人脐带间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑损伤以及生物发光技术示踪的研究及进展

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.025

摘要/Abstract

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文题释义：
活体生物发光成像技术：用荧光素酶基因标记细胞或病毒，并移植到受体的靶器官中，观察时注入外源荧光素，目标细胞内即可发生反应产生荧光，然后再利用高敏感度活体生物光学成像系统即可实现对靶细胞或靶分子表达的实时监测。
人脐带间充质干细胞治疗缺血性脑损伤的机制：人脐带间充质干细胞可促进实验动物缺血性脑损伤后神经功能恢复，有希望成为治疗缺血性脑损伤的新疗法。人脐带间充质干细胞治疗缺血性脑损伤可通过神经元保护、重塑神经环路、促进内源性血管再生、调控免疫炎性反应、调控神经代谢产物等途径发挥积极作用。

摘要
背景：人脐带间充质干细胞移植能有效促进缺血性脑损伤实验动物神经功能恢复，但目前尚不明确人脐带间充质干细胞的治疗机制及最佳移植途径。活体生物发光成像技术能实时动态监测移植干细胞在体内增殖、迁移及存活等情况，已广泛运用于干细胞移植领域。
目的：综述人脐带间充质干细胞经不同移植途径治疗缺血性脑损伤的应用及活体生物发光成像技术在干细胞移植治疗缺血性脑损伤研究中的最新进展。
方法：分别以“人脐带间充质干细胞，缺血性脑损伤，活体生物发光成像”，“human umbilical cord mesenchymal stem cells , brain ischemia , bioluminescence imaging”为检索词，由第一作者检索2011年1月至2016年12月中国期刊全文数据库、PubMed数据库相关文献。排除相关性差及重复性研究的文献，计算机初检到98篇文献，最终保留38篇进行归纳总结。
结果与结论：人脐带间充质干细胞可经静脉、动脉、腰穿、脑立体定向移植、侧脑室移植等不同移植途径治疗缺血性脑损伤，各有优缺点，主要集中在干细胞迁移范围、存活率和安全性等方面。研究发现活体生物发光成像技术具有实时动态监测、高灵敏度、高时间分辨率、操作方便等优点，可用于监测移植干细胞在体内迁移、增殖和存活等情况。运用活体生物发光成像技术示踪人脐带间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑损伤，明确人脐带间充质干细胞的作用机制及选择最佳移植途径值得进一步探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0888-8350(王立新)

关键词: 干细胞, 移植, 人脐带间充质干细胞, 移植途径, 缺血性脑损伤, 生物发光成像技术, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells can effectively promote the recovery of neurological function in animal models of ischemic brain injury. However, it is unclear on the mechanisms underlying the therapeutic actions of human umbilical cord mesenchymal stem cells and the optimal transplantation way. Bioluminescence imaging has been widely used in the field of stem cell transplantation for real-time dynamic monitoring of the proliferation, migration and survival of transplanted stem cells.
OBJECTIVE: To review the studies of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the treatment of ischemic brain injury and the recent research progress of bioluminescence imaging in the stem cell transplantation for the treatment of ischemic brain injury.
METHODS: The key words were “human umbilical cord mesenchymal stem cells, brain ischemia, bioluminescence imaging” in English and Chinese, respectively. The first author retrieved PubMed database, Chinese Journal Full-text Database for relevant articles published from January 2011 to December 2016. Literatures with repetitive content and poor relationship were excluded. A total of 98 literatures were initially retrieved, and finally 38 articles met the inclusion criteria.
RESULTS AND CONCLUSION: Human umbilical cord mesenchymal stem cells can be transplanted via the vein, artery, lumbar puncture, stereotactic operation, intraventricular approach in the treatment of ischemic brain injury. They have their own merits and demerits, which mainly focus on stem cell migration range, survival rate, safety and so on. It has been found that bioluminescence imaging technology for the living is characterized by real-time dynamic monitoring, high sensitivity, high-time resolution and easy operation, which can be used to monitor the migration, proliferation and survival of transplanted stem cells in vivo. Therefore, further investigation on the mechanism of human umbilical cord mesenchymal stem cells that are labeled by bioluminescence imaging technology and selection of the optimal transplantation approach is warranted.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Brain Ischemia, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王立新，李惠平. 人脐带间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑损伤以及生物发光技术示踪的研究及进展[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5407-5412.

Wang Li-xin, Li Hui-ping. Human umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation by different pathways and stem cell tracing by bioluminescence imaging in the treatment of ischemic brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5407-5412.

图/表（结果） 2

2.1 HUCMSCs不同途径移植治疗缺血性脑损伤的安全有效性及机制 HUCMSCs经不同移植途径治疗缺血性脑损伤是安全有效的，不同移植途径有其各自的优缺点，主要集中在干细胞迁移范围、存活率和安全性等方面(表1)^[16-23]。近年来有大量实验研究HUCMSCs经静脉、动脉、腰穿、脑立体定向移植、侧脑室移植方式治疗缺血性脑损伤的安全有效性及机制(表2)^[5^，⁷^，^23-34]。

2.1.1 静脉移植 近年多项研究将HUCMSCs经尾静脉注入到大脑中动脉缺血再灌注大鼠体内^[24^，^26-27]，结果发现大鼠神经功能得到改善，脑水肿、梗死体积显著下降，通过调控免疫炎性反应发挥神经保护作用，包括降低促炎性因子，升高抗炎性因子，上调免疫炎性反应初期Foxp3 mRNA表达。Li等^[5]证实经尾静脉移植HUCMSCs可改善脑缺血小鼠神经功能，缩小梗死区，促进内源性神经再生，并抑制星形胶质细胞活化。张培培等^[25]结果表明人脐带间充质干细胞经尾静脉途径移植可以在宿主脑内存活，通过生成神经元样细胞和神经胶质样细胞、促进新生血管形成并分泌神经营养因子等因素促进大鼠神经功能恢复，且未发现明显免疫排斥反应及异常分化细胞，具有较高的安全性。

Guan等^[28]选择将HUCMSCs经股静脉注入模型体内，其能够改善脑缺血小鼠神经功能，神经代谢产物变化较大，N-乙酰天冬氨酸(NAA)/磷酸肌酸(Cr)和胆固醇(Cho)/磷酸肌酸(Cr)比值明显升高，乳酸(Lac)/磷酸肌酸(Cr)比值明显降低，提示股静脉移植HUCMSCs可能通过影响缺血区的神经代谢产物而减轻缺血性脑损伤。Zhu等^[29]将5×10⁶个HUCMSCs经股静脉注入脑缺血再灌注兔模型体内，发现移植HUCMSCs抑制了早期脑缺血诱导的血清白细胞介素1β，白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平的增加，并显著降低缺血区周围凋亡细胞的百分比，说明HUCMSCs可能通过抑制脑缺血诱导的早期炎症反应及神经细胞凋亡来发挥作用。

以上实验研究证实不论是经尾静脉还是股静脉对于HUCMSCs移植治疗缺血性脑损伤都是安全的，可以通过调控免疫炎性反应、重塑神经环路、内源性血管再生、调控神经代谢产物、表达一些内源性营养因子、抑制脑缺血诱导的神经细胞凋亡等多个途径来发挥作用。

2.1.2 颈动脉移植 Karlupia等^[30]经颈动脉将脐血单个核细胞、脐血间充质干细胞、脐带基质间充质干细胞分别注入至大脑中动脉闭塞大鼠体内，移植后2周，与假手术组相比，所有3种细胞组和PBS组的缺血半球均观察到脑源性神经营养因子mRNA的表达显著降低，脐血单个核细胞组降低最少。脐血间充质干细胞组观察到白细胞介素2 mRNA和白细胞介素6 mRNA的表达明显降低。该研究证实经颈动脉移植HUCMSCs治疗缺血性脑损伤的安全性和有效性，其在基因水平调控炎症反应从而发挥作用。

2.1.3 经脑立体定向移植 国内刘慧纯等^[21]将HUCMSCs立体定向移植至大脑中动脉闭塞大鼠损伤侧纹状体，结果显示，HUCMSCs移植后第7天，移植组mNSS评分显著低于PBS组和模型组，提示经脑立体定向移植HUCMSCs早期即可促进损伤脑组织修复，实验中还发现PBS组在损伤后第14天(即移植操作后第7天)mNSS评分较前略有下降，仍高于对照组，说明移植操作可以加重脑组织损伤，而这种损伤随着时间推移可恢复。通过Brdu标记HUCMSCs，发现移植组大鼠损伤中心及周围均可见Brdu染色阳性细胞及Nestin、微管结合蛋白 2、胶原纤维酸性蛋白、Ⅷ因子、血管内皮生长因子免疫组织化学双染阳性细胞，推测HUCMSCs发挥作用的机制可能与分泌神经营养因子、内源性血管再生有关。其他也有研究发现其机制与神经发生、内源性血管再生、调控免疫炎性反应相关^[31-33]。

2.1.4 侧脑室移植 Kim等^[34]将1×10⁵个HUCMSCs经侧脑室移植至大脑中动脉闭塞幼鼠损伤侧，通过MRI评价梗死病变体积，圆筒实验和旋转实验评价大鼠神经行为学，结果发现，移植组脑缺血体积缩小，神经功能改善。在缺血半暗带中观察到脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TUNEL)、反应性小胶质细胞(ED-1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记的细胞显著增加，这表明HUCMSCs可经神经血管发生及神经保护途径来发挥作用。

2.1.5 不同移植途径比较 对HUCMSCs经不同移植途径治疗缺血性脑损伤进行比较，如Lim等^[23]分别将1×10⁶、5×10⁵两个剂量HUCMSCs经尾静脉、腰椎穿刺分别注入大脑中动脉闭塞大鼠缺血损伤侧，通过TTC染色和MRI评价梗死病变体积，旋转试验和移除黏附物能力测试评价大鼠神经行为学，结果表明两种移植方式注射1×10⁶个HUCMSCs均可有效改善神经功能，5×10⁵个HUCMSCs鞘内给药显著减少了缺血性损伤，但在静脉注射治疗组中没有显著效果。而经腰椎穿刺移植的HUCMSCs存活时间更长，迁移范围更广泛，并可分化为神经细胞和星形胶质细胞。

现有的多项研究支持HUCMSCs经不同移植途径治疗缺血性脑损伤的安全性及有效性。经脑立体定向移植操作可以加重脑损伤，是由于其可能影响梗死灶周围的血供或直接损害脑组织还是其他原因并未阐明；经静脉及腰椎途径移植对比可发现后者存活时间及迁移范围皆优于前者，可能是因为移植的HUCMSCs可以随脑脊液循环迁移到整个大脑和脊髓。

目前尚不能明确HUCMSCs治疗缺血性脑损伤的机制，且HUCMSCs各种移植途径之间缺少对比，因此，迫切需要能够活体内动态监测移植干细胞增殖、分化、迁移及作用机制的成像技术。

2.2 活体生物发光成像技术在干细胞治疗缺血性脑损伤中的应用 目前BLI可用于监测干细胞移植后的迁移、分布、生存时间，追踪不同因子如营养因子及免疫炎性因子的动态变化，以了解干细胞发挥作用的机制等(图1)，在干细胞治疗缺血性脑损伤领域中广泛应用。

Rosenblum等^[35]为评估脑源性神经营养因子是否能提高神经干细胞移植治疗缺血缺氧性脑损伤的神经功能恢复，运用BLI，先构建含有Fluc和增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体转染干细胞，于造模后3 d经颈动脉注入到缺血缺氧脑损伤模型小鼠体内，再应用IVIS系统分析，发现脑源性神经营养因子预处理组神经干细胞数量明显高于未预处理组，其模型小鼠神经功能恢复也显著提升。而另一项研究为了解炎性趋化因子在神经干细胞移植治疗缺血性脑损伤的作用^[36]，将转染后的神经干细胞在造模24 h后，经动脉分别注入表达趋化因子受体CCR2^-^/^-报告基因和CCR2^+/+报告基因的缺血缺氧模型小鼠体内。用BLI实时动态监测神经干细胞迁移，结果发现移植6 h后，大量CCR2^+/+细胞迁移至脑组织，移植后第3天，CCR2^+/+组GFP标记细胞数明显多于CCR2^-/-组，表明CCL2/CCR2相互作用在干细胞移植治疗缺血性脑损伤中起至关重要的作用。

近年来有研究通过BLI来监测不同移植途径对干细胞治疗缺血性脑损伤效果的影响。如Pendharkar等^[17]构建转染干细胞，并于造模24 h后将干细胞通过静脉或动脉的方式注入缺血缺氧小鼠模型，运用BLI观察上述两种不同途径移植干细胞在小鼠体内的分布情况。结果发现通过动脉移植的干细胞主要分布在颅内，而静脉移植的干细胞主要集中在肺。1周后，BLI显示动脉移植小鼠颅内信号稍有减弱，静脉移植小鼠肺内荧光信号几乎消失，荧光免疫组化结果与BLI结果一致。结果提示，相对于静脉移植，动脉移植可以使移植干细胞更好地作用于病灶，并提高存活时间。但对于其他移植方式如腰穿、脑立体定向移植、侧脑室移植等暂未有研究对其进行比较。

在监测干细胞移植后迁移、生存时间方面，近年来也有少数研究。Rosenblum等^[37]为了解神经干细胞移植后的生存时间，通过构建慢病毒-Rluc-eGFP载体，转染干细胞，并将干细胞分别于造模后6，24 h和3，7，14 d，经动脉注入缺血缺氧小鼠模型体内。运用BLI示踪不同时间点移植干细胞的存活情况。结果显示，造模后3 d移植更有利于干细胞存活。Boehm-Sturm等^[38]将干细胞于造模后48 h经脑立体定向移植注入正常及大脑中动脉闭塞模型小鼠体内，移植后观察4周，用多模态成像(BLI联合¹⁹F-MRI)观察神经干细胞在时间动态上的存活率，值得提出的是，实验发现¹⁹F-MRI在移植手术控制方面非常有用，而BLI在长期动态跟踪干细胞方面更有效，这提示在研究干细胞时可以联合多种活体成像技术来监测移植细胞的存活情况及移植时间点等。

以上基础研究可看出BLI在监测干细胞移植治疗缺血性脑损伤后的迁移、分布、生存时间、发挥作用机制等方面发挥积极的作用，但主要侧重于神经干细胞；有研究发现经腰椎穿刺移植的HUCMSCs可分化为神经细胞和星形胶质细胞，但是否与机制相关尚缺少更多研究支持^[33]，需要BLI监测多种移植途径治疗缺血性脑损伤进行对比以了解确定最佳移植途径。

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引言

近年来，静脉溶栓和血管介入治疗缺血性脑卒中已取得了很大进展，但脑卒中仍是导致世界人口死亡的主要原因之一^[1]。现有疗法主要侧重于改善侧支循环、营养神经等，但无法从根本上修复受损的神经组织^[2]。大量的实验研究表明，干细胞移植治疗缺血性脑卒中不仅可以实现细胞替代和功能重建，而且可以促进神经修复，具有良好的临床应用前景^[3]。目前用于治疗缺血性脑卒中的干细胞有间充质干细胞、内皮祖细胞和神经干细胞^[4]。间充质干细胞是使用最多的干细胞类型，主要来源于骨髓、脐带、脂肪组织等。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSCs)具有取材方便、来源广、无伦理学争议、免疫排斥反应弱等优点，是治疗缺血性脑卒中的理想干细胞类型^[5-7]，但HUCMSCs移植治疗缺血性脑卒中的机制和最佳移植途径尚不明确。

HUCMSCs移植后的示踪技术有超声、CT、MRI、正电子成像术、活体生物发光成像技术(bioluminescence imaging，BLI)等。BLI用荧光素酶基因标记细胞或病毒，并移植到受体的靶器官中，荧光素酶在三磷酸腺苷和体内活细胞的O₂环境下，与底物荧光素结合发生氧化反应，产生能穿透5-10 mm组织的560 nm左右的荧光，底物荧光素的脂溶性好，具有自由通过血脑屏障的特性。不同的荧光素酶存在于不同的物种，如萤火虫(Fluc)、桡足类动物(Gluc)、海肾(Rluc)等，Gluc和Rluc产生的发射光波长为460 nm，易被组织吸收，组织穿透性较差，因此在活体内使用效果不好；Fluc由于光谱适宜，可以从很多有机体中分离得到，目前应用较为广泛^[8]。荧光素酶基因主要经转基因技术或病毒转染标记干细胞。转基因动物模型无致癌性等，但成本高、周期长；病毒载体表达高稳定，但存在安全隐患，在实验模型中还是以病毒载体具有优势，其中慢病毒载体应用较多。

BLI可以实时监测评估活体内靶细胞或靶分子的表达^[9]，可以长时间跟踪细胞。荧光素酶基因插入细胞染色体中稳定表达，细胞后代都表达荧光素酶而不稀释，发光数量很稳定，故BLI可用于精确定量^[10]。而且光子发射仅在荧光素酶表达位点发生，而没有非特异性背景信号。光子发射与细胞数成正比，从而允许细胞定量^[11]。与其他活体成像技术相比，BLI具有不受生物体内非特异性荧光的影响，可实时动态监测、特异性高、可精确定量、高信噪比、非侵入性、灵敏度高等优点。因此该技术被广泛运用于干细胞移植领域，用来监测和追踪细胞、基因表达^[12]，以及干细胞移植后的迁移、分布、生存时间，了解干细胞治疗机制等。

虽然荧光素可自由通过血脑屏障，但转运蛋白ABCG2可将其泵回^[13]，而且在缺血性脑损伤期间，血脑屏障通透性受损可能影响生物分布，所以优化成像方案或者研制出更多的荧光素衍生物值得进一步研究。BLI与遗传表达相关，此风险限制了BLI在人类受试者中的使用，开发无DNA诱导荧光素酶表达的方法，包括修饰mRNA或蛋白方法^[14-15]，可能允许BLI进入临床试验，但仍然值得探讨。

文章对近年HUCMSCs不同移植途径治疗缺血性脑卒中的现状及BLI在干细胞移植治疗缺血性脑卒中研究中的最新进展进行综述，希望对今后相关研究提供理论依据。