骨髓间充质干细胞体外分化过程中复方接骨片和壮骨片含药血清的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.003

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
含药血清：中药血清药理学是为了研究中药复方制剂而诞生的一种新的体外实验方法，即将受试药物经口给予动物后以含药血清代替中药粗提物作为药物源加入体外反应系统中研究其药理作用，因此目前多数学者认为血清药理学方法可以较客观地反映中药的药效。
细胞分化：是程序控制的有序有规律过程，其结果除取决于细胞在基因表达上的时空差异，还受细胞外环境的影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。近年来，含药血清实验方法引起越来越多研究者的重视。通过天然中药、中药提取物及中药复方干预骨髓间充质干细胞增殖分化，运用中药血清药理学手段，从分子、细胞、基因水平角度研究中药的作用及作用机制，使骨髓间充质干细胞向更宽、更广领域参与骨代谢疾病、骨缺损、骨折不愈合及迟缓愈合等各类疾病的治疗，充分发挥其临床应用价值。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一种具有多向分化潜能的干细胞，当受到含药血清作用时，其所涉及的多条信号通路上的基因表达会发生改变。
目的：考察复方接骨片和壮骨片含药血清在骨髓间充质干细胞体外分化过程中的作用。
方法：取60只SD大鼠，随机分为复方接骨片组、壮骨片组、两药联用组和空白对照组，制备含药血清。分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，于培养瓶中加入不同的含药血清，培养24 h后，RT-PCR法检测BMP-2、Runx2、VEGF及Akt mRNA的表达，Western blot法检测BMP-2、Runx2、VEGF及Akt蛋白的表达。
结果与结论：①与对照组比较，复方接骨片组及两药联用组Akt和VEGF mRNA及蛋白的表达明显升高(P < 0.05或P < 0.01)；②壮骨片组与对照组相比，Akt和VEGF mRNA及蛋白表达差异无显著性意义(P > 0.05)；③与对照组比较，复方接骨片组BMP-2和Runx2 mRNA及蛋白表达升高(P < 0.05)；④与对照组相比，壮骨片组及两药联用组BMP-2及Runx2 mRNA及蛋白表达均显著增加(P < 0.01)；⑤结果表明，复方接骨片及壮骨片含药血清可在骨髓间充质干细胞体外分化通路中起到协同促进骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞及成骨细胞分化的作用。

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ORCID: 0000-0003-3357-1523(邬波)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 复方接骨片, 壮骨片, 骨髓间充质干细胞, 含药血清, 骨形态发生蛋白, 血管内皮生长因子, 体外分化通路

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are a kind of pluripotent stem cells in the bone marrow. Drug-containing serum treatment may be followed by a variation in the expression of genes involved in multiple signaling pathways.
OBJECTIVE: To study the effect of compound Jiegu Tablets and Zhuanggu Tablets on the differentiation of BMSCs in vitro.
METHODS: Sixty Sprague-Dawley rats were randomized into Jiegu group, Zhuanggu group, combined group and blank control group. Different drug-containing sera were prepared and used to culture BMSCs isolated from the rat bone marrow. RT-PCR and western blot assay were used to detect the expression of BMP-2, Runx2, VEGF and Akt at mRNA and protein levels, respectively, at 24 hours after culture.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, the expression levels of Akt and VEGF mRNA and protein were significantly increased in the Jiegu group and combined group (P < 0.05 or P < 0.01), but showed no difference in the Zhuanggu group (P > 0.05). Compared with the blank control group, the expression levels of BMP-2 and Runx2 mRNA and protein were significantly increased in the Jiegu group (P < 0.05) and very significantly increased in the Zhuanggu group and combined group (P < 0.01). These findings indicate that compound Jiegu Tablets and Zhuanggu Tablets containing sera lead to synergistic effects on theBMSCs differentiation into vascular endothelial cells and osteoblasts in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation, Serum, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年5月至2016年1月在沈阳市骨科医院所属辽宁省骨关节病重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4周龄SPF级SD大鼠18只，体质量90-120 g，用于骨髓间充质干细胞的分离培养；成年SPF级SD大鼠60只，体质量180-220 g，用于含药血清的制备，均购自辽宁长生生物技术有限公司。

1.3.2 药品与试剂 Solabio特种胎牛血清(Solarbio科技有限公司)；四季青特种胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、抗小鼠β-Actin单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔抗鼠BMP-2多克隆抗体(Proteintech公司)；兔抗鼠Runx2多克隆抗体、兔抗鼠VEGF多克隆抗体及兔抗鼠Akt多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；Trizol试剂(GIBCO公司)；DMEM/F12(1︰1)(Invitrogen公司)；复方接骨片(自然铜、土鳖虫、地龙、桑白皮、骨碎补、续断等，沈阳市骨科医院药厂)、壮骨片(三七、当归、枸杞、红参、续断、熟地黄、鹿茸等，沈阳市骨科医院药厂)。

1.4 实验方法

1.4.1 含药血清的制备 成年SPF级SD大鼠60只，随机分为复方接骨片组、壮骨片组、复方接骨片+壮骨片联用组(两药联用组)和空白对照组，每组15只。复方接骨片、壮骨片分别按大鼠体质量转换系数折算为SD大鼠等效剂量，按中医传统方法煎制，灌胃剂量1.5 mL/(只• d)。各组分别给予复方接骨片提取液、壮骨片提取液及复方接骨片和壮骨片混合提取液(每种提取液各取一半剂量)，对照组给予等量蒸馏水，连续10 d。末次灌胃后2 h，无菌条件下开胸取血，分离血清，56 ℃水浴灭活30 min，经0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装，-20 ℃保存。

1.4.2 骨髓间充质干细胞的分离培养 取4周龄SPF级SD大鼠双侧股骨及胫骨，剪去两端骨骺，用5 mL无菌注射器吸取DMEM培养基(或D-Hank’s液)，反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液，制成细胞悬液。将细胞悬液缓慢加于淋巴细胞分离液液面之上，2 000×g离心20 min，取中间乳白膜层，3 000 r/min离心10 min，去上清，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮细胞，调整细胞浓度至2×10⁹ L^-¹，接种于25 cm²培养瓶中，于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度条件下培养。2 d后半量更换培养液，细胞生长达90%融合后，按1︰2比例传代(图1)。

1.4.3 骨髓间充质干细胞的鉴定 取传至第2代的骨髓间充质干细胞，分别加入荧光标记的CD44、CD45、CD90抗体，避光孵育30 min，上流式细胞仪检测。

1.4.4 MTT法筛选最佳含药血清体积分数 取第3代骨髓间充质干细胞制备单细胞悬液，接种于96孔板，5.0×10³/孔，培养24 h后更换含药血清培养液。实验分组：复方接骨片组、壮骨片组、复方接骨片+壮骨片联用组(两药联用组)和空白对照组。空白对照组加入正常大鼠血清，其余3组加入相对应的药物血清。每组均设3个药物血清体积分数：5%，10%，15%，每个体积分数设8个复孔。分别在培养48，96 h后进行MTT检测，于570 nm波长处测定吸光度值。

1.4.5 RT-PCR法检测BMP-2、Runx2、VEGF及Akt mRNA的表达 骨髓间充质干细胞传代至第3代时，对照组加入含体积分数为10%正常大鼠血清的培养液，复方接骨片组、壮骨片组、两药联用组分别加入含体积分数为10%相对应含药血清的培养液，培养24 h后向各组细胞中加入Trizol试剂提取细胞总RNA，反转录成cDNA。以合成的cDNA为模板，分别加入相应引物(表1)进行PCR扩增，并以β-Actin作为内参，采用Image-pro plus软件通过灰度值分析，检测各组细胞因子BMP-2、Runx2、VEGF及Akt mRNA的表达。

1.4.6 Western blot法检测BMP-2、Runx2、VEGF及Akt蛋白的表达 骨髓间充质干细胞传代至第3代时，对照组加入含体积分数为10%正常大鼠血清的培养液，复方接骨片组、壮骨片组、两药联用组分别加入含体积分数为10%相对应含药血清的培养液，培养24 h后向各组细胞中加入裂解液，于4 ℃离心，吸出上清，调整各标本蛋白浓度一致，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；在水浴式转印槽中转膜，将硝酸纤维素膜封闭，分别加入相应抗体，4 ℃孵育过夜；然后以TBS洗膜，将膜置于辣根过氧化物酶标记的二抗中，室温孵育2 h，再洗膜、DAB显色，用自动凝胶成像分析系统成像，采用Image-pro plus软件通过灰度值分析，检测BMP-2、Runx2、VEGF及Akt相关蛋白的表达。

1.5 主要观察指标 ①倒置相差显微镜下观察细胞形态；②MTT法筛选最佳含药血清体积分数；③RT-PCR及Western blot法检测BMP-2、Runx2、VEGF、Akt的mRNA和蛋白表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS19.0统计软件进行数据处理。各组数据以x(_)±s表示，计量资料采用单因素方差分析和t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

成骨细胞的分化成熟是骨形成的前提，并受多种因素的调控^[17-20]。BMPs是一类生长分化因子家族，其中BMP-2具有较强的诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力，是用于骨骼再生最有效的骨诱导蛋白^[21-23]。作为BMP-2的靶基因，Runx2主要参与成骨分化的早期调控，BMP-2与Runx2通过协同方式对成骨细胞分化起着重要的作用。Runx2提供BMP-2激活所必需的因子，而BMP-2则可增强Runx2的依赖性转录，BMP-2/Runx2轴调控成骨细胞分化^[24-25]。

骨折愈合是一个独立的再生过程，血管生成在骨折愈合过程中占据主要作用^[26-27]。VEGF也称血管渗透因子，与血管内皮细胞表面受体结合后，促进内皮细胞增殖，增加血管通透性，进而促进新生血管的形成^[28-30]。VEGF/Akt信号转导通路可促进血管内皮异常生成，Akt通过反式作用于VEGF基因启动子，促进VEGF的表达，进而刺激血管生成。在血管生成过程中，无血管的软骨组织逐渐转变为有血管的骨组织，对软骨内成骨起到主要作用^[31-33]。因此，VEGF可通过诱发新生血管的形成，促进骨折愈合。

实验结果表明，复方接骨片组及两药联用组均能够提高骨髓间充质干细胞中Akt和VEGF的mRNA及蛋白表达，提示复方接骨片含药血清的作用机制可能是通过影响Akt和VEGF的mRNA及蛋白表达，促进骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化，诱发新生血管形成，进而促进骨折愈合。另外，与对照组比较，复方接骨片组BMP-2和Runx2 mRNA及蛋白表达也明显升高(P < 0.05)，提示复方接骨片含药血清也可通过BMP-2/Runx2通路促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，这与实验室的前期研究结果复方接骨片含药血清能有效拮抗BMP-2 siRNA对骨髓间充质干细胞体外增殖及分化的抑制作用一致^[34]。而壮骨片组及两药联用组与对照组相比，BMP-2及Runx2 mRNA及蛋白表达均显著增加(均P < 0.01)，且效果优于复方接骨片组，表明壮骨片含药血清诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力要优于复方接骨片含药血清，但其促进新生血管形成能力不及复方接骨片含药血清。而两药联用组，在Akt/VEFG及BMP-2/Runx2通路上，皆有促进其mRNA及蛋白表达的能力，因此，复方接骨片及壮

骨片含药血清可在骨髓间充质干细胞体外分化通路中起到协同促进骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞及成骨细胞分化的作用。

中医药的用药原则是“辨证施治”，根据病症的不同，按照中医药的配伍理论组药成方用于临床^[35-36]。复方接骨片及壮骨片均为沈阳市骨科医院自主研发的具有50余年历史的传统中药制剂，复方接骨片主要成分包括自然铜、土鳖虫、地龙、桑白皮、骨碎补、续断等，可有效改善血液循环，加快血肿的机化速度，活跃膜内成骨与软骨内成骨，使骨痂出现早，从而达到刺激成骨，促进骨折愈合的目的。壮骨片采用传统中草药三七、当归、枸杞、红参、续断、熟地黄、鹿茸等制备而成，具有补肾健骨、益气活血、温阳散寒、活血止痛、祛瘀生新、强壮筋骨之功效^[37-38]。用于肝肾虚损，腰膝不利。可有效提高骨细胞活力，促进骨形成，增加骨密度和骨量，同时还能抑制破骨细胞在骨片上形成的吸收陷窝的增加与扩张，从而达到补肾强骨之功效及治疗骨质疏松的目的。

由于实验在骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞及成骨细胞分化的两条通路中，仅选取了几个具有代表性的基因进行mRNA及蛋白表达的检测，研究尚不全面，通路机制仍不明确，尚待深入研究。

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