:2020-11-08 发布日期:2020-09-11
通讯作者: 李高峰，博士，主任医师，教授，硕士生导师，湖南省人民医院(湖南师范大学附属第一医院)整形激光美容科，湖南省长沙市 410005
作者简介:张帆，女，1989年生，湖南省长沙市人，汉族，硕士，医师，主要从事耳再造、眼整形方向的研究
基金资助:
湖南省教育厅科学研究项目一般项目(16C0964)，课题名称：颗粒软骨加α-氰基丙烯酸正丁酯结合3D打印技术辅助制作耳支架的实验研究

Granule cartilage plus n-butyl α-cyanoacrylate glue combined with 3D printing technology for preparation of individualized ear scaffolds

Zhang Fan¹, Li Gaofeng², Hu Yigao², Cai Lihong³

¹Xiangtan Aist Medical Beauty Clinic, Xiangtan 411100, Hunan Province, China; ²Department of Plastic Laser Cosmetology, Hunan Provincial People’s Hospital (the First Affiliated Hospital of Hunan Normal University), Changsha 410005, Hunan Province, China; ³Department of Radiology, The Third Hospital of Changsha, Changsha 410007, Hunan Province, China

Received:2019-12-12 Revised:2019-12-14 Accepted:2020-01-18 Online:2020-11-08 Published:2020-09-11
Contact: Li Gaofeng, MD, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Plastic Laser Cosmetology, Hunan Provincial People’s Hospital (the First Affiliated Hospital of Hunan Normal University), Changsha 410005, Hunan Province, China
About author:Zhang Fan, Master, Physician, Xiangtan Aist Medical Beauty Clinic, Xiangtan 411100, Hunan Province, China
Supported by:
Scientific Research Project of Hunan Provincial Department of Education (General Program), No. 16C0964

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

α-氰基丙烯酸正丁酯：为组织胶水，临床上常用来作为组织粘连剂，这种黏合剂无毒、组织相容性好、粘连强度好，凝固后会形成一层带有网孔的生物膜，该网孔能通过组织液为软骨细胞提供营养物质，并不影响软骨细胞的存活。

颗粒软骨：常见于鼻整形中，取鼻中隔、鼻翼、耳郭或肋软骨，将其切成大小为0.5-1.5 mm颗粒状，用筋膜、脱细胞真皮或其他生物材料包裹后移植于填充区或不包裹直接进行移植填充。软骨材料是最接近真耳的支架材料。

背景：传统耳再造手术中耳支架的制作容易导致再造耳失真，3D打印技术使个性化、高仿真的小耳再造成为可能。

目的：探讨颗粒软骨加α-氰基丙烯酸正丁酯结合3D打印技术制作个性化耳支架的可行性。

方法：根据耳畸形患者健侧耳制作患侧耳的3D耳支架阳模和阴模，将颗粒软骨用α-氰基丙烯酸正丁酯粘连放入阴模中，同时对比阳模微调，制成耳软骨支架后，将其植入新西兰大白兔背部，动态观察再造耳郭的形态，术后4，8，12周分批取出耳支架，组织学观察颗粒软骨间连接情况、软骨的存活状况等，免疫组化观察Ⅱ型胶原表达。动物实验获得湖南师范大学实验动物福利伦理审查委员会批准(批准号：201517)。

结果与结论：①大体观察：与术前比较，术后4，8，12周的再造耳郭长度、宽度、高度无明显变化，质量明显增加(P < 0.05)；②组织学观察：颗粒软骨周围可见炎性细胞浸润，随着标本植入时间延长，炎性细胞逐渐减少，附着支架的筋膜中有较多血管生成；随着植入时间的延长，软骨膜内新生软骨细胞逐渐增多，体积逐渐增大，成熟软骨细胞逐渐增多；软骨碎片之间的α-氰基丙烯酸正丁酯未见明显分解，绝大部分软骨片之间仍被α-氰基丙烯酸正丁酯间隔，少部分软骨片之间有纤维连接形成，随着植入时间延长，软骨片之间的连接有增多的趋势；③免疫组化学观察：随着标本植入时间延长，Ⅱ型胶原表达逐渐增强；④结果表明：颗粒软骨加α-氰基丙烯酸正丁酯结合3D打印模具可以制作个性化耳支架。

ORCID: 0000-0002-7481-0722(张帆)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 颗粒软骨, α-氰基丙烯酸正丁酯, 耳支架, 个性化, 耳郭再造, 3D打印

Abstract:

BACKGROUND: The manufacture of ear brackets in traditional ear reconstruction is likely to cause ear distortion, and 3D printing technology makes it possible to prepare individualized and highly simulated ears.

OBJECTIVE: To explore the feasibility of making individualized ear scaffolds using granule cartilage plus n-butyl α-cyanoacrylate glue with 3D printing technology.

METHODS: Male and female modes of 3D ear scaffolds were prepared for the affected ears according to the ears on the non-injured side. Granule cartilage and n-butyl α-cyanoacrylate glue were placed in the female modes to prepare ear cartilage scaffolds through slight adjustment based on male modes. Then the ear cartilage scaffolds were implanted into the back of New Zealand rabbits. The morphology of constructed ear scaffolds was dynamically observed. At postoperative 4, 8, and 12 weeks, the ear scaffolds were taken out in batches. The connection between granule cartilage and cartilage survival was histologically observed. Immunohistochemistry was performed to detect the expression of type II collagen. The animal experiments were approved by the Animal Ethics Committee of Hunan Normal University, China (approval No. 201517).

RESULTS and CONCLUSION: (1) Gross observation: compared with before surgery, the length, width and height of the reconstructed ears were not significantly changed, but the weight of the reconstructed ears was significantly increased at 4, 8, and 12 weeks after surgery (P < 0.05). (2) Histological observation: Inflammatory cell infiltration was observed around granular cartilage. With the prolongation of ear scaffold implantation time, inflammatory cell count gradually decreased, and there were more newly formed vessels in the fascia attached to the scaffold. With the prolongation of implantation time, the number of new chondrocytes in the cartilage membrane gradually increased, cartilage volume gradually increased, and mature chondrocytes gradually increased. Obvious decomposition of n-butyl α-cyanoacrylate between cartilage pieces was not observed. Most of the cartilage pieces were still separated by n-butyl α-cyanoacrylate, and a few of cartilage pieces had fiber connections. With the prolongation of implantation time, the connections between cartilage pieces increased. (3) Immunohistochemistry observation: With the prolongation of ear scaffold implantation time, the expression of type II collagen gradually increased. (4) These results suggest that granule cartilage plus n-butyl α-cyanoacrylate glue combined with 3D printing technology make preparation of individualized ear scaffolds feasible.

Key words:

material, granule cartilage, n-butyl α-cyanoacrylate, ear scaffold, individualized, auricle reconstruction, 3D printing

中图分类号:

张帆, 李高峰, 胡益高, 蔡立宏. 颗粒软骨加α-氰基丙烯酸正丁酯胶结合3D打印技术辅助制作个性化耳支架[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(34): 5520-5525.

Zhang Fan, Li Gaofeng, Hu Yigao, Cai Lihong. Granule cartilage plus n-butyl α-cyanoacrylate glue combined with 3D printing technology for preparation of individualized ear scaffolds[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(34): 5520-5525.

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引言

先天性小耳畸形在中国的发生率约为5.18/10 000^[1]，其最主要的治疗方法为耳郭再造术。耳郭再造的关键技术是解决耳支架的成形和耳支架覆盖这2个问题^[2]。自体肋软骨耳再造一般先依据健侧耳制成塑料耳模片，再根据耳模片雕刻耳支架^[3]。在这个立体变平面再变成立体的过程中，很容易造成耳郭上一些精细立体的结构偏离实际，外形不能令患者完全满意。高密度多孔聚乙烯(Medpor)耳支架主要由已成形的基座和耳轮2部分组成^[4]，虽然术中可适当微调，但难以体现耳郭某些细微结构，也谈不上个性化制作耳支架。

随着3D打印技术的出现，数字化、个性化制作耳支架模型已变成可能。3D打印技术是一种以数字模型文件为基础，运用可黏合材料通过“分层制造、逐层叠加”的方式来构造物体的技术^[5]。3D打印目前在生物医学领域应用最广泛的是骨科和口腔科。3D打印模型能协助诊断、帮助手术设计，还可进行预手术来提高手术精准度、减少手术时间；3D打印钛合金粉末枢椎已进入临床治疗寰枢椎恶性肿瘤^[6]。1992年，STOKER等^[7]首次将3D打印的颅颌面模型应用于术前模拟，标志着3D打印技术正式进入整形外科，随后 3D打印技术在整形外科中得到迅速发展。目前，3D打印技术主要用于隆鼻及隆颏假体的个性化定制、颅骨缺损的个性化修复、下颌骨重建术及截骨手术等^[8]。

对于耳郭再造而言，如果能根据数字化的耳郭模型利用自体软骨打印出耳支架进而植入人体，耳再造将会迈入新时代。现阶段，国内外主要研究方向为利用可降解生物材料水凝胶(如藻酸盐^[9]、胶原^[10]、嵌段共聚物)和软骨细胞同步打印人耳支架^[11]，该支架经过一段时间的体外培养可获得较高的成功率。但这种方法实际上是一种组织工程技术。2018年，中国曹谊林教授团队发表了将3D打印人耳支架通过体外培养成功后植入人体的报道，但是这种组织工程培养的支架对耳郭形态的支撑力能否持久仍需要进一步观察^[12]。医用3D打印材料以钛^[13]、羟基磷灰石居多^[14]，但是这些材料硬度较大，都不是理想的耳软骨支架替代材料。肋软骨被认为是现阶段最可靠的耳软骨支架材料，因此实验选择兔耳软骨来再造人耳支架。

3D打印技术目前使用的材料是可黏合材料，单独的软骨达不到3D打印材料的要求，因此作者推测软骨由细颗粒状到耳支架立体结构必然需要增加一种理想的黏合剂。α-氰基丙烯酸正丁酯是一种常用的瞬时胶粘剂，它常温下即可固化，黏度高，与组织相容良好，且具有一定的抑菌作用。临床上有利用α-氰基丙烯酸正丁酯黏合内固定技术治疗骨干骺端骨折的报道^[15]，α-氰基丙烯酸正丁酯凝固后会形成一层带有网孔的生物膜，虽然不能通过红细胞和血小板，但是其网孔却有利于营养物质的渗透和组织愈合的分子架构建立，因而并不影响组织愈合。因此，作者推测α-氰基丙烯酸正丁酯能使颗粒软骨成形，并且不会影响软骨细胞的存活。

利用软骨组织3D打印人耳软骨支架是研究者的终极目标，但是目前的技术还无法实现。为了进一步探讨此方法的可行性，实验人工模拟3D打印过程，用切碎的颗粒软骨模拟3D打印原材料，α-氰基丙烯酸正丁酯模拟黏合剂，3D打印个性化耳支架模型辅助耳支架成形。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计自身对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年9月至2016年2月在湖南师范大学医学院动物房及湖南省人民医院病理科完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级雌性新西兰大白兔6只，体质量2.5-3.0 kg，购自湖南太平生物科技有限公司，许可证号：SCXK(湘)2015-0004，单笼饲养，温度(25±2) ℃，相对湿度(55±2)%。动物实验获得湖南师范大学实验动物福利伦理审查委员会批准(批准号：201517)。

1.3.2 主要试剂及仪器聚乳酸(1.75 mm直径，均匀线状，熔点190 ℃，工作温度200-220 ℃融化成凝胶状，喷丝后迅速凝固，常州华森医疗器械有限公司)；扩张器(50 mL，肾形，中国广州市万和整形材料有限公司)；α-氰基丙烯酸正丁酯(0.5 mL，液态，德国贝朗医疗器械有限公司)；EDTA(pH=9.0)抗原修复液、EDTA(pH=8.0)抗原修复液及柠檬酸(pH=6.0)抗原修复液(武汉谷歌生物科技有限公司)；BSA(Solarbio)；正常兔血清(Boster)；Ⅱ型胶原一抗(货号：GB13021，武汉谷歌生物科技有限公司)；HRP标记山羊抗兔鼠通用二抗及组化试剂盒DAB显色剂(货号：K5007，DAKO公司)；三维CT(西门子Sensation 40螺旋CT，德国西门子股份公司)；3D打印机(3D-ORTHO，常州华森医疗器械有限公司)；光学显微镜(BX41，Olympus公司)；图像采集系统(Moticcam3000，Motic公司)；游标卡尺(上海美耐特五金工具有限公司)；电子天平(湖南师范大学医学院提供)。

1.4 实验方法

1.4.1 阳模和阴模的构建任意选择2015年7月至2015年8月就诊于湖南省人民医院整形美容外科的小耳畸形患者1例，利用CT扫描其头部三维成像，获得健侧患侧耳郭的容积数据后进行重建，获取健侧耳郭数字化模型，患者及其家属对实验已知情同意。利用镜像原理将获取的健侧耳模型转化为对侧耳郭模型，并将其各个平面的数据分别减小1.0-2.0 mm，相当于去除了皮肤和软组织的厚度，得到患侧耳支架模型的数据，利用软件magics18.0适当放大上述耳支架模型，获得手术所需阴模数据模型，阴模里面是空的，这个空间恰好是一个耳郭支架的形状。根据该数据，使用3D打印技术打印耳支架阳模、阴模(材料为聚乳酸)各1套。为方便放入和取出颗粒软骨，将阴模沿耳轮对耳轮底部平面切开为2部分，分别为上部和底座，见图1。

1.4.2 制备扩张皮瓣取新西兰大白兔6只，按A-F标记，将背部沿脊柱分为左1、右2两个区域，背部剃毛，30%戊巴比妥钠1 mL/kg行耳缘静脉注射。待麻醉起效后将实验兔固定于操作台。常规消毒铺单，将扩张器分别埋入左右两侧皮下，注射阀内置。5-0丝线分层缝合皮下层与皮肤。穿好帆布衣、带塑料头套防止兔子撕咬注水阀及伤口。术后连续3 d肌肉注射青霉素预防伤口感染。伤口基本愈合后定期注水，三四天一次，每次15-20 mL，直至150 mL左右。持续扩张塑形4周，得到扩张皮瓣，见图2。

1.4.3 制作颗粒软骨取上述实验兔耳根部剃毛，背部剃毛脱毛，30%戊巴比妥钠1 mL/kg行静脉注射麻醉。待麻醉起效后将实验兔固定于手术台，术区常规消毒铺单。0.5%利多卡因+1/20万肾上腺素于术区行局部麻醉，于兔耳根部完整切除兔耳，5-0丝线缝合皮肤。去除离体兔耳软骨表面皮肤及皮下组织，得到完整兔耳软骨，去皮过程中注意尽量保留软骨膜。将耳软骨切成大小约1.0 mm×1.5 mm颗粒状，备用。

1.4.4 制作耳支架将阴模(络合碘浸泡消毒)上部与底座内侧面垫上无菌塑料膜，沿阴模凹槽逐层填入颗粒软骨，软骨之间用α-氰基丙烯酸正丁酯粘连，待胶水凝固后将阴模上部与底座嵌合，去除多余的软骨颗粒，将留有空隙的地方适当填充软骨，使阴模上部和底座充分吻合，软骨颗粒刚好位于阴模之间的空隙内。将阴模上部和底座小心移除，支架上下部分用α-氰基丙烯酸正丁酯仔细黏牢，待胶水半干后小心撕去塑料膜，再根据阳模进行微调，即制成人耳支架，见图3。颗粒软骨与α-氰基丙烯酸正丁酯的体积之比约为4∶1。使用游标卡尺分别测量支架的长度、宽度、高度，使用电子天平测量支架的质量并做好记录。

1.4.5 植入3D支架于扩张皮瓣外下方切开皮肤全层，暴露纤维包膜，完整剥离纤维包膜后将取出扩张器及注水阀一并取出，将制作好的耳支架植入扩张皮瓣下方，缝合固定底座于基底部，5-0丝线缝合伤口，伤口留置负压引流管以利塑形。穿好帆布衣、带塑料头套防止兔子撕咬伤口。术后连续3 d肌肉注射青霉素预防伤口感染，伤口每天换药，术后5-7 d拔出负压引流管，连续观察大体形态及支架存活情况。

1.4.6 标本的采集与处理于术后4，8，12周各处死2只新西兰大白兔。

大体观察：在背部移植区域小心取出耳支架，尽量去除支架表面包膜，排除支架植入后与宿主组织反应形成的纤维肉芽组织包裹对结果的干扰，观察耳支架的形态。使用游标卡尺分别测量支架的长度、宽度、高度，使用电子天平测量支架的质量并做好记录。

组织学及免疫组化染色：将耳支架置于体积分数4%甲醛溶液中固定24 h，从支架中部切取一块大小为15 mm× 12 mm×4 mm标本，行苏木精-伊红染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，光学显微镜观察颗粒软骨的组织学变化，同时采用Image Pro Plus 6.0 图像分析软件对各组切片细胞的深棕黄色颗粒(Ⅱ型胶原阳性染色)进行半定量分析，测定细胞Ⅱ型胶原累积吸光度，检测软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，进一步分析支架颗粒软骨间连接情况、软骨的存活状况。

1.5 主要观察指标耳支架植入动物背部的大体、组织学及免疫组化观察结果。

1.6 统计学分析将采集的数据输入SPSS 20.0统计软件进行分析，数据以x(_)±s表示，采用配对样本t 检验及多个样本均数比较的方差分析，检验水准α=0.05。

讨论

耳郭再造术是整形外科学中最为复杂的手术之一，早在1920年，GILLIES就将简单雕刻后的肋软骨埋入乳突区皮下进行耳郭再造，这是现代肋软骨支架的雏形^[16]。随后，耳郭再造经过TANZER^[17]、BRENT^[18-19]、NAGATA等^[20]和SONG等^[21]不断发展与完善，逐渐形成了一套成熟的支架雕刻方法与手术方法。中国学者庄洪兴等^[22]认为他们手术成功的关键是坚持使用了自体肋软骨作为耳支架材料。而异体软骨和某些人工材料如硅橡胶^[23-24]、羟基磷灰石、钛等均已被证明不适合成为耳支架替代材料。高密度多孔聚乙烯(Medpor)是一种高密度多孔聚乙烯材料，WELLISZ等^[25]和ROMO等^[26]报道应用Medpor作为耳支架材料进行人耳郭再造取得非常满意的效果。由于Medpor是根据西方人的耳郭特点制成，并不完全符合东方人耳郭的要求，且质地较硬，可调节性有限，所以并不是一种完全理想的耳支架替代材料。组织工程技术的崛起为耳支架材料提供了另一种可能，但要培养出真正具有支撑力的软骨组织仍然任重而道远。自体肋软骨将可能在未来很长一段时间内成为耳再造首选材料。实验选择自体软骨作为支架材料，由于新西兰大白兔耳软骨较肋软骨量多、更易于获得，故应用兔耳软骨作为支架材料。

自体颗粒软骨常见于鼻成形中，取鼻中隔、鼻翼、耳郭或胸廓软骨，将其切成大小为0.5-1.5 mm颗粒状^[27]，颗粒软骨可塑性强，结合3D打印的技术可以减少对施术者手术技巧的限制。实验利用颗粒软骨加α-氰基丙烯酸正丁酯结合3D打印技术辅助制作的耳支架，简化了耳郭再造的手术步骤。α-氰基丙烯酸正丁酯，也即常说的组织胶水，临床上常用来作为组织粘连剂，也有作为栓塞剂的报道^[28-29]。国内黄秀君等^[30]通过动物实验观察到α-氰基丙烯酸正丁酯90 d的吸收排泄量为5%左右。实验将α-氰基丙烯酸正丁酯胶黏成形的立体耳支架植入新西兰大白兔背部，连续观察3个月后取出，观察大体标本见颗粒软骨间粘连牢固，胶水依然存在，只有极少量被吸收；病理切片中颗粒软骨之间存在规则的间隙，间隙中无炎性反应细胞，表明α-氰基丙

烯酸正丁酯未被吸收，但在制片过程中被有机溶剂溶解。颗粒软骨膜内层存在大量新生软骨细胞，这是软骨膜下软骨的外加生长，说明软骨细胞处于生长与修复阶段，网孔状的α-氰基丙烯酸正丁酯并不影响营养物质的渗透。

传统耳再造法对术者操作水平要求极高，并且在雕刻过程中由于缺乏立体模型，容易造成一些细微结构的失真。Medpor材料质地较硬，与人耳软骨相差较大，临床并发症相对较多。实验从临床耳郭再造术存在的问题出发，结合最新的数字成型、3D打印原理，使用3D打印的耳模具，以兔耳颗粒软骨和α-氰基丙烯酸正丁酯为材料制作人耳支架，而后植入动物体内，观察存活情况，希望在简化传统手术步骤的同时为软骨打印寻找合适材料。通过实验结果可以认为颗粒软骨加α-氰基丙烯酸正丁酯结合3D打印模具可以制成三维立体的耳支架，耳支架可以在动物体内存活，并且保持特定的形态。α-氰基丙烯酸正丁酯能有效连接颗粒软骨，使颗粒软骨成形，并且不影响软骨细胞的存活。3D打印模具根据患者耳郭个性化的指标和数据制作，具备个性化特征。以颗粒软骨加组织黏合剂结合3D打印模具制作耳支架，为临床中制作耳支架提供了一种新的思路，也为将来软骨3D打印耳支架提供了一定的理论基础。

耳郭再造的最高目标是利用自身组织再造出与对侧耳郭同等大小、质地、形状的外耳。而作者的理想目标是利用自身肋软骨通过3D打印机打印出与对侧耳郭同等大小、形状的耳支架。当然，颗粒软骨与其黏合物能否形成长久的有效连接，α-氰基丙烯酸正丁酯吸收后软骨之间能否建立有效连接，还需要进一步实验证实。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

颗粒软骨加α-氰基丙烯酸正丁酯胶结合3D打印技术辅助制作个性化耳支架

Granule cartilage plus n-butyl α-cyanoacrylate glue combined with 3D printing technology for preparation of individualized ear scaffolds

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