2.1  骨水泥的固化时间、可注射性及抗溃散性  图1为各材料的固化时间与可注射系数，纯透钙磷石骨水泥的固化时间在6 min左右，而在骨水泥固相中加入1%，3%和5%的氧化钽后，材料的固化时间分别被延长到了约10，12，14 min；同时各骨水泥的可注射系数高达99%以上，均显示出良好的可注射性。图2为各骨水泥的抗溃散性能图片，可见在骨水泥注入水中经历高温煮沸过程，在液体的剧烈冲刷下也保持了高度的完整性，未溃散，说明材料具有良好的抗溃散性能。

2.2  骨水泥的显微结构分析  图3为各骨水泥的X射线衍射谱图，各材料的主晶相均为透钙磷石[PDF# 09-0077]，在加入Ta₂O₅的材料中观察到了极少量未反应的磷酸氢钙，在Ta-5中还检测到微量Ta₂O₅ [PDF#21-1198]。各材料红外谱图在527，578，795-1 140 cm^-1处均观察到了透钙磷石的特征吸收峰^[22]，见图4；同时注意到与Ta-0相比，加钽材料的一些吸收峰出现了移动，793 cm^-1处的峰(P-O-H平面外振动)蓝移到795 cm^-1处^[23]，875 cm^-1处的峰(P-O(H)伸缩振动)红移到874 cm^-1 处^[23]，669 cm^-1处的峰(结晶水)在Ta-1、Ta-2和Ta-3中分别红移至665，668和667 cm^-1处^[23]。

扫描电镜显示，Ta-0表面由片状晶交接凝结在一起，随着加入钽含量的增加，材料晶粒的形状由规则的片状逐渐变成不规则的颗粒状，晶粒大小也发生了改变，呈现先变小后又增大的趋势；同时可以看出，加入钽的材料表面更加平整、致密，特别是Ta-1和Ta-3材料表面的孔隙明显减少，见图5。

2.3  骨水泥的抗压强度  载钽后，透钙磷石骨水泥的抗压强度显著提高，Ta-0的抗压强度约23 MPa，Ta-1、Ta-3和Ta-5的抗压强度分别提高到了27，32和28 MPa左右，特别是Ta-3与Ta-0相比抗压强度提高了约40%，见图6。

2.4  骨水泥的显影性能  各骨水泥在X射线下的显影性能，见图7。可见加入Ta₂O₅后，材料的显影性能显著提升，仅加入1% 就可以依靠肉眼分辨出比透钙磷石骨水泥更强的显影性能(图7B)。在骨模的显影实验中与透钙磷石骨水泥相比，加钽的透钙磷石骨水泥与旁边骨组织显示出更好的区别度(图7C)。图7D为各骨水泥的灰度提取值，Ta-0、Ta-1、Ta-3和Ta-5的灰度级分别为153、145、143和136，可见随着钽含量增加，骨水泥材料的显影效果进一步增强。

2.5  骨水泥的失重率  图8为各骨水泥材料浸泡7 d后的失重率，材料的失重率由载钽前的17%左右降到载钽后的10%左右。图9为各骨水泥材料浸泡7 d后的表面形貌，载钽骨水泥材料受到液体冲刷降解的痕迹不如单纯透钙磷石骨水泥明显，与其更慢的降解速率相对应。

2.6  骨水泥材料的细胞毒性  培养7 d后各实验组的吸光度值均高于空白对照组，见图10，相对增殖率均大于100%，表明材料对MG63细胞无毒性。MG63细胞与材料复合培养1，3，7 d后的黏附和生长情况，见图11，复合培养7 d后各载钽材料表面几乎都被细胞覆盖，表明材料表面利于细胞的生长和增殖。

可注射的透钙磷石(CaHPO₄·2H₂O)作为一种磷酸钙骨水泥其组分与人体骨组织接近，生物相容性好，且在体内完全能降解，备受关注^[1-2]。透钙磷石与骨组织相近的元素组成也使其对X射线的阻滞能力与骨组织非常接近，造成材料与相邻解剖结构不易区分^[3]，其相对较差的显影性能影响了其临床应用效果^[4]。而临床上医生在术前和术后均需通过X射线影像来判断病情。随着技术的进步，为了减少和避免骨水泥渗漏，在骨科临床兴起了骨水泥可视化注射操作，整个手术过程必须在荧光监测器下进行^[5]，这就要求透钙磷石骨水泥具备良好的显影性能，但目前较少研究关注提高其显影性能。

当前对磷酸钙类骨水泥显影性能的增强主要是通过加入铋剂^[6-7]、碘剂^[8]、钡剂^[9]、锶剂等显影剂来实现^[10]。这些显影剂虽然可以增强骨水泥的显影效果，但对材料的固化时间、抗压强度、可注射性和水化产物都会造成影响^[7-10]。同时大部分显影剂不具备骨修复性能，且对显影剂加入后材料生物相容性等影响的研究较少。

钽原子序数为73，高于临床上常用的对比剂碘元素，其对X射线有较强阻滞能力^[11]，具有良好的显影性能^[12]。研究已证明钽是一种生物相容性和骨修复性能良好的生物材料^[13-16]，其良好的骨修复性能得益于其表面的氧化钽层^[17]，有利于与骨组织形成化学键合^[18]。实验拟将显影性能和骨修复性能都良好的氧化钽加入透钙磷石骨水泥中，研究氧化钽加入对透钙磷石骨水泥显影等性能的影响。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  对比观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年4月至2019年2月在河南科技大学医学技术与工程学院完成。

1.3  材料  

1.3.1  实验用主要试剂  硝酸钙[Ca(NO₃)₂·4H₂O]、磷酸氢铵[(NH₄)₂HPO₄]、氨水(NH₃·H₂O)、磷酸二氢钙[Ca(H₂PO₄)₂·H₂O]、柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、乙醇(C₂H₅OH)均购自科密欧公司。氧化钽(Ta₂O₅)购自麦克林公司(过筛300目)。所有试剂均为分析纯。胎牛血清、青霉素、链霉素、DMEM培养基、MTT等均购自上海生工。实验用水为三蒸水。

1.3.2  实验用主要仪器  扫描电镜(JSM-IT100，JOEL LTD.)；X射线衍射仪(PANalytical X’Pert-PRO，MPD)；傅里叶红外光谱仪(Perkin-Elmerl720)；万能材料实验机(SHIMADZU AGX-1000)；手提式X射线透视仪(BJI-2，上海显微光电技术公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  载钽透钙磷石骨水泥的制备  根据文献[19]所用的共沉淀反应方法制备β-磷酸钙，温度为室温。按取摩尔比 1∶1的比例称取β-磷酸三钙和磷酸二氢钙，放入玛瑙研钵中研磨均匀，制得骨水泥磷酸钙基质粉体。然后将Ta₂O₅分别以0%，1%，3%和5%的质量比加入磷酸钙基质粉体中，充分研磨均匀，制得骨水泥粉剂。以含0.5%壳聚糖的0.5 mol/L柠檬酸溶液为固化液，按固、液比3 g/mL的比例进行调和，用不锈钢刀将骨水泥粉剂与液剂搅拌30 s制得膏剂。将膏体放入不同模具中进行性能检测。将Ta₂O₅加入量为0%，1%，3%和5%的材料分别命名为Ta-0、Ta-1、Ta-3和Ta-5。

1.4.2  骨水泥的固化时间、可注射性与抗溃散测定  采用文献[19]中的方法测定4种骨水泥材料的固化时间。在37 ℃、100%湿度下施以400 N的力，当针尖为1 mm的Vicat针不能在材料表面形成压痕的时间为计其固化。每个实验重复5次。

采用文献[20]中的方法测定4种骨水泥材料的可注射系数。取规格为2 mL的注射器，质量记为m₀；将骨水泥膏体填入注射器中，把注射器与其中膏体的总质量记为m₁；2 min后以150 mm/min的恒定速率推出水泥膏体，直到所用推力大于200 N时停止，此时注射器与其中剩余膏体的质量为m₂。通过式(1)计算材料的可注射系数(injection coefficient，IC)。每个实验重复5次。

采用文献[21]中的方法，将4种骨水泥膏体填入2 mL的注射器中，然后将膏体注射入生理盐水中煮沸10 min，观察材料有无崩溃迹象，拍照记录，检测抗溃散性。

1.4.3  骨水泥的微观形貌和物相组成分析  4种骨水泥材料固化后，研磨成粉，使用扫描电镜观察显微形貌，使用X射线衍射仪观察晶相组成，使用傅里叶红外光谱仪检测基团组成。

1.4.4  骨水泥的抗压强度检测  将4种骨水泥浆填入圆柱模具内，固化后取出，在37 ℃、100%湿度的环境下养护72 h，用砂纸将样品两端磨平，制成Ф5 mm×10 mm的圆柱体，用万能材料实验机测试样品的抗压强度，载荷   900 N，加压速度为1 mm/min，每组测试10个样品，计算结果取平均值。

1.4.5  骨水泥的显影性能检测  将4种骨水泥样品制成 Ф5 mm×2 mm的薄片，采用手提式X射线透视仪进行拍片。使用Matlab软件提取图像灰度值(5处5 μm²，计算平均值与方差作图)。将市售的猪脊骨做对比模体。不同厚度的铝片作为灰度标尺。

1.4.6  骨水泥的可降解性能的测试  将4种骨水泥材料制成Ф10 mm×2 mm的薄片，按照20 mL/g的比例加入到生理盐水中，然后放入37 ℃恒温水浴振荡器中振荡，隔天取出5 mL液体，再加入5 mL新鲜液体。7 d后取出样品，三蒸水淋洗表面3次，乙醇淋洗3次，37 ℃干燥48 h后称质量，测定失重率，实验重复5次。

1.4.7  骨水泥材料的细胞相容性  

MTT实验：MG63细胞(购自中科院细胞库)培养于37 ℃、体积分数5%CO₂和95%空气的中，添加含体积分数10%胎牛血清、500 IU/mL青霉素和0.1 g/L链霉素的DMEM培养基培养，隔天换液。

将4种骨水泥材料制成Ф10 mm×4 mm的圆柱体并灭菌^[19]，采用国标[YBB00012003-2015]方法制备材料浸提液，浸提介质为细胞培养基，浸提比例为1 g/5 mL浸提环境为37 ℃、体积分数5%CO₂和95%空气，浸提24 h。采用国标的方法进行MTT毒性实验。起始细胞浓度为每个96孔板2 000个MG63细胞，分别加入4种材料浸提液，以细胞培养基培养的为空白对照。培养1，3，7 d后于490 nm波长下测定光吸收值。细胞的相对增殖率=实验组吸光度 值/空白对照组吸光度值×100%。

细胞形貌：将4种骨水泥材料制成Ф5 mm×1 mm的薄片并灭菌^[19]。将1×10⁴个MG63细胞种到4种材料表面，每  3 d换液，复合培养1，3，7 d后中止反应，乙醇梯度脱水，真空干燥，喷金，扫描电镜观察细胞黏附。

1.5  主要观察指标  各组骨水泥材料的固化时间、可注射性、微观形貌、结构组成、显影性能、抗压强度、可降解性及细胞相容性。

1.6  统计学分析  使用Origin 9.0统计软件进行统计，所有数据均表示为x(_)±s，P < 0.05被认为差异有显著性意义。

固化时间是骨水泥的一个重要性能，一般认8-30 min为宜^[24]。纯透钙磷石骨水泥固化极快，约6 min。加入Ta₂O₅后材料固化时间延长到10 min左右，更适合临床应用。高达99%的可注射系数保证了材料良好的可注射性，有利于临床上开展微创手术，降低患者的痛苦。而良好的抗溃散性能使材料在植入体内后不易稀散与游离，不易引起其他不良反应^[25]。

通过显微分析可见，加入钽在一定程度上影响到了透钙磷石的固化过程，致使材料晶相结构、基团组成和表面形貌均发生变化。透钙磷石的固化过程为如下化学反应^[26]：

Ca(H₂PO₄)₂·H₂O→Ca²⁺+2H₂PO₄^-+H₂O                                               

β-Ca₃(PO₄)₂+4H⁺→3Ca²⁺+2H₂PO₄^-                                                           

Ca²⁺+H₂PO₄^-+2H₂O→4CaHPO₄·2H₂O+H⁺                        

总反应为：β-Ca₃(PO₄)₂+Ca(H₂PO₄)₂·H₂O(MCPM)+  7H₂O→4CaHPO₄·2H₂O                        

反应初始，磷酸钙颗粒表面先溶解，颗粒彼此紧密结合，固化反应进行，随着晶粒的生长与凝结在一起，水泥浆体渐渐失去流动性而固化。氧化钽不溶于水和酸，很难参与骨水泥的化学水化过程。但在透钙磷石晶粒生长过程中，氧化钽颗粒会存在于晶粒间阻止晶粒进一步生长，导致晶粒细小。但当钽含量过多时，由于成分不均匀致使晶粒生长不均匀，孔隙增加。同时，阻碍作用导致固化反应不彻底，X射线衍射检测到微量磷酸氢钙出现，固化时间也延长。另一方面Ta⁵⁺半径约70 nm，Ca²⁺半径约100 nm^[27]，其荷径比和电场强度更高，易导致晶格畸变，键长受影响，引起红外谱图的红移和蓝移现象。

众所周知，材料的晶粒形状、大小、孔隙缺陷等都会对材料在载荷时的应力传递产生显著影响^[28]。在这些综合因素的影响下，加钽对骨水泥抗压强度的提高呈现先上升后下降的趋势，Ta-3显示出最高的抗压强度，与扫描电镜观察到的材料晶粒更细、更加平整、孔隙更少相对应。而与Ta-3相比，Ta-5的抗压强度下降，扫描电镜观察到其表面孔隙更多、晶粒更粗大。实验所制备的载钽材料抗压强度在27-32 MPa间，能满足人体松质骨的修复需求^[22]。

目前文献报道的骨水泥显影增强剂掺入量大多要达到10%才能起效^[7-10]。比如何仕诚等^[29]、郑召民等^[30]、郑勇^[31]在骨水泥中分别添加20%钡剂、10%碘剂、7.5%多孔钡剂才达到显著的显影效果改善。此次实验加入小剂量Ta₂O₅就可明显增强透钙磷石的显影能力，这得益于钽更高的原子序数，更强的X射线阻滞能力。而显影能力的增强有利于实现透钙磷石术中和术后的监控，更利于临床使用^[5]。

透钙磷石骨水泥是少有的可在体内完全降解的骨水泥，但其缺点是降解过快，以致于新骨还未完全长出材料已经降解，不利于骨修复过程^[32]。从表面扫描电镜照片可见，加入载钽骨水泥材料形成更加致密的结构，有利于降低其过快的降解速度。加钽后，透钙磷石的7 d降解速率减缓了约40%。如果照此推断，载钽透钙磷石骨水泥降解时间由传统透钙磷石骨水泥的约70 d延长至100 d左右^[33]。黄田等^[34]在桡骨骨缺损动物模型中用自体骨模仿生理情况下的骨缺损修复情况，术后16周时，自体骨组缺损区消失，塑性完全，新骨成熟，完全修复。可见与纯的透钙磷石骨水泥相比，载钽后材料的降解速率更满足骨修复时间要求。但这只是推断，具体的匹配情况还需要进一步的体内实验以证实。

钽是一种生物相容性良好的生物材料，金属钽已在临床上被用作骨修复材料^[18]。此次实验结果显示，载钽材料无细胞毒性。同时将材料和成骨类细胞复合培养7 d后，还能观察到细胞在材料表面良好地生长，说明载氧化钽的透钙磷石具有良好的细胞亲和性能。

综上所述，在透钙磷石骨水泥中加入≤5%的氧化钽后，材料的固化时间可延长到10 min左右，同时仍具有良好可注射性与抗溃散性；能轻微影响材料的晶相组成和基团结构，提高材料的力学性能；能提高材料的显影性能，即使仅加入1%也能大幅度改善材料的显影性能；可将材料的7 d可降解速率降至10%；材料不具有细胞毒性，MG63细胞能在材料上正常黏附生长。该可注射、能显影的骨水泥具有进一步进行研究的价值。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

骨水泥：是一种用于骨科手术的医用材料，通常由固液两相调和后固化而成。实验中的透钙磷石骨水泥是由磷酸盐混合粉末固相和柠檬酸壳聚糖溶液液相按一定比例调和后固化而成。

显影性能：材料对X射线的阻滞能力而显示影像。由于透钙磷石骨水泥与人体骨组织成分接近，造成二者在X射线下难以区分，不利于临床应用。钽原子序数高，对X射线有较强阻滞能力，具有良好的显影性能。故通过添加氧化钽显影剂到骨水泥中，可以帮助临床医生实现可视化注射操作过程，降低临床医疗事故发生率。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

在应用可注射骨水泥的外科手术过程中，传统磷酸钙骨水泥因为显影性能和骨组织接近，导致手术操作监控或术后观察困难，容易发生骨水泥的渗漏等风险。实验将生物相容性好且本身就可以作为骨修复材料的氧化钽加入到降解性能优异的透钙磷石骨水泥中，研究发现载钽透钙磷石骨水泥因氧化钽的加入而显著提高了显影性能，同时具有良好的可注射性能和可降解性能，且抗压力学强度得到了一定的提升。材料亦对MG63不具有细胞毒性，且MG63细胞可以在材料上正常黏附与生长。载钽透钙磷石骨水泥具有良好的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程