盐酸四环素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.001

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (33): 5249-5254.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.33.001

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盐酸四环素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用

张珏¹，薛斯亮²，罗媛³，智伟⁴

¹遵义医药高等专科学校药学系，贵州省遵义市 563006；²四川大学华西医院皮肤科，四川省成都市 610041；³贵州省骨科医院药剂科，贵州省贵阳市 550004；⁴西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室，材料科学与工程学院，四川省成都市 610041

修回日期:2017-06-12 出版日期:2017-11-28 发布日期:2017-12-01
通讯作者: 智伟，博士，工程师，西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室，材料科学与工程学院，四川省成都市 610041
作者简介:张珏，女，1981年生，汉族，贵州省遵义市人，2012年四川大学华西药学院毕业，硕士，执业药师，副教授，主要从事干细胞，药物的生物生物筛选与评价方面的研究。并列第一作者：薛斯亮，男，1980年生，汉族，四川省成都市人，2010年四川大学华西临床医学院毕业，博士，主治医师，主要从事皮肤干细胞方向的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31400809)；贵州省科技厅科学技术基金项目([2012]2366号)；中央高校基本科研业务费专项资金(2682015CX006)

Tetracycline hydrochloride promotes rat bone marrow mesenchymal stem cells proliferation in vitro

Zhang Jue¹, Xue Si-liang², Luo Yuan³, Zhi Wei⁴

¹Department of Pharmacy, Zunyi Medical and Pharmaceutical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China; ²Department of Dermatology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; ³Department of Pharmacy, Guizhou Province Osteological Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; ⁴Key Laboratory of Advanced Technologies of Materials, Ministry of Education, School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China)

Revised:2017-06-12 Online:2017-11-28 Published:2017-12-01
Contact: Zhi Wei, Doctor, Engineer, Key Laboratory of Advanced Technologies of Materials, Ministry of Education, School of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Zhang Jue, Master, Associate professor, Department of Pharmacy, Zunyi Medical and Pharmaceutical College, Zunyi 563000, Guizhou Province, China Xue Si-liang, M.D., Attending physician, Department of Dermatology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China Zhang Jue and Xue Si-liang contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31400809; the Science and Technology Foundation of Guizhou Science and Technology Department, No [2012]2366; the Fundamental Research Funds for the Central Universities, No. 2682015CX006

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
四环素：具有抑制基质金属蛋白酶活性、抑制骨吸收、可恢复成骨细胞的结构和功能，具有极强的骨亲活性，可促进处于病理状态下骨组织生长的活性，影响成骨细胞的结构和功能，恢复病理状态下成骨细胞的正常结构，这些特性使其在骨科极具潜在的临床应用价值，尤其是在组织工程骨开发和应用中有着广阔的临床应用前景。
细胞增殖检测方法：主要有活细胞计数法、MTT法、同位素³H-TdR掺入法及BrdU等方法，其中细胞计数法直观简单，但计数时可能混有已凋亡的细胞，同时药物的干扰可能也会抑制凋亡的发生，因而最终不能客观证明检测的细胞是否在增殖；³H-TdR掺入法虽具有灵敏度高、稳定性好等特点，但步骤较多，需要特殊设备，并且具有放射性；BrdU法需要固定和变性，易造成细胞DNA双链断裂影响结果；MTT法是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，将外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，因而能够反映活细胞在数量上的变化，同时该法还具有灵敏度高、操作简便、快速的特点。

摘要
背景：研究表明，低浓度四环素可促进体外培养的人胚成骨细胞活性及增殖，增加且加强细胞合成Ⅰ型胶原、骨钙素等促进骨生成的物质。
目的：观察盐酸四环素体外对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用。
方法：取第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞，分2组干预，对照组加入含胎牛血清的完全培养基培养，实验组加入含盐酸四环素及胎牛血清的完全培养基培养。培养1-8 d，采用MTT法、细胞计数法检测两组细胞增殖活性。
结果与结论：①细胞计数法：随着培养时间的延长，两组细胞数量逐渐增加，实验组培养4-8 d的细胞数量高于对照组(P < 0.05)；②MTT法：两组细胞数量均随培养时间的延长而增加，第1天为细胞潜伏期，3-6 d为对数生长期，第7天，对照组细胞进入平台期，实验组细胞继续增殖，实验组培养5-8 d的细胞增殖高于对照组(P < 0.05)；③结果表明：盐酸四环素可促进骨髓间充质干细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程ORCID: 0000-0002-3084-1682(张珏)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 盐酸四环素, 骨髓间充质干细胞, 增殖, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Tetracycline hydrochloride is shown to promote viability and proliferation of human embryonic osteoblasts cultured in vitro, increase the production of type I collage and osteocalcin.
OBJECTIVE: To study the proliferation activity of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) cultured by tetracycline hydrochloride in vitro.
METHODS: Passage 3 BMSCs from Sprague-Dawley rats were cultured and divided into two groups: cells in control group were cultured in complete medium containing fetal bovine serum, and those in experimental group were cultured in complete medium containing tetracycline hydrochloride. After days 1-8 of culture, MTT and cell counting assay were used to detect cell viability and proliferation in the two groups.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cell counting assay: with time, the number of cells in both groups was increased, but the cell number in the experimental group was higher than that in the control group at days 4-8 of culture (P < 0.05). (2) MTT assay: With time, the number of cells in both groups was increased: incubation period was at day 1, logarithmic growth period was within days 3-6, and plateau period began at day 7. Then, the cells continued to proliferate, and the cell proliferation was higher in the experimental group than the control group at days 5-8 of culture (P < 0.05). To conclude, tetracycline hydrochloride can significantly enhance BMSCs proliferation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells, Tetracycline Hydrochloride, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张珏，薛斯亮，罗媛，智伟. 盐酸四环素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(33): 5249-5254.

Zhang Jue, Xue Si-liang, Luo Yuan, Zhi Wei. Tetracycline hydrochloride promotes rat bone marrow mesenchymal stem cells proliferation in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(33): 5249-5254.

图/表（结果） 2

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引言

四环素具有抑制基质金属蛋白酶活性、抑制骨吸收、可恢复成骨细胞的结构和功能，具有极强的骨亲活性^[1-4]，可促进处于病理状态下的骨组织生长的活性，影响成骨细胞的结构和功能，恢复病理状态下成骨细胞的正常结构^[5]，这些特性使其在骨科极具潜在的临床应用价值，尤其是在组织工程骨开发和应用中有着广阔的临床应用前景。骨组织工程中的关键问题之一是寻找种子细胞。在骨修复过程中，成骨细胞是体内参与骨形成的主要细胞，然而，成骨细胞经长时间体外扩增后可能出现生物活性降低或消失，最终生成低质量的组织而不能满足修复骨缺损的需要。骨髓间充质干细胞是成骨细胞的来源，具有良好的成骨细胞分化潜能和成骨活性，长时间在体外扩增后仍能保持原有的生物活性，被认为是骨组织工程中种子细胞的最佳选择^[6-7]。生物体全骨髓中骨髓间充质干细胞比例极低^[8]，其成骨能力会被所处环境制约，因而直接从生物体骨髓中获取骨髓间充质干细胞不能满足骨组织工程的需要。体外培养、增殖、诱导骨髓间充质干细胞成骨分化，或许是解决骨组织工程种子细胞来源的有效途径之一。

研究表明，低浓度四环素可促进体外培养的人胚成骨细胞活性及增殖，增加且加强细胞合成Ⅰ型胶原、骨钙素等促进骨生成的物质^[9]；低浓度盐酸四环素缓释微球可促进成骨细胞增殖、增强碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达，提示四环素有较强促成骨潜能^[10-12]。

研究拟将具有成骨潜能的盐酸四环素与较好分化潜能的骨种子细胞骨髓间充质干细胞进行共培养，探讨盐酸四环素对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响，为体外获得大量骨种子细胞，进行盐酸四环素对骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化影响的研究奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞观察实验.

1.2 时间及地点 实验于2014年6月至2014年12月在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室完成。

1.3 材料

实验动物：3-7 d龄健康SD大鼠，体质量20-30 g，雌雄不拘，由四川大学动物中心提供。

主要试剂与仪器：盐酸四环素、二甲亚砜、MTT、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、吲哚美辛、3-异丁基- 1-甲基黄嘌呤及牛胰岛素(美国Sigma)；胎牛血清、胰蛋白酶、L-DMEM完全培养基(美国Gibco)；酶联免疫检测仪(Bio-Rad，美国)。

1.4 实验方法

骨髓间充质干细胞的分离和原代培养^[13]：①无菌条件下剪取10只SD大鼠股骨、胫骨，剪去长骨两端，用15 mL含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基冲洗骨髓腔。巴氏吸管反复吹打收集到的骨髓混悬液，接种于细胞培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度细胞培养箱中进行培养，间隔3 d换液1次。待细胞融合至80%-90%后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，并按1∶2比例进行传代培养。

骨髓间充质干细胞的鉴定^[14]：取第3代(P3)骨髓间充质干细胞，按1×10⁴/cm²的细胞密度接种于有血盖片的6孔培养板中。加入成骨诱导剂(成骨诱导剂组成：地塞米松0.1 μmol/L、β-甘油磷酸钠10 nmol/L、抗坏血酸50 mg/L)进行成骨诱导。加入成脂诱导剂(成脂诱导剂组成：地塞米松0.1 μmol/L、吲哚美辛50 μmol/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5 nmol/L、牛胰岛素10 mg/L)进行成脂诱导。成骨诱导21 d行茜素红染色，成脂诱导14 d行油红O染色。

实验分组：将细胞分为2组，对照组用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基培养，实验组用含体积分数10%胎牛血清和10 mg/L盐酸四环素的L-DMEM培养液培养，并进行如下实验：

细胞计数法检测盐酸四环素对骨髓间充质干细胞的增殖作用：将第3代骨髓间充质干细胞制成单细胞悬液，倒置相差显微镜下计数后，以3×10⁴个细胞接种于24孔板上，用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基进行培养，置于37 ℃、体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养24 h，弃去培养液，对照组用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM的完全培养基培养，实验组用含体积分数10%胎牛血清和10 mg/L盐酸四环素的L-DMEM培养液培养。每日每组取3孔细胞，连续计数8 d，取平均值，实验重复3次。

MTT法检测盐酸四环素对骨髓间充质干细胞的增殖作用：取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以每孔4×10³个细胞接种于96孔板上，每孔加入含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养液200 µL，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度细胞培养箱中过夜，弃去培养液，对照组用100 µL含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM的完全培养基培养，实验组用100 µL含体积分数10%胎牛血清和10 mg/L盐酸四环素的L-DMEM培养液培养。各组每天取细胞6孔，加入MTT(5 g/L)20 µL，置于培养箱中继续培养4 h，吸尽上清。加150 µL DMSO振荡15 min。酶联免疫检测仪于490 nm处测定吸光度(A)值，连续测定8 d，并取平均值绘制细胞生长曲线。实验重复3次。

1.5 主要观察指标 培养1-8 d，MTT法、细胞计数法检测两组细胞增殖活性结果。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析和t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

间充质干细胞是一类来源广泛(如骨髓、外周血、脐血等)且具有多向分化潜能的成体干细胞。间充质干细胞可与其他细胞一起支持造血干细胞造血，在不同的诱导条件下能分化为软骨、骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经元等多种组织细胞，已成为组织工程、细胞治疗和基因治疗较为理想的靶细胞^[15-22]。

骨髓间充质干细胞来源于骨髓，具有多向分化的潜能，因在一定条件下能向成骨细胞转化，而成为构建组织工程骨的重要细胞。在临床上，可从患者髂骨中穿刺取得骨髓，因此骨髓间充质干细胞最有可能作为自体细胞构建组织工程骨而应用于治疗^[23]。Pittenger等^[15]认为骨髓间充质干细胞必须具有体外培养过程中贴壁生长且呈成纤维细胞样集落生长的特性和随时间延长能自我增殖，同时能分化为脂肪细胞、成骨细胞等至少2种以上细胞系的特性。骨髓间充质干细胞可以采用贴壁法、密度梯度离心法等方法进行分离培养^[24-27]。为了获取生物活性高的骨髓间充质干细胞^[28]，此次实验采取了骨髓贴壁培养法对骨髓间充质干细胞进行原代培养，可见其贴壁生长随时间延长具有呈成纤维细胞样集落状生长的特征；在成骨诱导剂和成脂诱导剂的作用下可分别定向分化为成骨细胞和脂肪细胞，说明实验所培养的细胞为骨髓间充质干细胞^[29-30]。

增殖是活细胞的重要生理功能之一，也是生物体的重要生命特征之一，是生物体生长、发育、繁殖及遗传的基础。增殖是指细胞进行细胞质和细胞核的复制，随后发生有丝分裂，细胞质和细胞核进行平均分配，细胞由一变二，数量随之增加。细胞周期中，G₁期是细胞质合成，S期为DNA合成，G₂期是合成后期，M期是细胞分裂期。目前，用于检测细胞增殖能力的方法主要有活细胞计数法、MTT法、同位素³H-TdR掺入法及BrdU等方法^[31]。其中细胞计数法直观简单，但计数时可能混有已凋亡的细胞，同时，药物的干扰可能也会抑制凋亡的发生，因而最终不能客观证明检测的细胞是否在增殖；³H-TdR掺入法虽具有灵敏度高、稳定性好等特点，但步骤较多，需要特殊设备，并且具有放射性^[22]。BrdU法需要固定和变性，易造成细胞DNA双链断裂影响结果^[33]。MTT法是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶将外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫结晶物，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，因而能够反映活细胞在数量上的变化^[34-36]。同时，该法还具有灵敏度高、操作简便、快速的特点。

实验结果表明，无论是用细胞计数法还是MTT法检测，实验组较对照组均有明显提高骨髓间充质干细胞增殖能力的效果。通常情况下，骨髓间充质干细胞在进行二维平面培养时，细胞增殖会在第4天达到顶峰，随后进入平台期^[37-44]，这是因为当细胞增殖至一定数量时，细胞密度会制约细胞的增殖趋势。而在此次实验中，两组细胞在前4 d时增殖情况并无显著差异，但自第5天起，实验组始终呈上升趋势，这说明细胞增殖平台期被延后了。有研究报道盐酸四环素能增强成骨细胞的活力，加快细胞增殖速率，缩短细胞的群体倍增时间^[45-52]。而从此次实验结果来看，盐酸四环素也同样能增强骨髓间充质干细胞的细胞活力，加快细胞增殖速率，缩短细胞的群体倍增时间。这对于体外种子细胞扩增而言意义巨大，不仅降低了污染的风险，而且可避免因长时间体外培养造成骨髓间充质干细胞的干细胞分化特性丢失。

尽管两种细胞增殖的检测结果具有一致性，但活细胞计数法结果显示细胞在第8天时增殖速度有突发性加快，而MTT法结果显示细胞在第8天时增殖速度已放缓，这种差异可能是因为细胞在增殖过程中也有正常的凋亡，而MTT法检测结果直观反映的是具有增殖活力的正常细胞的数量，细胞计数法的结果则是针对包括凋亡细胞在内的全部活细胞进行的。因此会出现不太一致之处。在后续的实验中将进一步通过细胞周期、凋亡等检测来验证盐酸四环素对骨髓间充质干细胞促增殖的效果及作用机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

盐酸四环素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的作用

Tetracycline hydrochloride promotes rat bone marrow mesenchymal stem cells proliferation in vitro

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