大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN诱导脂肪间充质干细胞体外分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.006

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (33): 5280-5286.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.006

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大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN诱导脂肪间充质干细胞体外分化

陈尚雅^1，2，崔冠群³，薄存香²，张玉²，张恩国^2，4，杨叶^2，4，杜忠君^1，2，邵华^1，2

¹山东中医药大学，山东省济南市 250355；²山东省职业卫生与职业病防治研究院，山东省济南市 250062；³山东大学齐鲁儿童医院呼吸内科，山东省济南市 250022；⁴济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东省济南市 250062

修回日期:2017-06-23 出版日期:2017-11-28 发布日期:2017-12-01
通讯作者: 通讯作者：邵华，博士，研究员，山东中医药大学，山东省济南市 250355；山东省职业卫生与职业病防治研究院，山东省济南市 250062 并列通讯作者：杜忠君，博士，助理研究员，山东中医药大学，山东省济南市 250355；山东省职业卫生与职业病防治研究院，山东省济南市 250062
作者简介:陈尚雅，女，1989年生，山东省济南市人，汉族，山东中医药大学2015级博士研究生，主要从事干细胞分化与旁分泌机制相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81470145，81602893)；山东省自然科学基金(ZR2015YL049)；山东省医药卫生科技发展计划(2016WS0540)；山东省医学科学院创新工程

In vitro differentiation of rat adipose-derived mesenchymal stem cells induced by rat lung epithelial-T-antigen negative cell line

Chen Shang-ya^{1, 2}, Cui Guan-qun³, Bo Cun-xiang², Zhang Yu², Zhang En-guo^{2, 4}, Yang Ye^{2, 4}, Du Zhong-jun^{1, 2}, Shao Hua^{1, 2}

¹Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; ²Shandong Academy of Occupational Health and Occupational Medicine, Jinan 250062, Shandong Province, China; ³Department of Respiration, Qilu Children’s Hospital of Shandong University, Jinan 250022, Shandong Province, China;⁴School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Science, Jinan 250062, Shandong Province, China

Revised:2017-06-23 Online:2017-11-28 Published:2017-12-01
Contact: Shao Hua, M.D., Investigator, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; Shandong Academy of Occupational Health and Occupational Medicine, Jinan 250062, Shandong Province, China;Du Zhong-jun, M.D., Assistant researcher, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; Shandong Academy of Occupational Health and Occupational Medicine, Jinan 250062, Shandong Province, China
About author:Chen Shang-ya, Doctoral candidate in Grade 2015, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China; Shandong Academy of Occupational Health and Occupational Medicine, Jinan 250062, Shandong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81470145, 81602893; the Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2015YL049; the Medical and Health Science and Technology Development Plan, No. 2016WS0540; the Innovation Engineering of Shandong Academy of Medical Sciences

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
共培养：将2种或者2种以上的细胞共同培养于同一环境中，以更好地模拟体内环境，可分为直接共培养、间接共培养两种方式。Transwell共培养实验，即2种细胞非接触共培养，观察一种细胞对另一种细胞的影响。将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层以聚碳酸酯膜相隔。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
肺泡上皮细胞：分为肺泡Ⅰ型上皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞。肺泡表面主要由肺泡Ⅰ型上皮细胞组成，其功能是负责气体交换、构成“气血屏障”；肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺泡Ⅰ型上皮细胞的祖细胞，可分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞，同时分泌肺泡表面活性物质，降低肺泡表面张力，维持肺泡结构和功能的稳定。

摘要
背景：研究表明，骨髓间充质干细胞具有在体外分化为肺泡上皮细胞的可能性，但至今未见脂肪间充质干细胞与肺泡上皮细胞通过长时间Transwell共培养，诱导脂肪间充质干细胞分化的相关报道。
目的：观察大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞的可行性。
方法：取3只SPF级健康雌性SD大鼠作为供体，分离、提取、培养、鉴定脂肪间充质干细胞。实验分2组：实验组(脂肪间充质干细胞与大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN进行Transwell共培养)和对照组(脂肪间充质干细胞单独培养)。共培养第21天，倒置显微镜观察各组脂肪间充质干细胞的形态变化，对脂肪间充质干细胞进行SP-C免疫荧光染色，荧光显微镜下观察蛋白表达并拍照，采用Image pro plus 6.0软件分析荧光表达的积分吸光度值。
结果与结论：①共培养21 d，实验组的脂肪间充质干细胞形态由长梭形、成纤维细胞样，逐渐转化为卵圆形、多边形，对照组脂肪间充质干细胞形态保持成纤维细胞样；②荧光显微镜下观察，实验组脂肪间充质干细胞可见红色荧光表达，对照组无红色荧光表达，实验组的荧光表达较对照组增强(P < 0.05)；③结果表明，大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN能够在长时间(21 d)共培养条件下，诱导脂肪间充质干细胞分化为肺泡上皮细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7445-6698(杜忠君)；0000-0002-3580-6384(邵华)

关键词: 干细胞, 脂肪肝细胞, 脂肪间充质干细胞, 肺泡上皮细胞, RLE-6TN, 共培养, Transwell, 细胞分化, 大鼠, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that bone marrow mesenchymal stem cells have the potential of differentiation into alveolar epithelial cells in vitro, but so far no study has indicated that adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) can be differentiated into alveolar epithelial cells through long-term Transwell co-culture.
OBJECTIVE: To observe whether rat lung epithelial-T-antigen negative cell lines (RLE-6TN) can induce rat ADSCs to differentiate into type II alveolar epithelial cells by long-term Transwell co-culture.
METHODS: Three SPF health female Sprague-Dawley rats were used as donors to separate, extract, culture and identity ADSCs. The experimental group was subjected to the Transwell co-culture of ADSCs and RLE-6TN, while the control group was subjected to the culture of ADSCs alone. The morphological changes of ADSCs were observed by the inverted phase contrast microscope at 21 days after co-culture. Immunofluorescence staining using surfactant protein C (SP-C) was performed on the co-cultured ADSCs. The fluorescence staining was observed using the inverted fluorescence microscope. Integral optical density (IOD) analysis was conducted by Image pro plus 6.0 software.
RESULTS AND CONCLUSION: RLE-6TN cells were identified by fluorescence staining with stable expression of SP-C protein (red fluorescence) in the experimental group, and there was no red fluorescence in the control group. After 21-day co-culture, the cell shape in the experimental group was transformed from the long spindle shape into oval or polygon shape gradually, while the cell shape in the control group remained fibroblast-like. These results show that RLE-6TN can induce ADSCs to differentiate into type II alveolar epithelial cells after a long-term (21 days) co-culture.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Pulmonary Alveoli, Epithelial Cells, Coculture Techniques, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈尚雅，崔冠群，薄存香，张玉，张恩国，杨叶，杜忠君，邵华. 大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN诱导脂肪间充质干细胞体外分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5280-5286.

Chen Shang-ya, Cui Guan-qun, Bo Cun-xiang, Zhang Yu, Zhang En-guo, Yang Ye, Du Zhong-jun, Shao Hua. In vitro differentiation of rat adipose-derived mesenchymal stem cells induced by rat lung epithelial-T-antigen negative cell line[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5280-5286.

图/表（结果） 1

2.1 脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定结果 原代细胞提取后，接种至培养瓶中，贴壁细胞主要为梭形、纺锤形，部分为多角形或卵圆形；第2天换液后，大部分贴壁细胞为长梭形、成纤维细胞样；至第4，5天细胞密度达到80%-90%，进行胰酶消化、传代。传至第3代时，细胞呈长梭形，分布均匀，密度达到100%时呈漩涡样、菊花样聚集，见图1。随传代次数升高，杂细胞数量明显降低，脂肪间充质干细胞增殖速度逐渐下降。

流式细胞术检测结果表明，第4代脂肪间充质干细胞CD90、CD73表达阳性(阳性率分别为99.6%和99.2%)，CD45、CD11b表达阴性(阳性率分别为0.3%和3.6%)，见图2；脂肪间充质干细胞成脂、成骨、成软骨分化成功，见图3，证实为间充质干细胞。

2.2 RLE-6TN的培养、鉴定结果 RLE-6TN是肺泡Ⅱ型上皮细胞，培养液选用与脂肪间充质干细胞一致的完全培养基，约48 h可铺满瓶底。培养至第3代时，倒置显微镜下观察，细胞呈卵圆形、多角形(图4A)；免疫荧光染色后，荧光显微镜下观察，细胞核呈蓝色荧光表达，细胞呈SP-C蛋白红色荧光表达(图4B)。

2.3 脂肪间充质干细胞共培养后形态变化 共培养48 h后，各小室细胞密度达到80%以上。21 d后，对照组脂肪间充质干细胞无形态改变，仍为长梭形、成纤维细胞样生长，实验组部分脂肪间充质干细胞形态开始向不规则细胞转化，部分变圆、多角形，见图5。

2.4 荧光显微镜观察脂肪间充质干细胞荧光表达 共培养21d后，将各组脂肪间充质干细胞进行DAPI细胞核染色和SP-C蛋白的免疫荧光染色，荧光显微镜下观察。实验组可见红色荧光的SP-C蛋白表达，对照组均不见红色荧光表达，见图6。

采用Image pro plus 6.0软件，对每张图片进行吸光度矫正后，分析各图红色荧光区域的积分吸光度值。统计结果显示，实验组的积分吸光度值明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

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引言

间充质干细胞是存在于多种组织中具有自我更新和分化能力的一小部分细胞，根据来源可分为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞等。间充质干细胞可分化为脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、神经细胞和内皮细胞等多种组织细胞类型，还可感知损伤信号，迁移至损伤区，发挥修复和再生的能力，具有较强的免疫调节功能，自体移植无免疫排斥反应。除此之外，间充质干细胞具有旁分泌功能，可生成多种细胞因子，促进血管再生及损伤修复^[1]。研究表明，当机体组织受损，外源性间充质干细胞通过受体和配体表达的一些化学物质，可以迁移到受损伤部位^[2]，这种迁移能力是间充质干细胞修复损伤组织的前提。

目前，干细胞疗法已用于矽肺实验模型中，此疗法对改善肺功能、减轻炎症和纤维化均具有较好的疗效。Liu等^[3]将肝细胞生长因子修饰的自体骨髓间充质干细胞回输给矽肺患者，每周1次，持续3周，并随访12个月，CT可见局部病灶吸收，症状缓解。但是对于移植干细胞减缓炎症、对抗纤维化的机制还没有定论。一种假说认为干细胞可替代Ⅱ型肺泡上皮细胞，发挥促进受损肺泡细胞增殖、再生和修复功能；另一种认为干细胞改变受损部位微环境^[4-8]。干细胞移植有可能成为矽肺病的新曙光。

脂肪间充质干细胞取材便利，在间充质干细胞研究领域应用广泛，与骨髓间充质干细胞一样具有自我更新能力、多向分化潜能、无免疫排斥、成瘤性低等优点，目前已被应用于组织工程与再生医学领域，显示出良好的效果；在临床应用方面，脂肪间充质干细胞相对于骨髓间充质干细胞，具有取材操作更简便、患者接受度更高的优势，避免患者对于抽取骨髓的畏惧心理，有利于干细胞疗法的普及。实验探讨肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN诱导大鼠脂肪间充质干细胞分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞的可行性，为研究脂肪间充质干细胞治疗矽肺的机制提供理论依据和数据支持。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年7至12月在山东省职业卫生与职业病防治研究院毒理实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级健康雌性SD大鼠3只，7周龄，体质量180-220 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物实用许可证号：SCXK(京)2012-0001。大鼠饲养条件符合GB14925-2010《实验动物环境及设施》要求，温度20-26 ℃，相对湿度40%-70%，噪声<60 dB，空气清洁度7级，工作照度>200 Lux，昼夜明暗交替时间12 h。采用SPF级SD大鼠专用饲料喂养，自由采食和饮水。实验经山东省医学科学院实验动物伦理委员会批准。

1.3.2 试剂和仪器 PBS、青链霉素、胎牛血清、低糖DMEM培养液以及成脂、成骨、成软骨分化培养基购于美国Gibco公司；抗SP-C抗体、Alexa Fluor 594标记驴抗兔Ig G二抗购于美国Abcam公司；茜素红染色液、DAPI染色液、抗荧光衰减封固剂购于北京索莱宝科技有限公司；牛血清白蛋白、Ⅳ型胶原酶、油红干粉、甲苯胺蓝染色液购于美国Sigma公司；Transwell培养板(含有聚碳酸脂膜)购于美国Corning公司；IX53荧光显微镜、DP73光学显微镜购于日本Olympus公司；RLE-6TN细胞购于中南大学高等研究中心。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定 将大鼠颈椎脱臼处死，置于体积分数为75%乙醇浸泡5 min，无菌取大鼠腹股沟脂肪垫，PBS+10%双抗冲洗3次，置于干燥培养皿内剪碎，Ⅳ型胶原酶37 ℃消化1 h，1 000 r/min离心10 min后，弃去上清，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，1 000 r/min离心5 min，完全培养基重悬，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，接种至培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱培养。24 h后全量更换培养液，之后每2 d换液1次。细胞密度达到80%后进行传代：PBS冲洗2次，0.25%胰蛋白酶消化，镜下观察细胞形态变圆后，加入完全培养基终止消化并收集细胞， 1 000 r/min离心5 min，以1∶2比例进行传代，取第4代细胞进行以下实验。培养期间，倒置显微镜观察脂肪间充质干细胞形态。

根据国际干细胞研究学会(International Society for Stem Cell Research，ISSCR)对间充质干细胞鉴定标准的规定^[9]，采用三系分化和流式细胞术鉴定方法。细胞传至第4代时，接种至12孔板中并分为成脂组、成骨组、成软骨组，每组4个孔。每2 d换液1次。待细胞密度达到80%时，PBS冲洗2次，更换成脂、成骨、成软骨分化培养基培养，每2 d换液1次。分化培养14 d后，弃去培养液，PBS冲洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次。成脂组采用油红染色法，成骨组采用茜素红染色法，成软骨组采用甲苯胺蓝染色法，染色30 min后，蒸馏水冲洗3次，置于倒置显微镜下观察。

脂肪间充质干细胞传至第4代时，用PBS调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，分别加入CD73、CD90、CD11b、CD45单克隆抗体，4 ℃孵育30 min，PBS洗涤3次，加入各自对应的PE和FITC标记的二抗，避光孵育30 min；同时采用同型对照去除抗体非特异性结合的影响。流式细胞仪检测细胞表面分子的表达，相应的阳性表达率由流式细胞仪专用软件直接计算生成。根据ISSCR规定，间充质干细胞表现为CD73和CD90表达阳性(阳性表达率> 80.0%)，同时CD11b、CD45表达阴性(阴性表达率< 5.0%)。

1.4.2 RLE-6TN的培养及鉴定 RLE-6TN是大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系。采用与脂肪间充质干细胞相同的完全培养基，对RLE-6TN细胞进行常规培养、传代，培养过程中，倒置显微镜下观察细胞形态。以兔抗大鼠SP-C抗体孵育后，采用Alexa Fluor 594标记驴抗兔IgG二抗(滴度为1∶200)免疫荧光染色进行鉴定。

1.4.3 共培养实验分组 设置实验组(RLE-6TN与脂肪间充质干细胞共培养)、对照组(脂肪间充质干细胞单独培养)，各组均将细胞浓度为5×10⁷ L^-¹的第4代脂肪间充质干细胞接种于含有爬片的Transwell共培养室的下室，实验组接种细胞浓度为5×10⁷ L^-¹的第4代RLE-6TN细胞于0.4 μm孔径的聚碳酸脂膜上，即Transwell共培养室的上室；于37 ℃、体积分数为5%的CO₂培养箱中培养，每隔2 d换液1次，共培养21 d，用倒置显微镜观察各组脂肪间充质干细胞的形态学变化。

1.4.4 荧光显微镜观察SP-C蛋白表达 共培养第21天，将培养板下室的爬片取出，以40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min，PBS洗涤3次，加入5%的BSA封闭30 min，洗涤后加入以1.0% BSA稀释的兔抗大鼠SP-C抗体(滴度为1∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤后加入Alexa Fluor594标记的驴抗兔IgG(滴度为1∶200)，室温避光放置2 h，以PBS充分洗涤后每孔加入DAPI染色液约600 μL，室温避光孵育5 min；PBS充分洗涤，每孔加入600 μL抗荧光衰减封固剂封固，荧光显微镜下观察SP-C蛋白的荧光表达情况，并拍照。

1.4.5 SP-C蛋白相对表达水平分析 每个爬片在40倍物镜下随机选择5个不重叠的视野，每个视野放大至200倍后观察并拍照。采用Image-pro plus 6.0图像分析软件，计算每个视野的SP-C蛋白荧光的积分吸光度值，作为蛋白的相对表达水平。积分吸光度为每个阳性区域的吸光度值与其对应的面积相乘后再求和，即积分吸光度=∑(吸光度×面积)^[10]。

1.5 主要观察指标 ①共培养后脂肪间充质干细胞的形态变化；②共培养后脂肪间充质干细胞的SP-C蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS20.0软件对各组积分吸光度值进行统计分析。计量资料经正态性检验不服从正态分布，采用中位数(M)和四分位数间距(Q)进行描述。析因设计资料采用两因素非参数方差分析Scheirer-Ray-Hare检验，检验标准α=0.05^[11]。

讨论

矽肺是尘肺病最为常见的一种类型，其病理改变为矽结节形成和广泛的肺纤维化，病程不可逆，尚无特效治疗药物^[12-13]。据统计，2014年中国共报道职业病29 972例，其中职业性尘肺病26 873例，占当年职业病发病总数的90%以上^[14]。近年来，干细胞研究逐渐兴起，尤其在糖尿病、视网膜病变、骨关节病变等疾病中研究广泛，但在职业病领域，间充质干细胞治疗矽肺的研究起步较晚，基础研究和临床研究较为缺乏。

在矽肺动物模型实验中，研究者通过免疫荧光双标技术检测性别决定基因(sry)和SP-C示踪的雄性大鼠骨髓间充质干细胞在雌性染矽尘大鼠模型中的分布和分化情况，骨髓间充质干细胞干预组雌性大鼠肺组织中有sry阳性细胞，并且部分sry阳性细胞同时表达SP-C，说明骨髓间充质干细胞可能在染矽尘大鼠体内分化为Ⅱ型肺泡上皮细胞，该机制可能是骨髓间充质干细胞治疗矽肺的机制之一^[15]。翁泽平等^[16]通过pcDNA3.1-HGF转染骨髓间充质干细胞，与单独应用骨髓间充质干细胞比较，转染后的骨髓间充质干细胞能够更有效地对抗肺泡炎症和早期肺纤维化，其作用机制可能与减轻肺泡炎症反应有关。Liu等^[3]研究者从矽肺患者体内采集骨髓间充质干细胞，将载有肝细胞生长因子的cDNA采用质粒转染和脂质体转染的不同方式转入骨髓间充质干细胞，选取2×10⁶/kg和5×10⁷/人的不同剂量，通过静脉滴注的方式，自体回输给矽肺患者，每周1次，连续3周，治疗后检测肺功能、X射线胸片、CT、外周血淋巴细胞和血清IgG浓度等指标。结果表明，咳嗽、胸闷等症状在治疗后6-12个月逐步改善，用力肺活量从治疗前平均水平(71.2±17.0)%提高到(84.0±10.9)%，第1秒末用力呼气量从治疗前平均水平(67.5±17.7)%提高到(80.6± 14.9)%，且血清中铜蓝蛋白和IgG较治疗前明显下降；患者外周血CD4⁺与CD8⁺比值上升，CT结果显示肺部结节和网状阴影在随访过程中部分吸收。以上研究结果表明，基于归巢原理和避免免疫排斥的优势，干细胞对矽肺具有一定的治疗效果，其机制可能与局部分化、改善微环境、减轻炎症等方面有关。

肺泡上皮细胞分为肺泡Ⅰ型上皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞。肺泡表面主要由肺泡Ⅰ型上皮细胞组成，其功能是负责气体交换、构成“气血屏障”；肺泡Ⅱ型上皮细胞是肺泡Ⅰ型上皮细胞的祖细胞，可分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞，同时可分泌肺泡表面活性物质，降低肺泡表面张力，维持肺泡结构和功能的稳定^[17-19]。

肺泡表面活性蛋白分为SP-A、SP-B、SP-C、SP-D 4种，其中SP-C特异性地分布在肺泡Ⅱ型上皮细胞的磷脂双分子层中，对促进肺泡表面活性物质单分子层结构有重要作用，参与肺泡表面活性物质的代谢，增强肺泡Ⅱ型上皮细胞对磷脂的吸收，从而降低肺泡表面张力，增加肺顺应性。SP-C仅表达于肺泡Ⅱ型上皮细胞表面，常用于鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞。当二氧化硅粉尘进入体内后，粉尘作用于巨噬细胞，促使巨噬细胞吞噬粉尘，并分泌转化生长因子β等细胞因子和炎症因子，刺激肺泡上皮细胞从而造成损伤；同时，粉尘可直接作用于肺泡上皮细胞，促使肺泡上皮细胞水肿、凋亡和坏死脱落，以及促使肺泡上皮细胞转化为间质细胞，进而加快纤维化的进程。研究表明，肺纤维化早期，肺泡Ⅱ型上皮细胞的PDGF mRNA表达量明显增加，且二氧化硅微粒中的痕量铁元素，可通过生成自由基从而与微粒表面的羟基活性基团作用，使肺泡Ⅰ型上皮细胞的细胞膜上多聚不饱和脂肪酸过氧化，从而造成肺泡Ⅰ型上皮细胞损伤^[20]。当矽尘导致肺泡Ⅰ型上皮细胞损伤超过肺泡Ⅱ型上皮细胞修复能力时，肺泡上皮大量破坏，肺间质暴露，成纤维细胞受细胞因子、炎症因子刺激，向肌成纤维细胞转化，间质沉积，最终导致矽结节的出现和纤维化的发生。

间充质干细胞治疗矽肺纤维化的机制可能包括归巢后的分化作用、对微环境的改变等方面^[21-26]。间充质干细胞归巢后，可能通过分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞，提高肺泡Ⅱ型上皮细胞对肺泡Ⅰ型上皮细胞的修复能力和分泌功能，对抗矽尘造成的肺泡损伤，从而发挥治疗作用。研究细胞之间的相互作用机制可用共培养的方法，通过限制培养小室聚酯碳酸膜的孔径，使细胞分泌物如外泌体、细胞因子等可通过，而细胞不能通过，从而观察、检测一种细胞对另一种细胞的作用^[27-30]。国内外研究表明，共培养方式对干细胞分化有不同程度的影响，加入相关细胞因子可诱导改变分化方向^[31-38]。陈寅等^[39]采用无血清小气道生长液和改良无血清小气道生长液，将人骨髓间充质干细胞与人胚肺间质细胞(MRC-5)共培养8 d，通过检测SP-C蛋白表达量，发现 MRC-5能够在体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞。王艳等^[40]采用Transwell共培养方式，将小鼠损伤肺组织细胞、正常肺组织细胞分别与小鼠骨髓间充质干细胞共培养8 d，通过免疫荧光法，检测SP-C蛋白的荧光强度，发现损伤肺组织细胞能够将骨髓间充质干细胞转分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞。燕玲等^[41]研究表明，染矽尘大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞与健康大鼠骨髓间充质干细胞共培养后，对骨髓间充质干细胞进行水通道蛋白5和SP-C免疫荧光双重染色，激光共聚焦显微镜下观察发现，共培养第4天和第8天，实验组骨髓间充质干细胞2种蛋白荧光的积分吸光度值均较同时间点对照组增强，说明染矽尘大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞能够体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞。鉴于观察间充质干细胞分化情况的实验较多采用21 d长时间诱导^[42-43]，本实验通过长时间(21 d) Transwell共培养方式，观察脂肪间充质干细胞体外分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞的情况，采用免疫荧光法，在倒置荧光显微镜下观察SP-C蛋白的荧光染色强度并拍照，图片经过吸光度矫正后，通过计算荧光强度的积分吸光度值进行组间比较。积分吸光度包含了吸光度和荧光面积两大因素，可以从发光强度和发光面积2个方面评价荧光强度，相对于平均吸光度具有更高的可信度。结果表明，共培养21 d后，实验组脂肪间充质干细胞在RLE-6TN干预下，可部分分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞，表达SP-C；对照组无SP-C表达，差异有显著性意义(P < 0.05)。

实验通过长时间共培养方式，体外细胞实验验证了脂肪间充质干细胞体外分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞的可能性，但转化效率低，且耗时较长。在矽肺发病过程中，肺泡上皮细胞长期处于矽尘和多种细胞因子的刺激中，其微环境状态与正常肺组织不同。作者将建立矽肺体外模型，探索脂肪间充质干细胞在损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞的作用下，向肺泡Ⅱ型上皮细胞分化的可能性，进一步阐明间充质干细胞治疗矽肺的机制，为间充质干细胞的临床研究提供理论基础和数据支持。

大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞系RLE-6TN诱导脂肪间充质干细胞体外分化

In vitro differentiation of rat adipose-derived mesenchymal stem cells induced by rat lung epithelial-T-antigen negative cell line

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