干细胞治疗缺血性脑卒中的抗炎效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.025

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (25): 4088-4093.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.025

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干细胞治疗缺血性脑卒中的抗炎效应

高凤娟¹，高山峨²，陈旭¹，孙剑³，王俊怡⁴

¹江苏大学附属上海市第八人民医院，上海市 200233；²同济大学医学院，上海市 200092；³解放军第102医院，江苏省常州市 213000；⁴贵州医科大学，贵州省贵阳市 550000

修回日期:2017-03-20 出版日期:2017-09-08 发布日期:2017-10-09
通讯作者: 孙剑，解放军第102医院，江苏省常州市 213000
作者简介:高凤娟，女，1988年生，河北省保定市人，汉族，硕士，主要从事脑血管病研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31601102)

Anti-inflammatory effect of stem cells in the treatment of ischemic stroke

Gao Feng-juan¹, Gao Shan-e², Chen Xu¹, Sun Jian³, Wang Jun-yi⁴

¹Shanghai Eighth People’s Hospital Affiliated to Jiangsu University, Shanghai 200233, China; ²Tongji University Medical School, Shanghai 200092, China; ³the 102^nd Hospital of PLA, Changzhou 213000, Jiangsu Province, China; ⁴Guizhou Medical University, Guiyang 550000, Guizhou Province, China

Revised:2017-03-20 Online:2017-09-08 Published:2017-10-09
Contact: Sun Jian, the 102nd Hospital of PLA, Changzhou 213000, Jiangsu Province, China
About author:Gao Feng-juan, Master, Shanghai Eighth People’s Hospital Affiliated to Jiangsu University, Shanghai 200233, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31601102

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脑卒中治疗中干细胞的局部免疫调节和抑炎作用：脑卒中后原位免疫细胞如小胶质细胞的活化以及外周血液免疫细胞的浸润会引起炎症反应。干细胞的局部免疫调节和抑炎作用主要体现在其分泌因子作用于巨噬细胞，使其发生M1到M2型转化，干预免疫分泌的细胞因子图谱，并对胶质细胞进行抑制和极化等。M1型小胶质细胞或巨噬细胞分泌破坏性的炎性介导因子，而M2型小胶质细胞或巨噬细胞则能够清除损伤的细胞或细胞碎片并分泌营养因子，对组织起到保护作用并且促进预后。

摘要
背景：基础实验已表明，干细胞具有免疫正调节能力和细胞替代功能。
目的：总结干细胞移植治疗缺血性脑卒的抗炎效应，在此基础上进一步讨论其具体的机制。
方法：以“stem cells，stroke，inflammation，immune”为关键词，应用计算机检索2012至2017年PubMed、Elsevier、Springer、Wiley、ovid、EBSCO等数据库中的文献，共搜索到文献110篇，最终纳入47篇文献。
结果与结论：神经干细胞、间充质干细胞、内皮组细胞等干细胞移植治疗缺血性脑卒的抗炎效应，主要包括减少局灶性炎症反应，免疫调节，促进多种神经营养因子的分泌，减少继发性细胞死亡，保护神经元，促进细胞功能恢复进而促进神经功能的恢复。干细胞的局部免疫调节和抑炎作用主要体现在其分泌因子作用于巨噬细胞，使其发生M1到M2型转化，干预免疫分泌的细胞因子图谱，并对胶质细胞进行抑制和极化等。干细胞移植治疗脑卒中的抗炎效应和免疫调节功能亟需深入的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3423-8802(孙剑)

关键词: 干细胞, 移植, 神经干细胞, 间充质干细胞, 内皮祖细胞, 缺血性脑卒中, 炎症, 免疫, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: A large number of preclinical experimental data have shown that stem cells can regulate the immune function, and serve the function of cell replacement.
OBJECTIVE: To summarize the anti-inflammatory effects of stem cells in the treatment of ischemic stroke, based on which, we further discuss the specific mechanisms.
METHODS: We conducted a systematic and comprehensive search in PubMed, Elsevier, Springer, Wiley, Ovid, EBSCO databases. The range of retrieval time was from 2012 to 2017. The keywords were “stem cells, stroke, inflammation, immune”. Totally 110 articles were retrieved initially, and 47 articles were included in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: By reading extensive literature, we analyzed and summarized the research status quo of the anti-inflammatory effects of neural stem cells, mesenchymal stem cells and endothelial cells in the treatment of ischemic stroke. The mechanisms mainly include reducing focal inflammation, immune regulation, promoting the secretion of various neurotrophic factors, reducing secondary cell death, protecting neurons and promoting cell function recovery and further promoting the recovery of nerve function. The mechanisms underlying local immune regulation and anti-inflammatory effects of stem cells are mainly described as the shift from M1 to M2 macrophages under the intervention of stem cell factors, to intervene secreted immune cytokine profiles and exert effects on inhibition and polarization of glial cells. Further investigation is required on the anti-inflammatory effects and immune regulation of stem cell therapy for stroke.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Stroke, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

高凤娟，高山峨，陈旭，孙剑，王俊怡. 干细胞治疗缺血性脑卒中的抗炎效应[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 4088-4093.

Gao Feng-juan, Gao Shan-e, Chen Xu, Sun Jian, Wang Jun-yi. Anti-inflammatory effect of stem cells in the treatment of ischemic stroke[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 4088-4093.

图/表（结果） 1

干细胞移植治疗使脑卒中损伤得到最大程度的修复，是一种科学的医学治疗方法，但其机制尚待更加深入的研究，其中干细胞的抗炎效应和免疫调节功能亟需深入研究，如将其机制解析清晰，对于干细胞用于临床治疗脑卒中会有重要的理论和现实意义。

脑卒中后原位免疫细胞如小胶质细胞的活化及外周血液免疫细胞的浸润会引起炎症反应^[6]。干细胞的局部免疫调节和抑炎作用主要体现在其分泌因子作用于巨噬细胞，使其发生M1到M2型转化，干预免疫分泌的细胞因子图谱，对胶质细胞进行抑制和极化等^[7-9]。M1型小胶质细胞或巨噬细胞分泌破坏性的炎性介导因子，而M2型小胶质细胞或巨噬细胞则能够清除损伤的细胞或细胞碎片并分泌营养因子，对组织起到保护作用并且促进预后^[10-11]。

2.1 神经干细胞 短暂性脑缺血或者再灌注的急性期引发炎症反应，这种炎症伴随着血脑屏障的损害和外周白细胞浸润^[12]。缺血和再灌注可引起促炎细胞因子和趋化因子的上调^[13]。在鼠脑卒中模型中，Huang等^[14]证明了人神经干细胞移植不仅能够通过调节免疫反应降低继发性炎性脑损害，而且还能缓解血脑屏障的渗漏，促进血脑屏障的重建。此机制更加支持其抗炎效应及促进血脑屏障修复和促进神经营养因子的分泌作用，例如主要通过降低炎性因子(如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素1β等)及细胞黏附分子(如细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1等)的表达，并显著抑制小胶质细胞的活化。同时脑内的炎症因子信号会促进移植的人神经干细胞迁移到缺血性梗死损伤区。人神经干细胞除具有潜在的细胞替代作用，还可以表达趋化因子基质细胞衍生因子1，趋化因子基质细胞衍生因子1可被其趋化因子受体CXCR4吸引到脑损伤区^[15]。

Ourednik等^[16]将鼠源神经干细胞移植到小鼠一侧中脑后，发现神经干细胞除了具有细胞替代作用之外，还能起到保护受损但未凋亡的多巴胺能神经元的作用。

对于直接来源于人胚胎干细胞或流产胎儿的神经干细胞因取材有限，不能实现同体移植，且后续的临床应用会有免疫排斥和细胞不纯等原因带来的生物安全隐患问题。人诱导多潜能干细胞来源的神经干细胞克服了以上几点，为后续临床移植提供了可能性。Eckert等^[17]采用RT-PCR技术研究了人诱导多潜能干细胞来源神经干细胞移植治疗鼠脑卒中模型后炎症细胞因子的效应发现在缺血性卒中后48 h，健侧大脑半球炎性细胞因子肿瘤坏死因子a、白细胞介素6 和白细胞介素1b表达增加，相反，人诱导多潜能干细胞来源神经干细胞移植组表达减少，同时，人诱导多潜能干细胞来源神经干细胞移植组与鼠脑卒中模型组比较，细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1基因表达减少，趋化因子表征小胶质细胞/巨噬细胞活化表达显著下调。因此，移植人诱导多潜能干细胞来源神经干细胞可减少炎症和小胶质细胞/巨噬细胞活化相关基因的表达。

2.2 间充质干细胞 间充质干细胞的种类较多，其中研究较多的有骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞等^[18-24]。

已有数据表明间充质干细胞不仅能够有效抑制炎性因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6等的水平，而且还能缓解内质网的压力^[25]。Ren等^[26]也发现干扰素γ与肿瘤坏死因子a、白细胞介素1a、白细胞介素1b中的任何一种炎性细胞因子组合，可诱导间充质干细胞的免疫抑制功能。这些细胞因子刺激间充质干细胞高水平表达趋化因子和诱导型一氧化氮合酶，这两种物质又可以促进T细胞迁移聚集到间充质干细胞附近。Huang等^[27]利用氧糖剥夺应激模型发现间充质干细胞通过分泌白细胞介素6和血管内皮生长因子促进神经元的恢复。Choi等^[28]采用免疫组织化学的方法发现血管内注射间充质干细胞，实验组几乎没有Iba-1⁺细胞，而对照组含有大量的Iba-1⁺细胞，这些结果表明间充质干细胞可能通过减少卒中后活化的免疫细胞来减轻炎症反应。间充质干细胞的免疫正调节或者抑炎作用主要体现在抑制炎症因子白细胞介素10、肿瘤坏死因子α刺激因子6、白细胞介素6的分泌及白血病抑制因子、前列腺素E2等抑制免疫细胞进一步活化的因子的分泌，同时促进免疫细胞分泌干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素α/β刺激干细胞分泌正向调控因子。其中前列腺素E2能够进一步诱导巨噬细胞分泌更多的白细胞介素10，以抑制树状细胞的成熟，从而改变Th1和Th2的平衡^[29-30]。间充质干细胞的这些特性促进卒中后功能的恢复。

Gu等^[31]利用RT-PCR、免疫印记、免疫组织化学等方法分析发现，注射间充质干细胞后促炎因子肿瘤坏死因子a、白细胞介素1b mRNA和P-IkB-a、人磷酸化κB抑制蛋白激酶、p53蛋白等表达大量减少，相反，抗炎因子抑制性卡巴蛋白α、Bcl-2(细胞凋亡相关基因)蛋白表达显著增加，同时也发现注射间充质干细胞组，梗死面积显著减少，因此认为，间充质干细胞通过抑制核因子κB活性发挥抗炎和抗凋亡作用进而起到神经保护作用。

人骨髓间充质干细胞对免疫细胞具有免疫调节功能，不仅抑制异体效应T淋巴细胞的功能，还增加调节性T淋巴细胞的功能和数量，同时促炎细胞因子干扰素γ，增强人骨髓间充质干细胞的免疫抑制特性。人骨髓间充质干细胞还可改变树突状细胞、幼稚型和效应T细胞(TH1和TH2)及自然杀伤细胞的细胞因子分泌，并且可将这些类型的细胞诱导成为一种更抗炎或更耐受的亚型，即人骨髓间充质干细胞通过增加髓源性免疫抑制细胞数量、调节单核细胞免疫抑制表型增强先天性免疫系统的调节能力^[32-33]。此外，有研究者发现，移植的异体人骨髓间充质干细胞使小胶质细胞激活减少，促炎因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1b、单核细胞趋化蛋白1、巨噬细胞炎性蛋白1α)和黏附分子(细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1)表达下降，以及受损的血脑屏障得到改善^[34]。Aggarwal等^[32]也发现机体对人骨髓间充质干细胞缺乏免疫识别和清除功能，异体移植后可显著减少移植物抗宿主病的严重程度和发生率。另有研究表明，损伤后局灶部位的促炎环境的正向调控有助于神经细胞免于进一步损伤。此外，也有研究发现脑卒中损伤后人骨髓间充质干细胞移植通过趋化信号转导通路优先转移到脾，随后来自脾脏的免疫细胞如T细胞进入全身循环系统，引起脾脏质量减少和空洞体积的增加^[35-36]。

人脐带间充质干细胞因其在组织中含量丰富，与人骨髓间充质干细胞相似的特性引起越来越多的重视。Cheng等^[37]发现小鼠脑卒中模型移植人脐带间充质干细胞后神经功能缺损得到改善，脑水肿、脑梗死体积大量减少。人脐带间充质干细胞抑制脑卒中后外周血和梗死区炎症因子包括白细胞介素1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素23、白细胞介素17和白细胞介素10的水平，增加转化生长因子β的水平。在脑卒中后24 h，人脐带间充质干细胞能够明显的降低Th17细胞水平，并且在脑卒中后72 h增加外周血中调节性T细胞水平。因此表明人脐带间充质干细胞通过抑制促炎性细胞因子产生和增强抗炎性细胞因子的表达来逆转炎症，减少损伤。此外，人脐带间充质干细胞还通过增加转化生长因子β水平抑制外周免疫反应，具有神经保护作用^[38]。

人胎盘间充质干细胞除了具有多向分化潜能还具有强大的抗炎效应。人胎盘间充质干细胞与人骨髓间充质干细胞类似，不仅抑制异体效应T淋巴细胞的功能，还增加调节性T淋巴细胞的功能和数量。同时，促炎细胞因子干扰素γ可增强人胎盘间充质干细胞的免疫抑制特性。人胎盘间充质干细胞通过增加髓源性免疫抑制细胞数量，调节单核细胞免疫抑制表型，增强先天性免疫系统地调节能力^[33]。此外，人胎盘间充质干细胞上调暴露于干扰素γ的免疫调节分子人类白细胞抗原(HLA)-G的水平，并抑制介导细胞凋亡的自然杀伤细胞NK/白细胞介素2。由于具有高免疫调节和多潜能特性，人胎盘间充质干细胞对缺血性脑疾病的神经保护和神经再生作用重大。

人羊膜干细胞改善脑卒中预后涉及到局部炎症的减少和免疫反应的调节，进而促进神经恢复，促进神经组织的分化，联系中断的再支配，促进有助于细胞功能修复的细胞因子，生长因子，激素或者神经递质的分泌^[39]。

间充质干细胞的这些特性有助于保护神经元，促进功能的恢复。由于间充质干细胞突出的免疫调节能力和神经干细胞理论上显著的细胞替代治疗作用，两者共移植有望使其各自发挥优势，获得更好的治疗效果。Walker等^[40]提出移植间充质干细胞于损伤区能够激活并改变脑内微环境的原位的神经干细胞池。两者共移植既可增加神经干细胞对白细胞介素6的分泌，还可以减少神经干细胞的凋亡。

2.3 内皮祖细胞 内皮祖细胞治疗缺血性脑卒中的研究已成为了新的热点。已有研究证实，虽然内皮祖细胞治疗缺血性脑卒中有很好的效果，但炎症因子的释放会影响其治疗效应。内皮祖细胞表达白细胞介素6的受体gp80，白细胞介素6依靠剂量依赖的方式促进内皮祖细胞的增值、迁移以及促进基底膜的形成，除此之外，白细胞介素6还能激活受体gp80/gp130信号通路，如下游的ERK-1/2与信号转导和STAT3 的磷酸化^[41]。凝血酶作为一种有效的炎症因子，能够激活并结合于内皮祖细胞表达的具有功能的凝血酶受体PAR-1，此外，凝血酶还可以通过活化蛋白1和核因子κB路径激活白细胞介素8的合成，进而抑制内皮祖细胞的存活^[41]。白细胞介素10通过激活STAT3/VEGF受体途径促进内皮祖细胞的存活。炎症因子肿瘤坏死因子α不仅可以促进内皮祖细胞的凋亡，还可通过短暂性升高细胞质Ca²⁺浓度使早期的内皮祖细胞表达血小板激活因子受体。血小板激活因子与血小板激活因子受体结合，促进p38的分泌，进而抑制内皮祖细胞的存活^[42]。肿瘤坏死因子α还可以促进组织因子表达上调，进而促进重组因子Ⅶ(a)-依赖性的凝血酶生成活性增强，抑制内皮祖细胞的存活促进内皮祖细胞凋亡^[43]。此外，肿瘤坏死因子α还通过TNF-TNFR2/ P75 信号路径抑制早期内皮祖细胞的存活，但却促进晚期的内皮祖细胞存活^[44]。

近年来，在心血管疾病中，因内皮祖细胞与炎症因子的相互作用以及两者之间具有千丝万缕的联系，内皮组细胞可作为炎症标记细胞。此外，临床研究发现用丁基苯酞可以动员患者体内循环系统中的内皮祖细胞，有效促进患者的预后康复^[45]。

2.4 脐血干细胞 脐血中含有多种细胞因子、生长因子和免疫调节因子，调节免疫细胞和成体干细胞的功能和增殖。脐血干细胞移植脑卒中动物模型后发挥抗炎效应，促进功能的恢复^[46]。Vendrame 等^[47]将脐血干细胞静脉注射入缺血性脑卒中动物模型后，发现移植的细胞不仅在梗死区周围发挥作用，还迁移到损伤部位发挥作用，其中还发现CD45/CD11b^-和CD45/B220^-阳性细胞减少的同时，伴随着促炎细胞因子的mRNA和蛋白表达减少及核因子kB的DNA结合活性减少。Yoo等^[46]研究发现脐血干细胞移植1周后，在梗死区周围活化的小胶质细胞数量减少。在脑卒中细胞移植后，脑内炎症反应减弱及增加的神经保护作用促进细胞恢复。

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引言

脑卒中已成为影响现代人健康的亟待攻克的疾病。近10年，特别在发展中国家，脑卒中的发病率和死亡率持续升高，并伴有轻重不一的后遗症，给患者和家庭带来极大的社会和经济负担^[1-2]。缺血性脑卒中是由脑的供血动脉(颈动脉和椎动脉)狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死总称。脑卒中后，伴随一系列进行性和退行性反应，其中炎症反应被激活，并由急性炎症转成慢性长期炎症，导致神经细胞进行性功能退变甚至死亡，由此造成预后偏瘫、行动困难、记忆力丧失等后遗症。临床上，脑卒中引起的创伤主要由缺血再灌注造成大脑实质及与其相关细胞的损伤、神经元联系的中断、血脑屏障的破坏及炎症反应所致^[3]。脑神经细胞的非正常死亡主要涉及以下几个事件：起初，钙离子内流增加，线粒体受损和能量耗竭导致细胞凋亡增加；其次，氧和葡萄糖的耗竭引起谷氨酸兴奋性毒性增加，这两者在细胞死亡中有着重要的作用；再次，一氧化氮、氧自由基以及其他活性氧成分的释放进一步引起神经元的损伤。此外，基质金属蛋白酶和来源于内皮细胞其他蛋白酶的释放，引起血脑屏障障碍、免疫细胞浸润。免疫细胞释放炎症因子导致免疫反应加剧，进而增加脑损伤。炎症会造成脑缺血后组织发生剧烈变化。这种炎症反应不仅会影响梗死区组织，也会导致缺血半暗带的持续受损^[4-5]。同时，血流受阻引起损伤区、损伤区旁侧及海马神经元的退化、变性、凋亡，进一步造成神经细胞的死亡和继发性的神经性退化。

目前，传统的临床治疗包括溶栓治疗、抗血小板和抗凝治疗、神经保护剂、康复治疗等，这些方法的疗效有限且容易受治疗时间窗口期的限制，大部分患者仍有较严重的残疾后遗症。近年来，干细胞移植治疗在动物模型中取得可喜的效果，其中的机制包括移植的干细胞在体内分化为功能性的神经元替代目标细胞，调节局部微环境的炎症因子、营养因子等，调控全身免疫或者炎症反应，促进血管的生成等。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

讨论

综上所述，干细胞因具有良好的旁分泌和分化潜能，已成为细胞治疗的优选材料，大量临床前实验已表明，干细胞具有免疫正调节能力和细胞替代功能，能够与体内细胞相互作用，改善机体细胞的生理功能。同时，由于实验选用的动物模型、移植细胞的时间节点、观察疗效的时间窗口期不同，导致实验数据无法准确比对。大量临床试验已开展，其中干细胞的免疫抗炎效应是讨论的热点问题，抗炎免疫作用对于急性和慢性损伤模型都有重要意义。很多的神经或系统性免疫疾病的发病机制与炎症和免疫有着千丝万缕的联系。何种程度的炎症反应有利于预后也是讨论的热点问题。有文章指出，并非所有的炎症都会导致坏的结果，像M1型胶质细胞或巨噬细胞不利于组织和功能修复，而M2型胶质或巨噬细胞则分泌抗炎因子和营养因子，促进组织修复^[11]。因此，如何让干细胞发挥这种精细的多面手型免疫正调控反应变得非常重要。治疗的窗口期也是试验要探索的重要命题。另外，哪种细胞对哪种炎症如急性炎症和慢性炎症治疗效果更佳，移植的细胞数量多少，移植细胞的方式(包括静脉注射、腹腔注射、原位注射及髓鞘内注射等)，是否几种干细胞联合移植会收到更佳的效果？联合移植的细胞之间会相互削弱各自的功能？等，这些问题需要在以后的临床前和临床试验中给予关注。另外，在抗炎机制方面，不同的干细胞对缺血性脑卒中治疗存在一些共同的问题，主要有以下几点：第一，干细胞来源方面，干细胞因取材有限，不能实现同体移植，且后续临床应用会有免疫排斥和细胞不纯等原因带来的生物安全隐患问题；第二，不同的干细胞在神经修复过程中，是干细胞自身发挥的免疫调节作用还是干细胞在体内分化后分泌的物质参与免疫调节，或者是两者都起作用？第三，不同干细胞治疗缺血性脑卒中的抗炎效应机制还需要更详尽的研究，比如，每种干细胞通过怎样的信号通路发挥抗炎作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

干细胞治疗缺血性脑卒中的抗炎效应

Anti-inflammatory effect of stem cells in the treatment of ischemic stroke

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