恒河猴骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.006

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4623-4628.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.006

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恒河猴骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

董婧婧¹，胡竹林¹，李妍¹，孙晓梅²

¹昆明医科大学第四附属医院，云南省第二人民医院眼科，云南省昆明市 650021；²中国医学科学院昆明医学生物研究所灵长类研究中心，云南省昆明市 650018

修回日期:2017-05-19 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 胡竹林，昆明医科大学第四附属医院，云南省昆明市 650021
作者简介:董婧婧，女，1990年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，昆明医科大学在读硕士，主要从事角膜病研究。
基金资助:
云南省应用基础研究面上项目(昆医联合专项)(2013FB109，2014FB074)：恒河猴自体骨髓间充质干细胞在体诱导为角膜内皮样细胞的实验研究，恒河猴自体骨髓间充质干细胞体外诱导分化为角膜内皮样细胞

Culture and identification of rhesus monkey bone marrow mesenchymal stem cells

Dong Jing-jing¹, Hu Zhu-lin¹, Li Yan¹, Sun Xiao-mei²

¹Department of Ophthalmology, No. 4 Affiliated Hospital of Kunming Medical University, No. 2 People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650021, Yunnan Province, China; ²Primate Research Center, Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Kunming 650018, Yunnan Province, China

Revised:2017-05-19 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Hu Zhu-lin, Department of Ophthalmology, No. 4 Affiliated Hospital of Kunming Medical University, No. 2 People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650021, Yunnan Province, China
About author:Dong Jing-jing, Studying for master’s degree, Department of Ophthalmology, No. 4 Affiliated Hospital of Kunming Medical University, No. 2 People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650021, Yunnan Province, China
Supported by:
the Applied Basic Research Project of Yunnan Province, No. 2013FB109, 2014FB074

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
密度梯度离心法：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。

摘要
背景：关于恒河猴骨髓间充质干细胞的研究结果很有限，来自幼年恒河猴骨髓间充质干细胞的分化潜力仍然未知。
目的：探讨体外分离培养的恒河猴骨髓间充质干细胞生物学特性，对其生长曲线和表型进行初步鉴定。
方法：采用密度梯度离心法和全骨髓贴壁培养法提取培养幼年恒河猴骨髓间充质干细胞，利用MTS法绘制第2，7代骨髓间充质干细胞生长曲线，利用流式细胞仪分析法检测第3代骨髓间充质干细胞凋亡及第4代骨髓间充质干细胞表面标志物CD29、CD34、CD45、CD90、CD147表达，检测第3代骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化能力。
结果与结论：①第2，7代骨髓间充质干细胞在培养第一二天为潜伏期，第3-7天为对数生长期，第8天后细胞增殖逐渐减慢，进入平台期，第7代细胞增殖能力弱于第2代；②骨髓间充质干细胞表面标志物 CD90、CD29、CD147呈阳性表达，CD34、CD45呈阴性表达；③流式细胞仪细胞凋亡检测结果显示，73.83%为活细胞，21.76%为死亡细胞，4.27%为凋亡细胞；④骨髓间充质干细胞可诱导分化为成骨细胞与成脂细胞；⑤结果表明，分离培养的恒河猴骨髓间充质干细胞生长活跃，有较强的增殖及多向分化能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2414-2110(董婧婧)

关键词: 干细胞, 间充质干细胞, 恒河猴, 原代培养, 形态学, 分化, 鉴定

Abstract:

BACKGROUND: Studies on rhesus monkey bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are limited, and the differentiation potential of juvenile rhesus monkey BMSCs remains unknown.
OBJECTIVE: To investigate the biological characteristics of rhesus monkey BMSCs isolated and cultured in vitro,
and to identify the growth curve and phenotype of BMSCs.
METHODS: BMSCs from juvenile rhesus monkeys were isolated and cultured by density gradient centrifugation and the whole bone marrow adherence methods. BMSCs at passages 2 and 7 were taken to draw cell growth curves by MTS method. Flow cytometry was used to detect apoptosis of passage 3 BMSCs and to detect expression of cell surface markers, CD29, CD34, CD45, CD90, CD147, in passage 4 BMSCs. Osteogenic and adipogenic abilities of passage 3 BMSCs were also detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The BMSCs at passages 2 and 7 were incubated at first 2 days, logarithmically grew at 3-7 days, and then proliferated slowly at 8 days. The BMSCs at passage 2 showed stronger proliferation than those at passage 7. At passage 3, BMSCs were negative for CD34 and CD45, but positive for CD90, CD29 and CD147. Results from the flow cytometry showed that there were 73.83% living cells, 21.76% dead cells, and 4.27% apoptotic cells. BMSCs could differentiate into osteoblasts and adipocytes under osteogenic and adipogenic induction, respectively. To conclude, BMSCs from the rhesus monkey have strong proliferation and multilineage differentiation abilities in vitro.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Macaca mulatta, Cell Culture Techniques, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

董婧婧，胡竹林，李妍，孙晓梅. 恒河猴骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4623-4628.

Dong Jing-jing, Hu Zhu-lin, Li Yan, Sun Xiao-mei. Culture and identification of rhesus monkey bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4623-4628.

图/表（结果） 1

2.1 恒河猴骨髓间充质干细胞的形态学观察 骨髓间充质干细胞接种于25 cm²培养瓶后，细胞呈圆形，大小不一，悬浮于完全培养液中；24 h后部分细胞开始贴壁，贴壁细胞呈梭形；通过半量换液去除部分未贴壁的杂质细胞，48 h后可见短梭形、星形细胞分散贴壁生长；原代细胞生长缓慢，七八天可见漩涡状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起，培养10 d细胞集落生长(图1)，14 d细胞排列紧密，逐渐融合成片达到80%-90%融合，进行传代培养。

细胞消化传代后，传代细胞24 h完全贴壁生长。细胞呈梭形，生长旺盛，六七天可传代1次(图2)，可稳定连续传代10代以上，细胞形态未见明显变化，6-10代细胞生长速度略微减慢，八九天传代1次。

2.2 恒河猴骨髓间充质干细胞的生长曲线 第2，7代骨髓间充质干细胞在培养第一二天为细胞潜伏期，第3-7天生长曲线基本为线性曲线，表明第3-7天是细胞的对数生长期，第8天后曲线逐渐变得平缓，细胞增殖逐渐减慢，进入平台期；第7代细胞增殖能力弱于第2代(图3)。

2.3 恒河猴骨髓间充质干细胞的凋亡检测 流式细胞仪细胞凋亡分析结果显示，73.83%为活细胞，21.76%为死亡细胞，4.27%为凋亡细胞，见图4，表明骨髓间充质干细胞具有良好的生物学活性。

2.4 恒河猴骨髓间充质干细胞表面标记物的表达 流式细胞仪检测结果表明，第4代骨髓间充质干细胞表面标记物CD90、CD29、CD147呈阳性表达，阳性率分别为98.8%，96.4%，89.7%；CD34、CD45呈阴性表达，阳性率均为0(图5)。重复3次结果一致。

2.5 恒河猴骨髓间充质干细胞诱导分化鉴定

成骨细胞诱导：成骨诱导21 d后茜素红染色，倒置显微镜下显示实验组有大量橘红色结节形成，对照组显示为阴性(图6)。

成脂细胞诱导：成脂诱导24 d后油红O染色，倒置显微镜下显示实验组胞浆内出现大量红色脂滴，形态大小不一，成串排列或围绕细胞核分布；对照组染色后细胞内未见红染脂滴(图6)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞形态学及生物学研究。

1.2 时间及地点 实验于2016年2至7月在中国医学科学院昆明医学生物研究所灵长类研究中心完成。

1.3 材料

实验动物：(12±1)月龄健康幼年恒河猴8只，由中国医学科学院昆明医学生物研究所灵长类研究中心提供，雌雄兼有，体质量(3±1)kg。

主要试剂与仪器：DMEM/F12培养基、澳洲特级胎牛血清(GIBCO公司)；0.25%-EDTA胰蛋白酶、双抗(Merck Millipore公司)；DMSO(Sigma公司)；淋巴细胞分离液(TBD公司)；AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega公司)；凋亡试剂盒、APC Mouse Anti-Human CD45、PE-CYTM Mouse Anti-Human CD29、FITC Mouse Anti-Human CD90、PE Mouse Anti-Human CD147(BD公司)；恒河猴骨髓间质干细胞成骨诱导分化培养基、恒河猴骨髓间质干细胞成脂诱导分化培养基(赛亚生物)；SMZ1500体视显微镜及光学照相系统(日本Nikon公司)；CO₂恒温培养箱(美国Fisher Scientific 公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 恒河猴骨髓间充质干细胞的分离提纯和培养 将恒河猴经空气栓塞处死，用灭菌手术器械取出胫骨和股骨，浸泡于碘伏溶液中15 min后，生理盐水洗涤3-5遍。在超净工作台上用咬骨钳将骨骺端咬断暴露骨髓腔，含6 000 U肝素的DMEM/F12基础培养基冲出骨髓，收集于15 mL离心管中，室温1 000 r/min离心10 min。弃上清加入完全培养基轻轻吹单，制成单细胞悬液，每管缓慢加入淋巴细胞分离液，悬浮于细胞悬液上层，室温2 000 r/min离心30 min。用1 000 mL加样枪吸出中间乳白色单核细胞层，加入完全培养基，室温1 000 r/min离心10 min，弃上清加入完全培养基制成细胞悬液，用细胞计数板计数以10⁷ L^-¹的细胞浓度加入25 cm²培养瓶中，培养于饱和湿度的37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中^[10^，^13-15]。

1.4.2 恒河猴骨髓间充质干细胞的传代培养 提取骨髓间充质干细胞3 d后首次换液，由于骨髓间充质干细胞为分泌细胞，此后每隔2 d半量换1次液。原代培养时生长较慢约14 d达90%融合后，弃完全培养基，PBS轻柔清洗培养瓶底部去除残液，加入37 ℃预热的0.25%-EDTA胰蛋白酶消化30 s，拍打培养瓶后部30 s，加入完全培养液终止消化，常温1 000 r/min离心5 min。弃上清，加入完全培养基吹打均匀，分装到培养瓶中。通过全骨髓贴壁法和严格控制酶的量及消化时间，利用骨髓间充质干细胞易脱落的特点，使骨髓间充质干细胞得到纯化。第2-5代骨髓间充质干细胞传代细胞生长较快，约7 d可达到90%融合，6-10代细胞生长较缓慢，约10 d达到90%融合。

冻存：在消化后的细胞中加入9∶1的预冷血清和DMSO混合液，将细胞吹打均匀移入冻存管中。梯度降温4 ℃ 30 min；-20 ℃ 30 min；-80 ℃过夜；次日沉入液氮。

复苏：在烧杯内装入2/3杯42 ℃温水，从液氮中取出冻存管，迅速置于温水中并不断搅动，使冻存物在1 min内融化，乙醇消毒后于操作台中打开冻存管，将细胞悬液吸入15 mL离心管中，室温1 000 r/min离心10 min，弃上清沉淀加入10 mL培养液清洗残留的DMSO，吹打均匀，再离心10 min，弃上清加入培养基分装到培养瓶中，在培养箱中培养24 h后换液。

1.5 主要观察指标

1.5.1 恒河猴骨髓间充质干细胞的MTS法绘制生长曲线 将生长状态良好的恒河猴骨髓间充质干细胞传代生长至第2代和第7代，接种于96孔板，接种密度为5×10³/孔，培养于饱和湿度的37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中。每日取一板每孔加入MTS试剂20 µL进行MTS检测，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值A值并记录结果。以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。

1.5.2 恒河猴骨髓间充质干细胞的凋亡检测 取第3代骨髓间充质干细胞，待细胞达50%-60%融合后，消化细胞，用PBS洗涤2次，1×Buffer稀释的细胞悬液，取4份10⁵个细胞，分别加入4个12 mm×75 mm Falcon试管中，试管1，2，3，4分别为空白对照组、PI染色组、FITC染色组、双染组，充分混匀后4 ℃避光15 min，进行流式细胞仪分析检测。

1.5.3 恒河猴骨髓间充质干细胞的表面标记物的鉴定 取生长状态良好、纯化率较高的第4代骨髓间充质干细胞，0.25%胰酶消化，室温1 000 r/min离心5 min，弃上清，以完全培养基制成单细胞悬液，以10⁵个骨髓间充质干细胞分装流式管，8个试管依次加入空白细胞对照组，同型阴性对照PE Mouse IgG组，PE Mouse Anti-Human CD34，APC Mouse Anti-Human CD45，PE-CYTM 5 Mouse Anti- Human CD29，FITC Mouse Anti-Human CD90，PE Mouse Anti-Human CD147单克隆抗体，CD29、CD34、CD45、CD90、CD147混合组，振荡器充分混匀，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测分析。并重复做此步骤3次。实验使用抗人单克隆抗体与狒狒、恒河猴、猕猴细胞有交叉反应。

1.5.4 恒河猴骨髓间充质干细胞的诱导分化鉴定

成骨细胞诱导：待生长状态良好、纯化率较高的第3代骨髓间充质干细胞70%融合，0.25%胰酶消化，完全培养基制成单细胞悬液，计数约3×10⁴/cm²细胞，接种在0.1%明胶铺板处理过的6孔板中，37 ℃培养24 h后，弃去完全培养液，实验组1-4孔加入2 mL成骨细胞诱导液，对照组5-6孔加入2 mL完全培养基，每3 d换液1次。21 d后40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，茜素红染色5 min，PBS冲洗3-5次，光学显微镜下观察。

成脂细胞诱导：待生长状态良好、纯化率较高的第3代骨髓间充质干细胞70%融合，0.25%胰酶消化，完全培养基制成单细胞悬液，计数约2×10⁴/cm²细胞，接种于6孔板中，37 ℃培养每3 d换液，细胞100%融合后，弃去完全培养液，实验组1-4孔加入2 mL成脂细胞诱导液，对照组5-6孔加入完全培养液，实验组3 d后更换成脂细胞维持液，24 h后更换成脂细胞诱导液，循环4次后，更换成脂细胞维持液7 d。40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，油红O染色30 min，PBS冲洗3次，光学显微镜下观察。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨髓间充质干细胞来源于中胚层的未分化多能祖细胞，支持造血并分化为间充质谱系^[16]，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞、神经元细胞等分化的潜能^[17-20]，并且来源丰富，异体移植无明显免疫排斥反应^[21]，故而被广泛应用于基础研究和治疗临床疾病，成为现代研究的热点。鉴于骨髓间充质干细胞具有易获得、易培养、低免疫原性、易于外源基因的转入和表达等优点^[2^，^22]，已成为细胞治疗和基因工程治疗临床疾病潜在实用载体^[23-24]。实验采用灵长类动物恒河猴作为实验动物，其结果更加具有实用性，能为临床治疗提供更有意义的参考价值。目前骨髓间充质干细胞移植已成功应用于骨科领域^[24-26]。

密度梯度离心法培养骨髓间充质干细胞的优点是提纯度高，增殖活性强，但其操作相对复杂；贴壁法培养骨髓间充质干细胞操作简单，但提纯度低，细胞增殖速度相对较慢^[27]。研究采用密度梯度离心法联合应用全骨髓贴壁法可提高提纯效率、纯度^[28]。目前采用此种方法分离骨髓间充质干细胞已被广泛应用于鼠、兔、树朐等小型动物，方法较为成熟，未应用于恒河猴，培养恒河猴骨髓间充质干细胞的完全培养基成分为DMEM/F12+体积分数10% FBS+1%双抗，由于原代细胞生长缓慢，待细胞90%融合时，先贴壁的细胞出现老化现象，部分细胞溶解破裂。研究将原代培养的血清浓度提高到15%可加快细胞贴壁生长，缩短原代培养时间，细胞形态和活性更理想，可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞，证实此种方法体外培养的骨髓间充质干细胞多向分化潜能稳定，可作为进一步探讨诱导为角膜内皮样细胞的供体细胞。

恒河猴骨髓间充质干细胞为梭形、星形、偶见蝌蚪形，伸出长短不一、粗细不均的突起。MTS是一种检测细胞活性和生长的方法，在酶联免疫检测仪上通过490 nm波长处测定光吸收值。在一定细胞数量内，MTS结晶形成的量与细胞数目呈正比。研究结果表明细胞生长状态良好，第2，7代恒河猴骨髓间充质干细胞生长曲线呈S形，与正常细胞生长特性相符合，且其倍增时间短，分离培养获得的恒河猴骨髓间充质干细胞在体外生长较活跃，有较强增殖的能力。流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞凋亡结果显示细胞存活率高。证明此种方法分离提纯及培养恒河猴骨髓间充质干细胞是可行的，可作为进一步动物实验的来源。

骨髓间充质干细胞的表面标志物：Dreixler等^[29]研究表明骨髓间充质干细胞表面标记物CD45为阴性，CD90表达为阳性；Jiang等^[16]通过流式细胞仪研究表明，骨髓间充质干细胞的表面标志物CD44、CD105为阳性表达，CD34、CD45、CD11b为阴性表达；Lee等^[18]进一步研究表明CD29、CD44、CD90、CD147阳性率大于96%，CD34、CD45阳性率小于2%。研究采用流式细胞仪对培养的恒河猴第3代骨髓间充质干细胞细胞表面分子进行CD34、CD45、CD29、CD90、CD147等5个表面抗原标志鉴定，结果显示贴壁培养的细胞表现间充质干细胞的特性，CD34、CD45造血干细胞表面标志抗原表达阴性，CD29、CD90、CD147等骨髓间充质干细胞标志抗原表达阳性。

现阶段研究中骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的潜能已被公认，所以诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂细胞被视为一种鉴定方式，Radtke等^[19]研究显示骨髓间充质干细胞可诱导分化为成骨细胞。Jiang等^[16]实验证实骨髓间充质干细胞可诱导分化为成骨细胞和成脂细胞，进一步证实骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能。研究用不同的诱导剂将培养的细胞成功诱导出橘红色结节和红色脂滴，证实为成骨细胞和成脂细胞，说明密度梯度离心法联合应用全骨髓贴壁法分离提取的恒河猴骨髓间充质干细胞具有间充质干细胞的多向分化功能。

总之，利用密度梯度离心法联合全骨髓贴壁培养法可获得数量充足、活性好、形态相对均一、更新速度较快，并具有多能分化潜能的骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面标志物显示细胞的纯度较高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

恒河猴骨髓间充质干细胞的培养与鉴定

Culture and identification of rhesus monkey bone marrow mesenchymal stem cells

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