不同剂量脂肪干细胞移植对早期肾纤维化形成的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.016

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4685-4690.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.016

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不同剂量脂肪干细胞移植对早期肾纤维化形成的影响

吕春燕¹，李进辉¹，刘伟伟²，陈昌金³，吴程¹，赵梓亦³，沈东成²

¹成都中医药大学附属医院/临床医学院病理科/病理教研室，四川省成都市 610072；²成都中医药大学基础医学院，四川省成都市 611137；³成都中医药大学附属医院/临床医学院中心实验室，四川省成都市 610072

修回日期:2017-05-19 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
作者简介:吕春燕，女，1978年生，四川省成都市人，汉族，成都中医药大学在读博士，副主任医师，主要从事中西医结合肾脏病理的研究。
基金资助:
四川省卫生厅项目(110520)；成都市卫生局项目(2014004)；成都中医药大学实验技术项目(071002)

Effect of different doses of adipose-derived stem cells on early renal fibrosis

Lv Chun-yan¹, Li Jin-hui¹, Liu Wei Wei², Chen Chang-jin³, Wu Cheng¹, Zhao Zi-yi³, Shen Dong-cheng²

¹Department of Pathology, ³Central Laboratory, Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan Province, China; ²College of Basic Medical Sciences, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan Province, China

Revised:2017-05-19 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
About author:Lv Chun-yan, Studying for doctorate, Associate chief physician, Department of Pathology, Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, Sichuan Province, China
Supported by:
the Project of Sichuan Provincial Health Department, No. 110520; the Project of Chengdu Municipal Health Department, No. 2014004; Experimental Technology Project of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, No. 071002

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肾纤维化的形成机制：目前对肾纤维化的形成机制有多种看法，但研究得最多且最深入的看法认为转化生长因子β1及其介导的Smad和/或非Smad通道导致的肾小管上皮细胞-肌纤维母细胞表型转化，引起肌纤维母细胞增生，分泌产生纤维基质沉积于肾间质，导致肾纤维化的发生，而α-平滑肌肌动蛋白是表型转化的重要标记物。
脂肪干细胞移植治疗早期肾纤维化：有积极的治疗效果，其机制可能是通过抑制致纤维化形成相关因子(转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白等)，减轻炎症反应、抑制胶原沉积，延缓肾纤维化的病理进程，拮抗肾纤维化的发生，且此疗效与移植细胞数量相关，3×10¹⁰ L^-1为相对较好的剂量。

摘要
背景：前期实验发现干细胞对于肾纤维化的早期形成具有一定的干预作用，能够延缓肾间质纤维化的发生。
目的：研究外源性脂肪干细胞移植对大鼠早期肾间质纤维化形成的影响，并探讨其量效关系。
方法：将50只SD大鼠随机分为5组，假手术组尾静脉注射PBS；模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组结扎左侧输尿管，建立肾纤维化模型，造模成功后，模型组尾静脉注射PBS，低剂量组、中剂量组、高剂量组尾静脉分别注射细胞浓度为1×10¹⁰，2×10¹⁰，3×10¹⁰ L^-¹的脂肪干细胞悬液0.1 mL。注射后14 d取左肾组织，采用苏木精-伊红染色和Masson染色观察肾小管-间质损伤程度及肾间质相对面积，免疫组织化学法检测α-平滑肌肌动蛋白和转化生长因子β1表达。
结果与结论：①苏木精-伊红染色：模型组表现为典型的肾小球及肾小管-间质改变；低剂量组、中剂量组、高剂量组均有一定程度的肾小球及肾小管-间质改变，但程度较模型组明显减轻，以高剂量组损伤程度最轻；②Masson染色：模型组肾小管间质增宽，胶原纤维沉积；低剂量组、中剂量组、高剂量组肾间质增宽程度低于模型组，中、高剂量组肾间质增宽程度低于低剂量组(P < 0.05)；③免疫组织化学染色：与假手术组比较，模型组α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1表达升高(P < 0.05)；与模型组比较，高剂量组α-平滑肌肌动蛋白表达降低(P < 0.05)，低、中、高剂量组转化生长因子β1表达均降低(P < 0.05)，以中、高剂量组转化生长因子β1降低更明显；④结果表明：外源性脂肪干细胞移植可延缓早期肾纤维化的形成，并存在剂量-效应关系，其机制可能是通过改变转化生长因子β1诱导的信号通道状态实现的。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程ORCID: 0000-0003-0456-1019(吕春燕)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 早期肾纤维化, 剂量-效应关系, 转化生长因子β1, ；α-平滑肌肌动蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Our preliminary findings have shown that stem cells have a certain effect on early formation of renal fibrosis and delay the occurrence of renal interstitial fibrosis.
OBJECTIVE: To investigate the effect of exogenous adipose-derived stem cell transplantation on the formation of renal interstitial fibrosis in rats, and to explore the dose-effect relationship.
METHODS: Fifty Sprague-Dawley rats were randomly divided into five groups. Rats in sham operation group were injected with PBS; and those in the other four groups were ligated to establish the model of renal fibrosis. After successful modeling, the model group was injected with PBS, while low dose group, middle dose group and high dose group were injected with 1×10⁷/L, 2×10⁷/L, 3×10⁷/L adipose-derived stem cell suspension (0.1 mL), respectively. Rats were killed 14 days after injection. Hematoxylin-eosin staining and Masson staining were used to observe the degree of renal tubular interstitial injury and the relative area of the renal interstitium. Expression of alpha smooth muscle actin and transforming growth factor beta1 was detected by immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin eosin staining: The model group showed typical glomerular and tubulointerstitial changes; the low, middle and high dose groups had a certain degree of glomerular and tubulointerstitial changes, but the severity of injury in these three groups, especially in the high dose group, was significantly milder than that in the model group. (2) Masson staining: In the model group, the renal interstitium was widened and the collagen fibers were deposited; in the low, middle and high dose groups, the degree of renal interstitial expansion was lower than that in the model group, and moreover, the degree of renal interstitial expansion in the middle and high dose groups was lower than that in the low dose group (P < 0.05). (3) Immunohistochemical staining: Compared with the sham operation group, the expression of alpha smooth muscle actin and transforming growth factor beta1 in the model group was higher than that in the sham operation group (P < 0.05). Compared with the model group, significantly decreased expression of alpha smooth muscle actin was found in the high dose group (P < 0.05) and significantly reduced transforming growth factor beta1 expression was observed in the high, middle, and low dose groups (P < 0.05), especially in the middle and high dose groups. To conclude, exogenous adipose-derived stem cell transplantation can delay the formation of early renal fibrosis in a dose-effect manner, which may be realized by changing the signal pathway state induced by transforming growth factor beta1.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Fibrosis, Transforming Growth Factor beta1, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

吕春燕，李进辉，刘伟伟，陈昌金，吴程，赵梓亦，沈东成. 不同剂量脂肪干细胞移植对早期肾纤维化形成的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4685-4690.

Lv Chun-yan, Li Jin-hui, Liu Wei Wei, Chen Chang-jin, Wu Cheng, Zhao Zi-yi, Shen Dong-cheng. Effect of different doses of adipose-derived stem cells on early renal fibrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4685-4690.

图/表（结果） 2

2.1 动物一般情况 各组大鼠术后均有一定的精神萎靡不振，毛发凌乱无光泽，蜷缩弓背，食欲不振，体质量下降等表现，干预后3 d，高剂量组精神明显恢复，食欲改善，体质量开始增加，而其他各组恢复缓慢，一般情况改善不明显，但各组间体质量比较差异均无显著性意义，见表1。

2.2 肾脏大体改变 假手术组肾脏大小正常，包膜完整、光滑，切面肾皮髓质分界清楚，无扩张、萎缩等；模型组组和低、中、高剂量组肾脏体积明显增大，包膜紧张，切面见肾实质变薄，肾盂肾盏囊性扩张，皮髓质分界不清。

2.3 苏木精-伊红染色及肾小管-间质损伤程度评分 假手术组肾小球、肾小管形态及数量基本正常，间质不扩张，偶见个别淋巴细胞浸润；模型组肾小球略萎缩减少，大部分肾小管可见变性或坏死后再生，远端小管、近端小管及集合管均有不同程度扩张，部分伴有萎缩，蛋白管型偶见，间质充血、水肿明显，伴大量成片淋巴细胞为主的炎细胞浸润，纤维母细胞聚集，伴胶原纤维沉积；低、中、高剂量组均有一定程度的肾小球及肾小管-间质的改变，但程度较模型组明显减轻，偶见蛋白管型，尚可见部分正常肾小管上皮细胞，管腔无扩张，间质充血水肿不同程度减轻，淋巴细胞浸润明显减少，纤维母细胞增生程度也更轻，仅灶区小簇状增生，胶原纤维开始沉积，见图1。

肾小管-间质损伤程度评分，见表2。统计学处理肾小管间质损伤程度评分结果显示，低、中、高剂量组肾小管-间质损伤程度评分低于模型组、假手术组(P < 0.01)，提示脂肪干细胞治疗有效；高剂量组肾小管-间质损伤程度评分低于低、中剂量组(P < 0.01)，低、中剂量组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 Masson染色和肾间质相对面积测定 假手术组在血管周围呈强阳性着色，其他部位无染色；模型组肾小管间质增宽，胶原纤维沉积；低、中、高剂量组肾间质均较假手术组增宽，但比模型组窄，着色程度为模型组>低、中、高剂量组>假手术组(图2)，半定量评分结果见表2，统计学处理结果显示，低、中、高剂量组肾间质相对面积低于模型组(P < 0.05)、假手术组(P < 0.01)，随脂肪干细胞量的增加，肾间质面积有减少的趋势，低剂量组肾间质相对面积高于中、高剂量组(P < 0.05)，中、高剂量组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 肾组织α-平滑肌肌动蛋白表达 各组肾组织α-平滑肌肌动蛋白均有一定表达，假手术组肾α-平滑肌肌动蛋白仅在血管周围呈强阳性表达；模型组α-平滑肌肌动蛋白除了在血管周呈阳性表达，在皮髓质交界及部分髓质肾小管上皮细胞、管周及肾间质还呈强阳性表达；低、中、高剂量组肾小管上皮细胞及肾间质也有明显表达，但范围较模型组窄，染色深度较模型组淡(图3)。

积分吸光度检测结果，见表3，统计学处理结果显示，低、中、高剂量组α-平滑肌肌动蛋白表达高于假手术组(P < 0.05)，高剂量组α-平滑肌肌动蛋白表达低于模型组(P < 0.05)，低、中剂量组与模型组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 肾组织转化生长因子β1蛋白表达 假手术组转化生长因子β1蛋白在肾小管上皮细胞灶区弱阳性表达或不表达；模型组转化生长因子β1蛋白在肾小管上皮细胞尤其在腔面呈强阳性表达；低、中、高剂量组转化生长因子β1蛋白在肾小管上皮细胞有表达，但强度较模型组轻，范围较模型组弱(图4)。

积分吸光度检测结果，见表3，低、中、高剂量组转化生长因子β1蛋白表达低于模型组(P < 0.05)，但高于假手术组(P < 0.05)；低剂量组转化生长因子β1蛋白表达高于中、高剂量组(P < 0.05)，中、高剂量组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机分组，对比观察动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2015年10月在成都中医药大学完成。

1.3 材料

实验动物：六七周龄雄性SD大鼠50只，由成都中医药大学实验动物中心提供，许可证号：川实动管质第8号，体质量(250±20) g，SPF条件饲养；将50只SD大鼠随机分为5组，分别为假手术组、模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组10只。3只4周龄清洁近郊系SD大鼠，体质量100-150 g，由四川大学华西医学实验动物中心提供。

主要试剂和仪器：抗α-SMA、TGF-β1抗体(武汉博士德)；免疫组织化学二抗为羊抗大鼠IgG(Invitrogen)；Masson三色染色试剂盒(北京中杉)；光学显微镜(奥林巴斯CX23)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪干细胞的制备 取3只清洁近郊系SD大鼠腹股沟皮下脂肪，根据以往经验分离、培养脂肪干细胞^[15]，用相差倒置显微镜观察细胞生长方式及形态变化，取第3代细胞，采用流式细胞仪作细胞免疫表型鉴定。收集第4代细胞，用PBS洗涤脂肪干细胞3次后，用PBS配成浓度为1×10¹⁰，2×10¹⁰，3×10¹⁰ L^-¹的溶液，1 mL EP管盛装，-20 ℃冰箱保存备用。静置的脂肪干细胞常沉于EP管底，使用前轻轻摇晃混匀脂肪干细胞。

1.4.2 动物模型的建立及分组干预 10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，将50只SD大鼠局部剃毛，常规消毒铺孔巾，选左腹侧切口，依次切开皮肤至腹腔，游离左肾及输尿管，模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组分别在左侧输尿管近肾盂处和输尿管上1/3处用1号丝线2次结扎，在2次结扎线之间剪断输尿管，然后逐层连续缝合皮肤；假手术组手术方式同模型组，进腹腔后仅将输尿管游离但不结扎离断。

造模成功后，模型组、假手术组立即经尾静脉注射PBS 0.1 mL，低剂量组、中剂量组、高剂量组尾静脉分别注射细胞浓度为1×10¹⁰，2×10¹⁰，3×10¹⁰ L^-¹的脂肪干细胞悬液0.1 mL。干预后14 d处死大鼠，取左肾组织备用。

1.5 主要观察指标

肾组织形态学检测：取左肾腹侧组织，以AAF液(甲醛10 mL+体积分数95%乙醇85 mL+冰醋酸5 mL)固定24 h，石蜡包埋，5 μm连续切片。进行苏木精-伊红染色及Masson染色，按Masson三色染色试剂盒说明书进行操作，光学显微镜下观察。

肾小管-间质损伤评分：参考Radford等^[16]肾间质损伤评分方法，每张标本随机选取皮质区不含肾小球的10个不重复视野(×200)，将肾小管间质病变由8个参数判定，包括肾小管上皮细胞空泡变性、坏死，肾小管扩张，小管萎缩，红细胞管型，蛋白管型，间质水肿，间质细胞浸润，间质纤维化程度，每个参数按0-3分评定。0分为正常，1分为轻度受损，2分为中度受损，3分为重度受损，每个样本小管间质的评分为0-24分，计算10个视野均值，作为该标本的肾间质损伤指数。

肾间质相对面积测定：采用Mizuguchi等^[17]描述的方法，将Masson 染色的每例切片选取10个不重复的200倍视野，以蓝色胶原沉积为阳性信号，计算蓝染面积占整个视野的百分比，评估胶原沉积。0分为正常；1分为轻度受损，病变范围0-25%；2分为中度受损，病变范围25%-50%；3分为重度受损，病变范围≥50%。

肾小管间质α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1免疫组织化学染色及检测：采用免疫组织化学SP法检测α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1表达，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。在光镜下进行α-平滑肌肌动蛋白、转化生长因子β1定位及分布检查。用Image-Pro Plus 6.0进行积分吸光度分析。具体：200倍光镜下随机选取除大血管外10个皮质及外髓视野并拍照，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析棕黄色阳性染色所占的面积百分比，取其均值，作为代表该例组织的阳性单位值。实验结果进行组间对照。

1.6 统计学分析 釆用SPSS 19.0统计软件对所有数据进行分析，结果以x(_)±s表示，样本符合正态分布且方差齐性时，组间比较釆用单因素方差分析的LSD检验；符合正态分布但方差不齐时，采用单因素方差分析的dunnetts检验；以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病共同的病理基础及终末阶段，其发病率逐年增长，治疗费用高昂，给患者家庭及整个社会造成极大的经济压力。迄今为止，除了肾素-血管紧张素转换酶抑制剂、肾素-血管紧张素受体拮抗剂及羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂等少数几类非特异的抗纤维化药物外，能进入临床应用的抗纤维化药物很少^[18-22]。干细胞是目前再生医学领域的研究热点^[23]，在治疗许多急慢性疾病中的疗效已得到广泛认同^[24-25]。由于脂肪干细胞来源稳定、获取容易、免疫原性极低等特点受到更多的关注^[26]。

目前对肾纤维化的形成机制有多种看法，但研究得最多且最深入的看法认为转化生长因子β1及其介导的Smad和/或非Smad通道导致的肾小管上皮细胞-肌纤维母细胞表型转化，引起肌纤维母细胞增生，分泌产生纤维基质沉积于肾间质，导致肾纤维化的发生^[27-28]。而α-平滑肌肌动蛋白是表型转化的重要标记物^[29]。

实验以经典的肾纤维化模型为研究对象^[30]，采用不同剂量的脂肪干细胞对肾纤维化早期形成进行干预，通过对大鼠肾小管-间质损伤程度进行评分、检测肾间质相对面积，对防治纤维化的治疗效果进行评估；同时，通过检测转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白的变化来明确其可能机制。结果发现，高剂量组可改善大鼠一般情况，令体质量较快恢复。与模型组相比，不同剂量脂肪干细胞均可减轻肾小管-间质损伤，降低肾间质相对面积，组间对比结果显示高剂量对肾小管-间质损伤干预作用更强，而中、低剂量组对肾间质相对面积的影响作用更强。转化生长因子β1检测结果显示，模型组大鼠肾组织转化生长因子β1增高，各脂肪干细胞治疗组转化生长因子β1表达也增高，但中、高剂量组转化生长因子β1蛋白表达相对较低，这提示中、高剂量组脂肪干细胞可能在减弱由转化生长因子β1介导的肾纤维化机制中作用更强。α-平滑肌肌动蛋白检测结果显示，模型组大鼠肾组织α-平滑肌肌动蛋白表达明显增高，各脂肪干细胞治疗组α-平滑肌肌动蛋白表达也增高，但高剂量组表达相对较低，这提示高剂量组在延缓肾纤维化方面作用更明显。

综上所述，研究证实了脂肪干细胞对早期肾纤维化有积极的治疗效果，其机制可能是通过抑制致纤维化形成相关因子(转化生长因子β1、α-平滑肌肌动蛋白等)，减轻炎症反应、抑制胶原沉积，延缓肾纤维化的病理进程，拮抗肾纤维化的发生，且此疗效与移植细胞数量相关，3×10¹⁰L^-¹为相对较好的剂量。实验对脂肪干细胞面向临床应用提供理论和实验依据，对预防、治疗乃至最终消除肾纤维化具有重要的经济和社会意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

不同剂量脂肪干细胞移植对早期肾纤维化形成的影响

Effect of different doses of adipose-derived stem cells on early renal fibrosis

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