脐带间充质干细胞移植急性脑创伤大鼠损伤区域微血管密度的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.012

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (33): 5320-5324.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.012

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脐带间充质干细胞移植急性脑创伤大鼠损伤区域微血管密度的变化

徐海环^1，2，董化江¹，商崇智³，赵明亮³

¹天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津市 300072；²武警后勤学院附属医院皮肤科，天津市 300162；³天津市神经修复重点实验室，天津市 300162

修回日期:2017-06-18 出版日期:2017-11-28 发布日期:2017-12-01
通讯作者: 赵明亮，博士，副主任医师，天津市神经修复重点实验室，天津市 300162；并列通讯作者：董化江，博士，天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津市 300072
作者简介:徐海环，女，1975年生，河北省唐山市人，汉族，天津大学精密仪器与光电子工程学院在读博士，主治医师，讲师，主要从事干细胞应用基础与临床转化方面的研究。
基金资助:
天津市自然科学基金(16JCYBJC27600)

Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation increases microvessel density in surrounding areas of acute traumatic brain injury in rats

Xu Hai-huan^{1, 2}, Dong Hua-jiang¹, Shang Chong-zhi³, Zhao Ming-liang³

¹School of Precise Instrument and Optoelectronic Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China; ²Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Logistics University of People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China; ³Key Laboratory of Neural Repair in Tianjin, Tianjin 300162, China

Revised:2017-06-18 Online:2017-11-28 Published:2017-12-01
Contact: Zhao Ming-liang, M.D., Associate chief physician, Key Laboratory of Neural Repair in Tianjin, Tianjin 300162, China; Dong Hua-jiang, Ph.D.,School of Precise Instrument and Optoelectronic Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China
About author:Xu Hai-huan, Master, Attending physician, Lecturer, School of Precise Instrument and Optoelectronic Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China; Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Logistics University of People's Armed Police Force, Tianjin 300162, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Tianjin, No. 16JCYBJC27600

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
CD31：又称为血小板-内皮细胞黏附分子(Platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)，分子质量为130 ku，其结构属于免疫球蛋白超家族成员，在清除体内老化的中性粒细胞过程中发挥重要作用。CD31存在于血小板、中性粒细胞、单核细胞和某些类型的T细胞表面，以及内皮细胞间紧密连接处，很可能参与白细胞的迁移、血管生成和整合素的激活。在免疫组化中，CD31主要用于评估血管生成。
干细胞对创伤神经的支持与保护机制：①细胞接触与融合：干细胞将有益基因或蛋白通过细胞间接触或融合传递给临近受损神经细胞，发挥其神经营养和支持作用；②细胞因子的营养作用：利用缺血脑组织的裂解液培养间充质干细胞，发现随着时间延长，培养液中脑源性神经营养因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子和类胰岛素生长因子水平均有明显提高。这些营养因子通过刺激和营养局部神经细胞发挥神经营养作用；③免疫调节作用：干细胞可增高免疫细胞分泌抗炎症因子，增加抗炎或免疫耐受调控T细胞亚群的数量；④促新生血管形成作用：干细胞治疗可以通过诱导血管发生进行脑组织修复。

摘要
背景：脐带间充质干细胞是一种多能干细胞，能够减轻损伤区域的炎性反应，促进微血管再生。
目的：探讨脐带间充质干细胞移植对急性颅脑创伤大鼠脑组织微血管密度的影响。
方法：30只SD大鼠采用随机数字法分为3组：对照组(未损伤组)、脑创伤模型组和细胞移植治疗组，每组10只。采用自由落体方法复制颅脑创伤模型，经脑室途径输注脐带间充质干细胞1.5×10⁶个。细胞移植后24 h进行神经损伤评分。细胞移植后14 d，采用免疫组化法检测受损脑组织附近微血管密度。
结果与结论：①与脑创伤模型组比较，细胞移植治疗组微血管密度升高明显(P < 0.05)；②细胞移植治疗组神经损伤评分优于脑创伤模型组(P < 0.05)；③结果表明，脐带间充质干细胞移植治疗急性颅脑创伤大鼠，可有效改善脑损伤区域血管重建，促进受损脑组织神经功能恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-9572-2564(赵明亮)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 脑创伤, 微血管密度, 神经缺损评分, 天津市自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) are a kind of pluripotent stem cells capable of relieving inflammation and edema in injured areas, promoting microvascular regeneration and improving wound healing.
OBJECTIVE: To explore the therapeutic effects of UC-MSCs transplantation on acute traumatic brain injury (TBI) in rats and the effect on microvessel density of the rat brain tissue.
METHODS: Thirty Sprague Dawley rats were randomly divided into three groups, control group, TBI model group and UC-MSCs treatment group (n=10 per group). TBI models were made in the rats by free fall method. US-MSCs (1.5×10⁶) were infused through the cerebral ventricle in the rats. Neurological severity scores were assessed at 24 hours after cell transplantation. The microvessel density in the injured brain tissue was detected using immunohistochemistry method at 14 days after cell transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the TBI model group, the microvessel density value was significantly increased after UC-MSCs transplantation (P < 0.05), and the neurological severity score also became better in the UC-MSCs treatment group (P < 0.05). In summary, UC-MSCs transplantation can effectively improve became vascular remodeling and have a good neuroprotection in acute TBI rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Craniocerebral Trauma, Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

徐海环，董化江，商崇智，赵明亮. 脐带间充质干细胞移植急性脑创伤大鼠损伤区域微血管密度的变化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5320-5324.

Xu Hai-huan, Dong Hua-jiang, Shang Chong-zhi, Zhao Ming-liang. Umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation increases microvessel density in surrounding areas of acute traumatic brain injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5320-5324.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年12月至2016年8月在武警后勤学院附属医院脑研所实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠30只，50周龄，体质量(360±10) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2012-0001。实验大鼠于动物室内分笼饲养，室内温度为(20±3) ℃，湿度为(50±20)%，每日光照12 h，并提供约50 g全营养鼠粮及足量清洁饮水。

1.3.2 主要试剂和仪器 超净工作台(中国苏净集团安泰公司)；1640培养基(美国 Sigma公司)；eclipse E400型荧光显微镜(Nikon公司)；Olympus CX6光学显微镜(BX51T-PHD-J11)；组织切片机(Leica公司)；UltraCULYURE^TM无血清培养基(Lonza，USA)；CD31多克隆抗体(上海易汇生物科技有限公司)；单臂脑立体定向仪(深圳沃德生命科技有些公司KWD life science co.ltd，型号68001)；多功能真彩色细胞图像分析管理系统(美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus)；石蜡切片机(德国莱卡RM2015)。

1.4 实验方法

1.4.1 脐带间充质干细胞的获取　脐带来源于武警后勤学院附属医院，脐带的采集经孕产妇及家属同意并签署知情同意书。脐带去表皮以及血管，取华通氏胶，将华通氏胶剪碎、离心，置入CO₂孵箱内培养，待较多细胞爬出时进行传代培养，细胞活力≥95%，病原菌排查未检出细菌，第2，3代细胞用于以下实验。

1.4.2 脑创伤模型的建立 实验大鼠按随机数字法分为3组：对照组(未损伤组)，脑创伤模型组，细胞移植治疗组，每组10只。采用50 g重锤90 cm高度自由落体撞击，造成闭合性颅脑创伤。经苏木精-伊红染色观察病理学改变确认符合闭合性颅脑创伤的病理表现。

1.4.3 脐带间充质干细胞移植 于造模后24 h经脑室途径行干细胞移植。将大鼠固定在立体定向仪上，脑室坐标为：前囟点为0，右侧旁开1.5 mm，后旁开1.1 mm，深4.5 mm，将脐带间充质干细胞按照细胞总数为1.5×10⁶经脑室途径注射(图1)，细胞总体积为25 μL，5 min注射完毕，缓慢退针，脑创伤模型组注射同体积的生理盐水。

1.4.4 大鼠神经损伤评分(neurological severity scores，NSS) 细胞移植后24 h进行神经损伤评分。评分标准：5分，死亡；4分，无法自发行走，意识减退；3分，向左侧倾斜；2分，行走时向左侧转圈；1分，提尾时向左前肢屈曲；0分，神经功能正常。
1.4.5 CD31免疫组化染色 细胞移植后10 d，取打击组织附近脑组织，PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定，包埋组织块，切片厚度5 μm，脱蜡，入水，将切片浸于二甲苯中5 min×2次、体积分数100%乙醇5 min×2次、体积分数95%乙醇5 min×2次、体积分数90%乙醇5 min×2次、体积分数85%乙醇5 min×2次、体积分数75%乙醇5 min×2次，自来水冲洗，PBS洗2次；体积分数1%甲醇双氧水，室温浸泡10 min，蒸馏水洗1次以消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗5 min×3次；将切片放入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中，在微波炉内微波辐射10 min；待修复液降至室温后，PBS洗5 min×3次；切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。滴加一抗(CD31抗体)4 ℃过夜，PBS洗5 min×3次；滴加生物素化二抗(IgG)，37 ℃ 20 min，PBS洗5 min×3次；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃ 20 min，PBS洗5 min×3次；用二氨基联苯胺显色试剂盒显色，显色6 min后，充分水洗；苏木精复染细胞核1 min，充分水洗，体积分数1%盐酸乙醇分化，体积分数为1%氨水反蓝，充分水洗，经体积分数70%乙醇5 min、体积分数80%乙醇5 min、体积分数90%乙醇5 min×2次、体积分数95%乙醇5 min×2次、体积分数100%乙醇5 min×2次脱水，二甲苯透明5 min×2次，中性树脂封固，选各组阳性和阴性组织相进行×100和×400显微照相，选择有意义的组织相，经登录、编号、采集、分析、读取数据，最后存盘。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠脑组织病理形态；②各组大鼠神经缺损评分；③各组大鼠受损脑组织附近微血管密度变化。

1.6 统计学分析 数据以x(_)±s表示，采用 SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

颅脑创伤发生率在全身创伤中占第2位，但致死率和致残率却位居第一，成为儿童和中青年人群创伤后最主要的死亡原因。随着中国国民经济和道路交通等快速发展，颅脑损伤的发生率也逐年上升，已成为严重的公共卫生问题。颅脑创伤既需要耗费巨额的医疗费用，又造成大量的间接经济损失，给经济社会发展带来沉重的负担^[1-3]。研究表明，应用一些阻断或调节神经递质及受体的药物，就可以对颅脑创伤的治疗产生良好效果^[8-12]。另外对成年哺乳动物的研究发现，受损后的神经元仍然可以保持再生能力，这从根本上改变了人们认为神经损伤不能再生的观念^[13-15]。近年来随着干细胞技术的日臻成熟，其在各方面的研究和应用也展示了令人鼓舞的前景^[1-2]。

间充质干细胞是一类来源于中胚层或神经外胚层的成体干细胞，广泛存在于骨髓、脂肪、羊水、骨骼肌、胎肺、胎肝、脐血和脐带等人体组织中^[4-7]。间充质干细胞可以迁移、聚集在损伤部位发挥作用。体外培养的形态类似纤维母细胞，贴壁生长。在特定的培养条件诱导下，既可分化为中胚层来源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，又可诱导分化为肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞。体外培养时可分泌多种细胞因子，例如肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、纤维母细胞生长因子、缺血诱导因子、血管内皮生长因子、血管生成素、单核细胞趋化蛋白、白细胞介素等，可起到维持机体稳态、抗炎、免疫调节和维持机体内环境稳定的作用^[16-26]。由于间充质干细胞存在广泛且易于分离培养，又因其具有免疫豁免的特点及免疫抑制的能力，为其异体移植提供可能性^[18-19]，现已迅速成为干细胞研究领域的热点，并被广泛应用于干细胞治疗的基础研究领域。

当创伤或者缺血损伤发生后，组织血管结构破坏，引起一系列的病理反应，最终导致组织器官功能损伤。实验采用脐带间充质干细胞治疗颅脑创伤大鼠，发现细胞移植治疗组的脑组织受损程度较脑创伤模型组有所减轻，受损脑组织周围微血管密度较脑创伤模型组明显升高，同时病理切片显示细胞移植治疗组其脑组织微细结构恢复程度、炎性浸润程度较模型组明显改善，同时神经缺损评分优于单纯模型组。但是研究不足之处在于尚不能明确以上现象发生的具体机制，以后课题组将针对以上现象进行深入研究。

研究报道，细胞移植治疗后可通过直接分泌或旁分泌细胞因子进行免疫调节和促进局部缺血组织的血管再生；脑组织损伤后其中重要的病理机制之一是中小毛细血管受损后引起的微循环障碍和血供平衡紊乱，而干细胞可整合受损的血管丛，进而直接分化为新的血管组织，因此研究间充质干细胞移植促进颅脑创伤恢复的生理、病理机制是当前所面临的重大医学课题。当前研究显示间充质干细胞移植后能够分化为内皮细胞参与血管新生^[20-21]；另有文献报道在大鼠静脉移植模型中，注射间充质干细胞后动物内膜增生明显减少，可有效改善移植血管的功能^[22]。实验为今后深入研究间充质干细胞治疗颅脑损伤提供了一定的理论基础，同时也为日后诱导干细胞精准治疗颅脑创伤提出了新的挑战，如何系统检测间充质干细胞在脑组织内归巢的数量、存活状态，如何进一步促进归巢，如何诱导使其靶向分化，如何检测干细胞移植后局部各类微蛋白或调节因子的改变等，下一步课题组将就这些问题进行深入的研究。

脐带间充质干细胞移植急性脑创伤大鼠损伤区域微血管密度的变化

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