低温制剂保存对脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.002

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
干细胞低温制剂：指干细胞制备完成后，不及时使用，加入特定的保存液，低温条件下进行短期保存后短暂恢复至室温即可给患者使用的干细胞制剂形式。临床上，低温可以分为4个阶段：轻度低温(32-35 ℃)、中度低温(28-32 ℃)、深度低温(20-28 ℃)和超深度低温(20-1 ℃)。
脂肪间充质干细胞的优点：取材过程安全省时；对取脂部位创伤小；在脂肪组织中含量丰富；较强的体外扩增能力。因此，脂肪间充质干细胞是一种理想的在组织工程领域有很大应用潜力的成体干细胞。

摘要
背景：脂肪干细胞在GMP洁净车间制备完成后需要做成制剂才能给患者输注。低温制剂相比于冻存制剂有很多优势，然而关于低温短期保存对干细胞生物学特性影响的研究较少。
目的：评价用含5%人血白蛋白的复方电解质低温保存24 h对脂肪间充质干细胞生物学特性的影响。
方法：取第3-6代人脂肪间充质干细胞，以5×10⁹ L^-1的细胞浓度重悬在含5%人血白蛋白的复方电解质注射液中，将细胞悬液转移至冻存管中，置于冷链运输箱，2-8 ℃低温保存24 h。观察低温保存前后的细胞形态、贴壁能力、细胞活率、细胞直径及细胞免疫表型变化。
结果与结论：①脂肪间充质干细胞低温保存24 h后，死细胞增多，细胞活率显著下降，但细胞活率仍大于80%，活细胞直径显著增大；②脂肪间充质干细胞低温保存24 h后，少量细胞为圆形，失去贴壁能力，大部分细胞能贴壁生长，形态为梭形，与细胞保存前贴壁形态相似；③脂肪间充质干细胞低温保存24 h后，HLA-DR、CD34和CD45均为阴性表达，阳性率低于2%；CD29、CD73和CD105均为阳性表达，阳性率高于95%，但保存后的细胞显著地由一群分为两群，部分细胞体积增大，向右移动；④结果表明，低温制剂保存未明显影响脂肪间充质干细胞的贴壁生长能力、存活率及免疫表型等干性生物学特性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-5200-9483(陈彦田)

关键词: 干细胞, 脂肪间充质干细胞, 分离鉴定, 干细胞低温制剂, 贴壁能力, 细胞活率, 细胞直径, 免疫表型

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADSCs) that are manufactured in good manufacturing practice (GMP) clean rooms should be made into stem cell preparations before administration. Low-temperature preparation has many advantages over cryopreservation preparation; however, little is reported on the effect of short-term low-temperature storage on the biological characteristics of stem cells.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of 24-hour low-temperature storage using multiple electrolytes containing 5% human serum albumin on the biological characteristics of ADSCs.
METHODS: ADSCs at passages 3-6 at a concentration of 5×10⁹/L were suspended in multiple electrolytes containing 5% human serum albumin. Cell suspension was transferred into cryogenic vials, and then these vials were placed in a cold chain shipping box for 2-8 ℃ low-temperature storage for 24 hours. Cell morphology, adhesion ability, cell viability, cell diameters and cell immunophenotyping before and after the storage were observed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After low-temperature storage of ADSCs for 24 hours, the number of dead cells increased. Although cell viability decreased significantly, it was still higher than 80%. Cell diameters of living cells increased significantly. (2) After low-temperature storage of ADSCs for 24 hours, few cells which were circle-shaped lost adhesion ability, and most cells could adherently grow, with the spindle-shaped morphology similar to the cells before preservation. (3) After low-temperature storage of ADSCs for 24 hours, HLA-DR, CD34 and CD45 were negatively expressed with a positive rate lower than 2%; CD29, CD73 and CD105 were positively expressed with a positive rate higher than 95%. However, the cell cluster was clearly divided into two parts after the preservation. Cells with enlarged diameters moved right in the FSC/SSC dot-plot. These results show that low-temperature preparation storage has no significant effect on the stemness of ADSCs, such as adhesion ability, cell viability and cell immunophenotype.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Cryopreservation, Serum Albumin, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张凤丽，邵小虎，任怀娟，陈彦田，齐念民. 低温制剂保存对脂肪间充质干细胞生物学特性的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5255-5261.

Zhang Feng-li, Shao Xiao-hu, Ren Huai-juan, Chen Yan-tian, Qi Nian-min. Effect of low-temperature preparation on the biological characteristics of adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5255-5261.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪间充质干细胞的形态 如图1所示，用Ⅰ型胶原酶法消化脂肪组织得到的原代脂肪间充质干细胞接种在6孔板上，1 d后，观察到部分细胞贴壁生长，由圆形向梭形伸长生长，也有部分细胞已经呈现梭形形态；5 d后，贴壁的细胞为典型的梭形形态，贴壁生长状态良好，细胞分裂多次，形成明显的克隆；10 d后，细胞达到80%左右汇合，形态均一，无杂质细胞，可进行传代。

2.2 脂肪间充质干细胞的生长动力学 如图2所示，细胞接种至24孔板后，生长状况良好，增殖迅速，第5天荧光值即达到最高，此后，细胞生长进入平台期，荧光值呈现略微下降趋势，至第8天，培养板内细胞过多卷起，结束实验。

2.3 脂肪间充质干细胞的多向分化 如图3所示，实验组脂肪间充质干细胞添加成骨诱导培养基培养21 d，茜素红染色后发现有明显的钙结节沉积，对照组无钙盐沉积现象；成骨分化半定量分析结果看出，实验组吸光值显著性高于对照组(P < 0.05)。如图3所示，实验组脂肪间充质干细胞添加成脂诱导培养基培养21 d，油红O染色后发现细胞胞浆内有大量红色油滴；对照组无红色油滴出现，且细胞密集，呈梭形生长；成脂分化半定量分析结果看出，实验组吸光值显著性高于对照组(P < 0.05)。结果说明脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能。
2.4 低温制剂保存后脂肪间充质干细胞的活率 如图4A，B所示，低温保存24 h后，被PI染成红色的亮点增多，即死细胞增多，细胞活率显著下降，但细胞活率仍大于80%；被AO染成绿色的亮点变大，活细胞直径显著增大(图4C)。

2.5 低温制剂保存后脂肪间充质干细胞的贴壁能力 如图5所示，细胞保存后少量细胞为圆形，失去贴壁能力，大部分细胞能贴壁生长，形态为梭形，与细胞保存前贴壁形态相似。

2.6 低温制剂保存后脂肪间充质干细胞的免疫表型 低温制剂保存后，脂肪间充质干细胞HLA-DR、CD34和CD45均为阴性表达，阳性率低于2%；CD29、CD73和CD105均为阳性表达，阳性率高于95%(图6)，符合间充质干细胞的鉴定标准^[11]，保存未显著降低脂肪干细胞的“干性”。然而，保存后的细胞显著地由一群分为两群，部分细胞体积增大向右移动(图7)，与上述计数仪测量的结果一致。

参考文献

[1] 孙国栋,李志忠.人脐带间充质干细胞在组织工程中的研究进展[J].现代生物医学进展,2009,9(12): 2389-2391.

[2] 许倩.人脐带血间充质干细胞的分离培养及向类肝细胞诱导分化的初步研究[D].四川大学,2005.

[3] Uzbas F,May ID,Parisi AM,et al.Molecular physiognomies and applications of adipose-derived stem cells.Stem Cell Rev. 2015;11(2):298-308.

[4] Wang D,Zhang F,Shen W,et al.Mesenchymal stem cell injection ameliorates the inducibility of ventricular arrhythmias after myocardial infarction in rats.Int J Cardiol. 2011;152(3): 314-320.

[5] GOCHCHPAFBTPDBOMOAR Sciences.Summary Basis of Decision (SBD): Prochymal - 2012 - Health Canada.

[6] Sánchez-Salinas A,Cabañas‐Perianes V,Blanquer M,et al. An automatic wash method for dimethyl sulfoxide removal in autologous hematopoietic stem cell transplantation decreases the adverse effects related to infusion.Transfusion. 2012; 52(11):2382-2386.

[7] 姚永明,张帆,张泽敏,等.不同配比冻存液对兔脂肪干细胞液氮冻存效果的研究[J].中国美容医学,2015, 24(9):29-33.

[8] Marquez-Curtis LA,Janowska-Wieczorek A,McGann LE,et al. Mesenchymal stromal cells derived from various tissues: Biological, clinical and cryopreservation aspects. Cryobiology. 2015;71(2):181-197.

[9] Marx J,Walls R,Hockberger R.Rosen's emergency medicine- concepts and clinical practice[M]. Elsevier Health Sciences, 2013.

[10] Ren H,Sang Y,Zhang F,et al.Comparative analysis of human mesenchymal stem cells from umbilical cord, dental pulp, and menstrual blood as sources for cell therapy.Stem Cells Int. 2016;2016:3516574.

[11] Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy.2006; 8(4):315-317.

[12] 王佃亮.细胞药物的标准及质量控制--细胞药物连载之四[J].中国生物工程杂志,2016,36(10):115-121.

[13] Cyranoski D.China's stem-cell rules go unheeded.Nature. 2012;484(7393):149-150.

[14] 张磊.干细胞创新如何跨越“死亡之谷”[J].中国医药生物技术, 2015,10(5):385-391.

[15] Yoshimura K,Suga H,Eto H.Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation.Regen Med.2009;4(2):265-273.

[16] Bajek A,Gurtowska N,Olkowska J,et al. Adipose-Derived Stem Cells as a Tool in Cell-Based Therapies. Arch Immunol Ther Exp.2016;64(6):443-454.

[17] Gomez-Mauricio RG,Acarregui A,Sanchez-Margallo FM,et al.A preliminary approach to the repair of myocardial infarction using adipose tissue-derived stem cells encapsulated in magnetic resonance-labelled alginate microspheres in a porcine model.Eur J Pharm Biopharm. 2013;84(1):29-39.

[18] Robinson NJ,Picken A,Coopman K.Low-temperature cell pausing: an alternative short-term preservation method for use in cell therapies including stem cell applications. Biotechnol Lett. 2014;36(2):201-209.

[19] Lovelock JE,Bishop MW.Prevention of freezing damage to living cells by dimethyl sulphoxide. Nature. 1959;183(4672): 1394-1395.

[20] Marquez-Curtis LA,Janowska-Wieczorek A,McGann LE,et al.Mesenchymal stromal cells derived from various tissues: Biological, clinical and cryopreservation aspects.Cryobiology. 2015;71(2):181-197.

[21] Niess H,von Einem JC,Thomas MN,et al.Treatment of advanced gastrointestinal tumors with genetically modified autologous mesenchymal stromal cells (TREAT-ME1): study protocol of a phase I/II clinical trial.BMC Cancer.2015;15:237.

[22] Chambers DC,Enever D,Ilic N,et al.A phase 1b study of placenta‐derived mesenchymal stromal cells in patients with idiopathic pulmonary fibrosis.Respirology. 2014;19(7): 1013-1018.

[23] Forbes GM,Sturm MJ,Leong RW,et al.A phase 2 study of allogeneic mesenchymal stromal cells for luminal Crohn's disease refractory to biologic therapy.Clin Gastroenterol Hepatol.2014;12(1):64-71.

[24] Ikebe C,Suzuki K.Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols.Biomed Res Int.2014;2014:951512.

[25] Bruder SP,Jaiswal N,Haynesworth SE.Growth kinetics, self‐renewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation.J Cell Biochem.1997;64(2): 278-294.

[26] Rust PA,Tingerides C,Cannon SR,et al.Characterisation of cryopreserved cells freshly isolated from human bone marrow. CryoLetters.2006;27(1):17-28.

[27] Hunt L,Hacker DL,Grosjean F,et al.Low-temperature pausing of cultivated mammalian cells. Biotechnol Bioeng.2005;89(2): 157-163.

[28] Roobol A,Carden MJ,Newsam RJ,et al.Biochemical insights into the mechanisms central to the response of mammalian cells to cold stress and subsequent rewarming.FEBS J. 2009;276(1): 286-302.

[29] Ikebe C,Suzuki K.Mesenchymal stem cells for regenerative therapy: optimization of cell preparation protocols.Biomed Res Int.2014;2014:951512.

引言

干细胞是一类可自我更新和多向分化的多潜能细胞^[1]。干细胞通过分裂维持干性，又可分化为具有特定功能的细胞^[2]，因此在修复多种组织和器官上有很大的应用潜力。脂肪间充质干细胞，简称脂肪干细胞，是来源于脂肪组织的，能贴壁生长且具有多向分化潜能的间充质干细胞。脂肪间充质干细胞的提取方法有多种，包括Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶和胰酶分离方法。由于Ⅰ型胶原大量存在于脂肪组织，目前常见的提取方法是用Ⅰ型胶原酶消化，来分离胶原基质纤维和细胞。

和骨髓间充质干细胞类似，脂肪间充质干细胞能分化成中胚层和非中胚层的细胞系。相比于骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞有如下优点^[3]：取材过程安全省时；对取脂部位创伤小；在脂肪组织中含量丰富；较强的体外扩增能力。因此，脂肪间充质干细胞是一种理想的在组织工程领域有很大应用潜力的成体干细胞。

在收获干细胞后，立即进行移植能达到最好的临床疗效。临床使用干细胞需要在医院进行，但干细胞作为一种特殊的药品，主要成分为活细胞，为了保证干细胞的安全性，要严格把控干细胞生产过程，在符合药品生产质量管理规范(good manufacturing practice，GMP)要求的洁净车间内生产干细胞。而GMP环境的干细胞制备车间造价昂贵，不可能在每一个需要使用干细胞进行治疗的医院单独设立GMP洁净车间。细胞只能在特定的符合GMP要求的洁净车间大量生产，之后运输到医院给患者实施治疗^[4]。因此，在再生医学领域大规模使用间充质干细胞，需要临床上能接受的货架产品，即干细胞制剂产品。干细胞制剂在GMP洁净车间完成生产，作为成品运输到医院后，不需要医生进行额外复杂的操作，可直接用于对患者的治疗。

干细胞冻存制剂是指将干细胞重悬在冻存保护剂中，经过程序降温后，可长期在液氮中保存的制剂形式。目前已批准的干细胞产品和临床上普遍采用的干细胞制剂多数为冻存制剂的形式，如干细胞药物Prochymal^[5]、Hemcord和Ducord等添加了10%二甲基亚砜。但二甲基亚砜是一种有毒试剂，与蛋白质的疏水集团发生作用，可导致蛋白质变性。干细胞制剂中添加二甲基亚砜会引起人严重的不良反应。局部注射含二甲基亚砜的细胞产品可能会引起严重的超敏反应、灼伤刺痛皮肤等，直接将含二甲基亚砜的细胞产品输注到人体内会引起严重的不良反应，包括恶心、呕吐、皮疹、腹痛、低血压、严重的神经系统并发症、肾衰竭和心血管系统疾病^[6]。也有关于减少二甲基亚砜浓度到5%的报道，但结果不尽如人意，5%二甲基亚砜不能有效阻止细胞内冰晶的生成，显著减弱了对细胞的保护作用^[7]。使用其他冻存保护剂，比如乙二醇、甲醇、聚合物羟乙基淀粉等，也不可避免地引起细胞损伤，研究者需要解决如何才能减少细胞毒性的问题^[8]。

干细胞低温制剂指干细胞制备完成后，不及时使用，加入特定的保存液，低温条件下进行短期保存后短暂恢复至室温即可给患者使用的干细胞制剂形式。临床上，低温可以分为4个阶段：轻度低温(32-35 ℃)、中度低温(28-32 ℃)、深度低温(20-28 ℃)和超深度低温(20-1 ℃)^[9]，此次实验所采用低温为冷链运输常用温度2-8 ℃。低温制剂不需要使用有毒的冻存保护剂二甲基亚砜等，运输安全，操作步骤简单。实验将5×10⁹ L^-¹的脂肪间充质干细胞细胞重悬在含5%人血白蛋白的复方电解质注射液中，2-8 ℃保存24 h后，评价该低温制剂剂型对脂肪干细胞生物学特性的影响，以期开发一种安全高效的干细胞制剂。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2016年12月在上海交通大学药学院CCBE实验室完成。

1.3 材料 实验用人脂肪间充质干细胞由上海丽坤生物科技有限公司惠赠，细胞取自33岁女性志愿者，志愿者对实验知情并签署了《知情同意书》，自愿将储存后的多余细胞用于科学研究。研究获得了上海交通大学药学院伦理委员会批准。

主要试剂与仪器：α-MEM培养基、青霉素、链霉素、TrypLE(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；人血白蛋白注射液(上海生物制品研究所)；复方电解质注射液(四川科伦)；Ⅰ型胶原酶、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松、吲哚美辛、IBMX、胰岛素(美国Sigma公司)；AO/PI染液、CountStar FL自动细胞计数仪(上海睿钰生物科技)；茜素红(德国Schmid公司)；油红O、40 g/L多聚甲醛、异丙醇、氯化十六烷基吡啶(国药试剂)；鼠抗人CD34-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、HLA-DR-PE，PE同型小鼠IgG1(美国BD Biosciences公司)；Alamar Blue试剂盒(美国Life technologies公司)；CO₂培养箱、酶标仪(美国Thermo公司)；超净工作台(美国Airtech公司)；IX51倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的分离与培养 原代脂肪间充质干细胞在上海丽坤生物科技有限公司的GMP洁净车间完成分离和培养。使用Ⅰ型胶原酶消化法得到原代脂肪间充质干细胞。重悬后，将原代细胞以2×10⁹ L^-¹的细胞浓度接种到6孔板中，添加含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素及链霉素双抗的α-MEM生长培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂的饱和湿度培养箱培养。24 h后在显微镜下观察细胞贴壁及生长情况并更换新鲜的培养液，去除未贴壁的细胞。二三天换液1次并在显微镜下观察。细胞长至约80%汇合度时，进行传代操作。实验使用P3-P6的细胞。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的生长动力学检测 取适量细胞，添加生长培养基，以 2×10⁴/well的密度接种在24孔板上，培养24 h后弃去培养基，添加含10%Alamar Blue的新鲜生长培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱避光孵育3 h。每孔吸取200 μL上清液置于96孔板中，于酶标仪上570 nm和590 nm处测定荧光值。每天重复孵育、测定、清洗、培养步骤，绘制生长曲线。

群体倍增时间按照如下公式计算^[10]：群体倍增时间= t×lg2/(lgN_t-lgN₀)，公式中，t代表增殖时间，N_t代表收获细胞的个数，N₀代表接种细胞的个数。

1.4.3 脂肪干细胞多向分化能力测定 将收获的细胞以5×10³/well的密度将细胞接种到12孔板中，培养至80%汇合，实验组用成骨诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清、200 μmol/L抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.1 μmol/L地塞米松的α-MEM培养基)诱导21 d，对照组不加入成骨诱导培养基，用茜素红染色观察钙结节沉积，并用氯化十六烷基吡啶孵育后于570 nm处进行半定量分析。将收获的细胞以1×104/well的密度将细胞接种到12孔板中，培养至80%汇合，实验组加入成脂诱导培养基(含体积分数10%胎牛血清、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰岛素、200 μmol/L吲哚美辛的α-MEM培养基)诱导21 d，对照组不加入成脂诱导培养基，用油红O染色观察油滴形成，并用异丙醇孵育后于510 nm处进行半定量分析。
1.4.4 脂肪间充质干细胞低温制剂的制备 将细胞以5×10⁹ L^-¹的细胞浓度重悬在含5%人血白蛋白的复方电解质注射液中。将细胞悬液转移至冻存管中，之后将冻存管放置于冷链运输箱，2-8 ℃低温保存24 h。

1.5 主要观察指标

脂肪干细胞活率及直径测定：低温保存24 h后，取出20 μL细胞悬液，加入等体积的 AO/PI染液充分混合均匀后，吸取20 μL溶液用枪头打入细胞计数板，置于CountStar FL细胞计数仪下计数并测量细胞活率及直径。

脂肪干细胞贴壁能力测定：取出1×10⁹ L^-¹需要检测的细胞，加入适量培养基混匀后培养24 h，显微镜下观察细胞贴壁情况并拍照。

脂肪干细胞免疫表型测定：将细胞1 000 r/min离心5 min。PBS清洗，弃去上清。调整细胞浓度至2×10⁸ L^-¹，向细胞中加入CD34-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE、HLA-DR-PE抗体，置于4 ℃冰箱孵育30 min。与IgG1抗体结合的细胞作为同型对照。用流式细胞仪检测细胞免疫表型。

1.6 统计学分析 所有数据使用x(_)±s表示，采用SPSS 19软件进行单因素方差分析(ANOVA)和SNK检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

中国干细胞研究处于世界领先水平，从PubMed和Clinicaltrials网站数据来看，中国发表的间充质干细胞文章数排在美国之后，处于世界第二水平。然而中国干细胞产业的发展并不是一帆风顺。2012年1月，国家卫生部发文《关于开展干细胞临床研究和应用自查自纠工作的通知》，明确指出各地卫生部门要对正在开展的干细胞临床研究进行清理工作，停止一切未经批准的干细胞临床研究，开展对干细胞行业的整顿工作^[12]。2012年4月《Nature》发文称中国仍存在干细胞治疗乱象^[13]，仍然存在非法机构进行干细胞治疗活动。2012年初国家开始起草《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》，并于2015年7月正式宣布试行^[14]。该指导原则指出，要根据干细胞制剂稳定性试验结果，确定其制剂的保存液成份与配方、保存及运输条件、有效期，同时确定与有效期相适应的运输容器和工具，以及合格的细胞冻存设施和条件。2016年12月，国家药监局药审中心发布《细胞制品研究与评价技术指导原则》，为细胞治疗行业制订了详细的指导原则。由此可以看出，中国干细胞临床日益规范，也证明了干细胞治疗存在良好的应用前景。

脂肪中含有50%-70%的脂肪细胞，除此之外，Yoshimura等^[15]发现行抽脂术抽取的脂肪中含有10%以上的脂肪间充质干细胞，随着现代人肥胖比例的增加，脂肪组织来源更为丰富且抽取脂肪创伤小，使脂肪间充质干细胞成为理想的间充质干细胞来源^[16-17]。此次研究中分离得到的脂肪间充质干细胞为梭形，生长迅速代谢旺盛，有较好的成脂成骨分化能力，符合国际细胞治疗协会对间充质干细胞的定义。干细胞制剂是从干细胞制备完成到给患者实施治疗必须经历的一个重要环节，干细胞制剂的研究能促进干细胞临床研究的步伐，加快中国干细胞研究进程。

冻存是最常使用的储存细胞的方法^[18]。冻存保护剂是在细胞冻存过程中对细胞起保护作用的物质。根据冻存保护剂穿透细胞膜的能力，可将其分为渗透性和非渗透性。渗透性冻存保护剂包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇、1，2-丙二醇、甲醇、乙醇、丙醇和甲酰胺等。保护剂的小分子结合水分子发生水合作用，在降温过程中减少冰晶形成、防止溶质浓度过高、减少细胞脱水来保护细胞^[19]。非渗透性冻存保护剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、聚合物羟乙基淀粉等^[20]。此类保护剂抑制冰晶形成，加速细胞脱水，较低摩尔浓度的非渗透性冻存保护剂可保护细胞，但是要满足较快的冻存速率要求。

细胞冻存最常使用的冻存保护剂是10%的二甲基亚砜^[21-24]。早在1997年，研究者发现骨髓间充质干细胞添加10%二甲基亚砜冻存24 h后，可以再培养传代一直到第15代仍保持成骨分化能力^[25]。之后有研究者发现人骨髓中提取得到的骨祖细胞重悬在含10%二甲基亚砜的细胞悬浮液中，以1 ℃/min的速率降温到-70 ℃，24 h后，放入液氮罐中储存7 d，细胞的增殖速率、成骨分化潜能和新鲜未冻存的细胞相比没有显著性差异^[26]。之后，二甲基亚砜被广泛应用于生物技术领域的细胞冻存。二甲基亚砜对于实验用细胞的冻存来说，是可接受的效果较好的冻存保护剂。但如果将二甲基亚砜加入到直接输注到人体内的干细胞制剂产品中，会引起非常严重的不良反应。美国批准的Ducord产品说明书指出，减少二甲基亚砜的含量能很大程度上减少不良反应，因此推荐的剂量为每1 kg体质量最多注射1 g二甲基亚砜。产品说明书同时指出，可有选择地在临床输注前，稀释清洗二甲基亚砜，以减少二甲基亚砜浓度。但是选择清洗会增大操作难度：需要保证冻存袋、稀释袋和空的输液袋之间的无缝连接；临床使用前的操作在非GMP洁净环境下进行，需要格外谨慎，否则会增大污染风险；去除二甲基亚砜需要两次冲洗冻存袋、离心、移除上清等步骤，操作繁琐且易降低细胞活率。

因此，对于不添加冻存保护剂尤其是二甲基亚砜的干细胞制剂的研究，对最大程度地保障患者安全具有非常重要的意义。低温在自然界中是一种防腐的方式，而且细胞拥有暴露在低温环境后自我恢复的能力^[18]。因此，低温保存人干细胞用于临床治疗符合逻辑及自然规律。Hunt等^[27]研究发现哺乳动物细胞在低温条件下7 d内都可以维持活细胞状态。Roobol等^[28]发现低温保存可降低细胞代谢活动。

低温制剂中的保存液、保存时间和细胞浓度可能会影响间充质干细胞的活率和功能。课题组前期研究发现，5×10⁹ L^-¹的脂肪间充质干细胞重悬在含5%人血白蛋白的复方电解质注射液中2-8 ℃保存24 h是最佳的干细胞低温制剂保存方案。此次研究中探索了用该方案保存后，脂肪间充质干细胞的贴壁能力、细胞活率和细胞直径、细胞免疫表型的变化。通过对保存前后脂肪间充质干细胞的活率和细胞直径的对比，发现保存后活细胞数显著下降，但仍然大于80%，符合干细胞临床应用的活率要求。人血白蛋白有保护细胞免受环境压力的作用，同时在保存过程中能阻止细胞贴附在冻存管壁上，能对细胞起到保护作用^[29]。保存后，细胞直径明显增大，推测是由于保存液成分中含有的人血白蛋白包裹细胞而致。

反映细胞质量高低的指标不仅包括细胞活率，还应该包括细胞活性。脂肪干细胞是一种贴壁细胞，贴壁能力的检测是一种较为精准的细胞活性检测方法。重新接种后的细胞需要适应环境，因此实验选择贴壁24 h后进行观察。保存后少量细胞丧失了贴壁能力，表明保存过程对细胞造成一定程度的损伤，降低了细胞活性。但是保存后绝大部分细胞能完成贴壁，表明大部分细胞仍有较强的贴壁能力，且细胞呈梭形生长，类似于保存前成纤维样细胞生长形态。

目前对脂肪间充质干细胞的免疫表型鉴定没有统一的标准，因此实验选择了间充质干细胞的免疫表型来进行鉴定^[9]。CD34与CD45为造血干细胞表面标记物，HLA-DR为人白细胞抗原标记物，CD29、CD73和CD105均为间充质干细胞标记物。细胞保存后，HLA-DR、CD34和CD45均为阴性表达，CD29、CD73和CD105均为阳性表达，满足间充质干细胞鉴定中对免疫表型的要求，因此保存过程没有降低脂肪干细胞的“干性”。保存后，细胞明显分为两群，表明部分细胞的体积增大。通过对细胞活率及细胞直径的观察，发现保存后细胞明显分群的现象与细胞直径的结果对应，推测是人血白蛋白包裹细胞使其体积增大。

综上所述，脂肪干细胞低温短期保存后，仍然能达到临床使用的活率要求，细胞直径增大，贴壁能力强，细胞免疫表型仍符合间充质干细胞的鉴定标准。该低温短期保存为脂肪干细胞的临床应用提供了一种参照方案。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程