LINGO-1在脊髓神经干细胞分化过程中的表达特征及效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.023

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (33): 5394-5399.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.023

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

LINGO-1在脊髓神经干细胞分化过程中的表达特征及效应

许刚¹，赵晨光²，孙玮²，琚芬²，袁华²，牟翔²

¹解放军新疆军区总医院全军骨科中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830000；²空军军医大学第一附属医院康复医学科，陕西省西安市 710032

修回日期:2017-06-18 出版日期:2017-11-28 发布日期:2017-12-01
通讯作者: 赵晨光，博士，主治医师，空军军医大学第一附属医院康复医学科，陕西省西安市 710032
作者简介:许刚，男，1970年生，浙江省杭州市人，汉族，1996年解放军第四军医大学毕业，硕士，主任医师，主要从事脊柱及创伤骨科方向研究。
基金资助:
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2016D01C395)

The expression and effect of LINGO-1 during the differentiation of spinal cord derived neural stem cells

Xu Gang¹, Zhao Chen-guang², Sun Wei², Ju Fen², Yuan Hua², Mou Xiang²

¹Orthopedic Center of Chinese PLA, General Hospital of Xinjiang Military Region, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; ²Department of Rehabilitation, Xijing Hospital, Air Force Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Revised:2017-06-18 Online:2017-11-28 Published:2017-12-01
Contact: Zhao Chen-guang, M.D., Attending physician, Department of Rehabilitation, Xijing Hospital, Air Force Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Xu Gang, Master, Chief physician, Orthopedic Center of Chinese PLA, General Hospital of Xinjiang Military Region, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2016D01C395

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
LINGO-1：是由614个氨基酸构成的跨膜生物蛋白，定位于15q24.3。由LINGO-1及NgR、P75/Troy组成的共同复合受体在髓鞘源性抑制因子介导的多种生理作用中扮演了重要的角色。研究表明，LINGO-1可以通过NgR1/P75/LINGO-1或NgR1/Troy/LINGO-1调节调控轴突延伸和再生、调控神经元存活以及调控少突胶质细胞成熟及再髓鞘化。
神经干细胞：Mckay 于1997年在《Science》上将神经干细胞的概念总结为：具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。神经干细胞移植可以通过分化为神经元替代损伤区缺损的神经元，也可以通过旁分泌作用分泌神经生长因子作用于脊髓内源性的神经干/祖细胞，也可以通过分化为少突胶质细胞促进轴突的再髓鞘化等机制修复脊髓损伤，促进功能恢复。

摘要
背景：研究LINGO-1在脊髓神经干细胞分化过程中的表达及效应对调控神经干细胞分化及修复脊髓损伤有着重要的意义。
目的：观察LINGO-1在脊髓神经干细胞分化过程中的表达特征及生物学作用。
方法：体外培养大鼠脊髓神经干细胞，并对培养细胞进行Nestin染色干性鉴定及诱导分化多能性鉴定。于分化第0天及第5天进行LINGO-1与Nestin(神经干细胞)、β-Tubulin Ⅲ(神经元细胞)、GFAP(星形胶质细胞)及O₄(少突胶质细胞)免疫荧光双染色，观察LINGO-1的表达特征。体外培养的大鼠脊髓神经干细胞分为对照组及干扰组，干扰组脊髓神经干细胞感染LINGO-1 shRNA慢病毒下调LINGO-1表达，对照组脊髓神经干细胞感染Scramble-shRNA慢病毒，于感染第5天免疫荧光染色检测神经元突起长度。
结果与结论：①脊髓神经干细胞可以分化成为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞；②LINGO-1在脊髓神经干细胞及其分化的神经元、少突胶质细胞中表达，但不在星形胶质细胞中表达；③下调LINGO-1表达后，干扰组神经元突起长度较对照组明显增长，差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，体外培养的脊髓神经干细胞具有多项分化潜能，LINGO-1在脊髓神经干细胞及分化早期的神经元、少突胶质细胞中表达，但不在星形胶质细胞中表达。LINGO-1对分化后神经元突起生长具有负性调控作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1394-349X(许刚)

关键词: 干细胞, 神经干细胞, LINGO-1, 脊髓神经干细胞, 克隆球, 突起, 新疆维吾尔自治区自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It is of great significance to explore the expression and effect of LINGO-1 in the differentiation of spinal cord derived neural stem cells (SpNSCs) for regulating neural stem cell differentiation and repairing spinal cord injury.
OBJECTIVE: To investigate the expression features and biological effects of LINGO-1 in the differentiation of SpNSCs.
METHODS: SpNSCs were isolated from the rat spinal cord and cultured in vitro. The expression characteristics of LINGO-1 was observed through double immunofluorescence staining of LINGO-1 and Nestin (neural stem cells), β-Tubulin III (neurons), GFAP (astrocytes) and O₄ (oligodendrocyte) at 0-5 days of differentiation. SpNSCs isolated from the rat spinal cord were cultured in vitro and divided into siRNA group and control group. The siRNA group was transfected with LINGO-1 shRNA lentiviral vector to down-regulate the expression of LINGO-1, and the control group was transfected with Scramble-shRNA lentiviral vector. The growth of neurites was detected by immunofluorescence staining at 5 days after transfection.
RESULTS AND CONCLUSION: The SpNSCs could differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes. LINGO-1 was expressed in SpNSCs, neurons and oligodendrocytes, but not in astrocytes. The neurite length of the siRNA group was significantly longer than that of the control group (P < 0.05). In summary, the SpNSCs have the potential of multi-directional differentiation, and LINGO-1 has a negative effect on the neurite growth.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Spinal Cord, Neural Stem Cells, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

许刚，赵晨光，孙玮，琚芬，袁华，牟翔. LINGO-1在脊髓神经干细胞分化过程中的表达特征及效应[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5394-5399.

Xu Gang, Zhao Chen-guang, Sun Wei, Ju Fen, Yuan Hua, Mou Xiang. The expression and effect of LINGO-1 during the differentiation of spinal cord derived neural stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5394-5399.

图/表（结果） 2

2.1 脊髓神经干细胞多向分化潜能 脊髓神经干细胞培养2周后可见中等大小的圆形细胞克隆球形成，将克隆球接种到载玻片后第1天即见到有细胞分化出现，随诱导分化时间延长Nestin表达减弱，β-Tubulin Ⅲ阳性细胞(神经元细胞)出现并逐渐增多(图1A-C)，神经元成龛状分化生长，即在广泛星形胶质细胞背景下，神经元呈圆形向外放射状生长；GFAP阳性细胞(星形胶质细胞)在种植到载玻片上第1天即可被检测到，第3天可见明显增多(图1D-F)，整个视野下星形胶质细胞散在较均匀分布，数量较多且密集；O₄阳性细胞(少突胶质细胞)在分化后第2天就开始出现，第5天数量明显增多(图1G-I)。

2.2 LINGO-1在脊髓神经干细胞分化过程中的表达特征 为了进一步探索LINGO-1在脊髓神经干细胞分化过程中的表达特征，运用LINGO-1抗体及Nestin抗体(脊髓神经干细胞)、β-Tubulin Ⅲ抗体(神经元)、GFAP抗体(星形胶质细胞)、O₄抗体(少突胶质细胞)进行免疫荧光双染色观察。实验结果表明(95±2.1)%细胞在分化第0天时表达Nestin，并且这些细胞(100±0)%表达LINGO-1(图2A-D)。至分化第5天时进行免疫荧光染色，结果显示(82.0±1.5)%神经元(图2E-H)、(0±0)%星形胶质细胞(图2I-L)及(98.0±1.9)%少突胶质细胞(图2M-P)表达LINGO-1。

2.3 LINGO-1干扰序列的选择 为了筛选检测设计的干扰片序列，对设计方案进行RNA干扰实验，然后进行Real-time PCR检测，发现pRNAi-Lingo1可使LINGO-1的RNA表达下降至对照组的30%(图3)。

2.4 LINGO-1对分化形成神经元突起长度的影响 在分化第5天应用β-Tubulin Ⅲ抗体对神经元进行免疫荧光染色。结果提示LINGO-1干扰组的神经元突出长度(图4E-H)明显长于对照组神经元突出长度(图4A-D)，两者突出长度分别为(37.1±2.5) μm及(54.8±3.9) μm，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

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引言

神经干细胞是具有自我复制、增殖及多向分化潜能的一类细胞，其具体的定义为：①可自我复制及更新，产生与自己相同的子代细胞，维持稳定的细胞储备；②处于较原始的未分化状态，无相应成熟细胞的特异性标志；③具有多向分化的潜能，即演变成不同成熟细胞类型的能力；④当损伤与疾病时可产生新细胞^[1]。近年来，虽然对于神经干细胞的认识有了长足的进步，但是神经干细胞确切的分布以及其在发育成熟过程中如何分化、迁移、整合以及其调控的具体因素都不甚明确。正常情况下，脊髓室管膜区存在着“静止”状态的神经干细胞，在脊髓损伤后可被激活，发生增殖分化并参与损伤后病理及修复过程。如何调控其分化特性，促进脊髓损伤后的神经修复、减少胶质瘢痕形成，是目前脊髓损伤研究的热点^[2]。

髓鞘源性抑制因子(myelin-associated inhibitory factors，MAIFs)存在于少突胶质细胞髓鞘中，脊髓损伤髓鞘崩解而广泛存在于损伤核心区域或周边微环境中，参与胶质瘢痕形成，抑制轴突再生。Nogo A是众多髓鞘源性抑制因子中表达最为广泛的抑制因子之一^[3]，其可以通过与NgR/P75/LINGO-1或NgR/P75/LINGO-1复合受体结合来介导多种生物效应，在脊髓损伤后的神经修复中扮演了极其重要的角色^[4]。Nogo A复合受体中的LINGO-1(LRR and Ig domain containing，Nogo receptor interacting protein)蛋白是由614个氨基酸构成的跨膜生物蛋白，包括12个富亮氨酸重复序列，1个Ig区，1个跨膜区和1个短小的胞浆区，可以调控轴突再生、神经元存活以及少突胶质细胞成熟及再髓鞘化^[5-6]。

实验旨在观察LINGO-1基因在脊髓神经干细胞(spinal cord derived neural stem cells，SpNSCs)中的表达特征及生物学作用，进一步探讨其对脊髓神经干细胞及神经突起生长等方面的影响。

材料方法

1.1 设计 体外对照观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年3月至2017年3月在空军军医大学神经研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级10周龄Fischer344雌性大鼠3只(独立3个生物学重复实验)，体质量160-180 g，由空军军医大学实验动物中心提供，动物饲养许可编号：SCXK(军)2012-007，实验得到空军军医大学实验动物伦理委员会的许可。

1.3.2 主要试剂 细胞培养用DMEM/F12、B27添加剂、N2添加剂、GlutaMAX添加剂及胎牛血清等(Gibco公司)；碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子(Peprotech公司)；Accutase、Poly-L-Lysine及Laminin(Sigma公司)；Nestin、β-Tubulin Ⅲ、GFAP、O₄一抗(STEMCELL公司)；荧光二抗为Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔二抗，Alexa Fluor 594标记的驴抗兔二抗(STEMCELL公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 成年大鼠脊髓神经干细胞的分离培养 10周龄Fischer344大鼠处死后，椎板减压暴露脊髓，取C₃至T₁₂节段脊髓置于预冷的Hank’s液中，小心用眼科剪剥离硬脊膜，将脊髓剪碎后加入Accutase中于37 ℃消化30 min，加入神经干细胞培养基终止消化，离心后用神经干细胞培养基重悬，用火焰抛光的巴斯德吸管反复吹打成单细胞悬液，用40 μm滤网过滤后，锥虫蓝计数，按1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于神经干细胞培养基(DMEM/F12+2% B27+1% N₂+20 μg/L表皮生长因子+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)中，每3 d半量换液1次。生长至第7天时机械吹打法传代。每7 d传代1次，传至第4代时进行实验。

1.4.2 LINGO-1 shRNA慢病毒表达载体构建及包装 由上海吉凯生物基因公司提供。shRNA插入序列为：Sense 5’-TGC TGT AGT CTA GCA GGA TGA CGA TCG TTT TGG CCA CTG ACT GAC GAT CGT CAC TGC TAG ACT A-3’，Antisense 5’-CCT GTA GTC TAG CAG TGA CGA TCG TCA GTC AGT GGC CAA AAC GAT CGT CAT CCT GCT AGA CTA C-3’。

体外培养的大鼠脊髓来源神经干细胞分为对照组及干扰组，干扰组通过LINGO-1 shRNA慢病毒感染脊髓神经干细胞下调LINGO-1表达，对照组感染scramble-shRNA慢病毒。

1.4.3 免疫荧光染色 第3代神经干细胞加血清随机诱导分化至第5天或第4代神经干细胞经慢病毒感染5 d后，吸弃培养基，用PBS清洗1次以彻底去除残留的培养基，40 g/L多聚甲醛固定30 min后用PBS清洗3次，每次5 min；加入0.3%Triton X-100通透5 min，PBS清洗2次。加入稀释好的Nestin、β-Tubulin Ⅲ、GFAP、O₄一抗4 ℃孵育过夜，次日吸弃一抗，PBS洗3次，每次5 min。加入稀释好的Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔二抗，Alexa Fluor 594标记的驴抗兔荧光二抗37 ℃避光孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，滴加DAPI封固剂，室温孵育30 min，镜下观察。

1.4.4 神经突起长度检测 使用β-Tubulin Ⅲ抗体对神经元进行免疫荧光细胞染色并进行观察，长度测量分别由2位独立技师重复测量3次，并随机选择其中1次作为最后结果。至少每载玻片40个神经元，共计400个神经元纳入最后统计分析。神经突起长度规定至少超过其所在神经胞体直径，如果有多于1个突起存在，以最长突起计算。突起长度使用ImageJ软件进行测量及分析。

1.5 主要观察指标 ①脊髓神经干细胞分化鉴定结果；②LINGO-1在分化过程中表达特征及神经轴突生长情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。数据以x(_)±s表示。组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

实验成功从成年大鼠脊髓中提取培养了神经干细胞，发现其可以分别向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化，证明了其多向分化潜能。经诱导分化后检测LINGO-1在脊髓神经干细胞及分化后的神经元、少突胶质细胞中表达，但不在星形胶质细胞中表达。然后利用LINGO-1 shRNA对脊髓神经干细胞进行干预，观察到LINGO-1对分化后神经元突起生长具有负性调控作用。以上实验结果证实脊髓损伤后LINGO-1的表达特征及其对神经突起形成的作用。

脊髓损伤是康复医学领域的常见损伤，其治疗难、预后差。在中国每年约有1万余新发病例，这些新发病例中以青壮年男性的胸腰段损伤最多，患者在医治过程中耗费着国家巨大的医疗资源和经济资源^[7]。脊髓损伤修复的基础性研究也一直因为体内环境复杂、影响因素众多、实验技术不完善等原因极大地限制了研究步伐和临床应用。随着干细胞认识的加深和脊髓再生抑制基因的明确为学者进行相关研究指出了新方向，也为近一步开展临床应用提供理论依据和新思路。

神经干细胞是具有自我复制、增殖及多种分化潜能的细胞。采用神经干细胞移植以替代脊髓损伤区缺损的神经元，从而达到脊髓再生的目的，被认为是治疗脊髓损伤一种很有前景的方法，相关研究也日渐受到国内外众多学者的重视^[8-11]。但是大量体内研究发现，由于炎症反应、免疫排斥等因素存在，导致内源性神经干细胞及移植的外源性神经干细胞大部分分化为星形胶质细胞而形成胶质瘢痕，因此探究有效的作用靶点来调控神经干细胞的分化因素，提高神经细胞的分化率，抑制胶质瘢痕形成，是目前神经干细胞移植治疗脊髓损伤研究领域的热点话题之一。

在成年哺乳动物脑内，神经干细胞主要分布在以下4个区域：①紧贴外侧脑室外侧壁的室管膜下区；②海马齿状回内的颗粒细胞下层区；③位于海马和胼胝体之间的胼胝体下区；④位于内侧颗粒层和白质之间的小脑边缘区域^[12]。但是目前对于神经干细胞的来源及细胞特性尚存在一定的争议，Johansson等研究认为神经干细胞是来源于室管膜细胞的某个亚群，然而Doetsch等研究却发现室管膜下区神经干细胞表达GFAP，一种成熟星形胶质细胞的标记物。瑞典卡罗林斯卡Frisen小组的一系列研究证实在小鼠室管膜区也存在着“静止”状态的神经干细胞，在脊髓损伤等特定因素下可以被激活，从而出现增殖进而分化的现象，但是无论是这些内源性的神经干细胞还是移植外源性的神经干细胞，大多数都分化为星形胶质细胞，参与胶质瘢痕的形成^[8]，这其中髓鞘源性抑制因子扮演了非常重要的角色。

脊髓损伤后出现神经元坏死、神经传导束崩解，少突胶质细胞包裹轴突形成的髓鞘分解，形成大量的髓鞘源性抑制因子，这其中包括Nogo-A、MAG和OMgp为代表抑制因子，Nogo-A复合受体之一LINGO-1是由614个氨基酸构成的跨膜生物蛋白，由15号染色体编码而成，定位于15q24.3，其可以通过调控RhoA途径，使生长锥塌陷而使轴突再生受阻^[13]；也可以参与并下调EGFR，从而影响Akt通路而调控神经元存活^[6]；还可能影响少突胶质细胞成熟及再髓鞘化^[14]。但是LINGO-1在脊髓神经细胞及分化过程中的表达特征及对神经突起的影响却未见相关报道。

实验成功的从大鼠脊髓中提取并培养了神经干细胞，经过Nestin染色干性鉴定，证明了具有神经干细胞特异性表达特征，为了证明其具有多向分化的潜能，分别应用神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性诱导分化试剂对其进行诱导分化，分别得到了表达β-Tubulin Ⅲ的神经元细胞，表达GFAP的星形胶质细胞及表达O₄的少突胶质细胞，以上实验结果证明成年大鼠脊髓可以作为一种成熟且稳定的神经干细胞来源，这为以后相关的基础及临床实验奠定了基础。当然成年大鼠脊髓作为神经干细胞来源也存在一定问题，这其中最主要的就是细胞数量，在正常情况下，脊髓中央管周围的神经干细胞处于“静止”状态，所以在分离提取时数量比较低，需要多次传代后才能获得稳定的细胞量，国内叶正旭等^[15]提出在脊髓损伤造模后，可以使神经干细胞活化，并且刺激其增殖来提高其产量，这不失为一种解决办法。

在稳定获得脊髓神经干细胞后，进一步检测了LINGO-1的蛋白表达特征。实验发现LINGO-1在分化第0天表达于脊髓神经干细胞，分化第5天表达于神经元及少突胶质细胞，但不表达于星形胶质细胞。Lööv也检测过皮质来源神经干细胞中LINGO-1的表达特征^[16]，其分化第6天的表达情况大致与本实验相同，但是LINGO-1在神经元及少突胶质细胞的表达比例高于本实验结果，可能是由于不同来源的神经干细胞自身特性造成的。神经干细胞在分化过程中其各细胞成熟时间不尽一致，星形胶质细胞成熟较早，而少突胶质细胞及神经元成熟较晚，所以在分化第5天时前者可能并不表达LINGO-1，而尚未完全成熟的后两者则表达LINGO-1。

实验还发现当LINGO-1表达下调时，分化后神经细胞的突起长度明显增长。Wang等^[17]应用NgR siRNA进行干预，也发现了同样的现象。NgR作为Nogo-A的复合受体之一，其没有胞内段，而是通过进一步与P75及LINGO-1作用而激活功能，LINGO-1胞内段有酪氨酸磷酸化位点，可通过上调RhoA，从而使生长锥塌陷，轴突再生受阻。所以通过下调NgR或LINGO-1，其最后的功能都是一致的，这也进一步说明了NgR/P75/LINGO-1或NgR/P75/LINGO-1复合受体存在的客观性及功能的连续性。

实验没有进一步检测LINGO-1影响神经元突起生长及脊髓神经干细胞增殖所可能涉及的通路，这也是下一步所努力的方向。明确LINGO-1在脊髓神经干细胞分化过程中的表达特征及其对脊髓神经干细胞生长及神经突起生长等方面的影响可以使研究者更加广泛了解LINGO-1的生物学功能，也为进一步促进脊髓损伤后神经修复提供可能的作用靶点，为治疗脊髓损伤带来更多的希望。

LINGO-1在脊髓神经干细胞分化过程中的表达特征及效应

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