聚乙烯亚胺递送miR-218及miR-26a对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.005

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (25): 3964-3970.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.005

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聚乙烯亚胺递送miR-218及miR-26a对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

孙璇¹，魏泽全¹，布文奂¹，方滕姣子²，西洛片多¹，刘麒麟¹，孙宏晨¹

¹吉林大学口腔医院牙发育及颌骨重塑吉林省重点实验室，吉林省长春市 130021；²北京大学口腔医学院，北京市 100034

修回日期:2017-07-24 出版日期:2017-09-08 发布日期:2017-10-09
通讯作者: 孙宏晨，教授，博士生导师，吉林大学口腔医院牙发育及颌骨重塑吉林省重点实验室，吉林省长春市 130021
作者简介:孙璇，女，1994 年生，黑龙江省伊春市人，现就读于吉林大学口腔医学院。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81320108011)；吉林省省级产业创新专项资金项目(2016C044-3) ；吉林省自然科技基金项目(20170101093JC)；大学生创新创业训练计划(2015781125)

Effects of miR-218 and miR-26a on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by polyethyleneimine delivery

Sun Xuan¹, Wei Ze-quan¹, Bu Wen-huan¹, Fang Tengjiaozi², Xiluopianduo¹, Liu Qi-lin¹, Sun Hong-chen¹

¹Dental Development and Jaw Remodeling, Hospital of Stomatology, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China; ²Peking University School of Stomatology, Beijing 100034, China

Revised:2017-07-24 Online:2017-09-08 Published:2017-10-09
Contact: Sun Hong-chen, Professor, Doctoral supervisor, Dental Development and Jaw Remodeling, Hospital of Stomatology, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
About author:Sun Xuan, Dental Development and Jaw Remodeling, Hospital of Stomatology, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81320108011; Jilin Province Industrial Innovation Special Fund Project, No. 2016C044-3; the Natural Science Foundation of Jilin Province, No. 20170101093JC; the Innovation and Entrepreneurship Training Plan for Undergraduates, No. 2015781125

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
微RNAs：是一类存在于真核生物中，长度为19-25个核苷酸的一类小的非编码RNA，通过与靶mRNA序列的3’UTR区或编码区碱基互补配对，导致靶mRNA降解或沉默，在转录后水平调节基因的表达。影响生物体的生长发育，疾病发生等过程。
聚乙烯亚胺：是一种具有良好的生物相容性的非病毒阳离子载体，多项研究表明，PEI能够作为真核细胞基因转染的载体携带目的基因进入靶细胞，具有易于修饰、低毒性、低免疫原性等优点，是当前受到广泛关注的一类非病毒阳离子载体。

摘要
背景：骨髓间充质干细胞因其多向分化潜能广泛应用于组织工程领域，miRNA对于促进骨髓间充质干细胞成骨分化具有重要作用。
目的：探究miR-218和miR-26a对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响，为诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的相关研究及临床应用提供前期依据和选材参考。
方法：提取Wistar大鼠双下肢股骨骨髓，分离培养骨髓间充质干细胞传至第3代备用。miR-218、miR-26a和聚乙烯亚胺(PEI)以特定比例混合孵育形成miRNA/PEI复合物，设立阴性对照组。
结果与结论：①大鼠骨髓间充质干细胞生长状态良好；②MTT法筛选miRNA mimics转染适宜浓度为50 nmol/L；③qRT-PCR检测成骨相关基因碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的mRNA表达水平增高(P < 0.05)；④与空白对照组和阴性对照组相比，碱性磷酸酶染色后胞质均产生了较为明显的着色；⑤茜素红染色出现较多矿化结节。结果显示，以PEI为载体构建的miR-218/PEI复合物、miR-26a/PEI复合物及miR-218+miR-26a/PEI共转染复合物对骨髓间充质干细胞的成骨分化具有一定的促进作用，相同条件下miR-26a成骨能力稍优于miR-218。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1940-5759(孙璇)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 聚乙烯亚胺, miR-218, miR-26a, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, RNA干扰, 转染, 载体, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are widely used in the field of tissue engineering because of their multi-directional differentiation potential. Micro RNAs play an important role in promoting osteogenic differentiation of BMSCs.
OBJECTIVE: To investigate the effect of miR-218 and miR-26a on the osteogenic differentiation of rat BMSCs, and to provide reference for the study on osteogenic differentiation of BMSCs and the clinical application.
METHODS: The bone marrow of the femur of Wistar rats was extracted and the BMSCs were isolated and cultured to the 3rd generation. MiR-218, miR-26a and polyethyleneimine (PEI) were mixed in a specific ratio to form a miRNA/PEI complex. Meanwhile, a negative control group was established.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Rat BMSCs grew well. (2) The optimal concentration of miRNA mimics was 50 nmol/L by MTT method. (3) The expression of alkaline phosphatase and collagen type I mRNA was significantly increased (P < 0.05). (4) Alkaline phosphatase staining showed that compared with the blank control group and the negative control group, the cytoplasm showed obvious coloring. (5) There were a lot of mineralized nodules shown by alizarin red staining. Therefore, miR-218/PEI complex, miR-26a/PEI complex and miR-218+miR-26a/PEI co-transfection complex could promote the osteogenic differentiation of BMSCs. Under the same conditions, the osteogenesis of miR-26a was slightly better than that of miR-218.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: MicroRNAs, Mesenchymal Stem Cells, Polyethyleneimine, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

孙璇，魏泽全，布文奂，方滕姣子，西洛片多，刘麒麟，孙宏晨. 聚乙烯亚胺递送miR-218及miR-26a对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 3964-3970.

Sun Xuan, Wei Ze-quan, Bu Wen-huan, Fang Tengjiaozi, Xiluopianduo, Liu Qi-lin, Sun Hong-chen. Effects of miR-218 and miR-26a on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by polyethyleneimine delivery[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 3964-3970.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞的培养及形态观察 原代骨髓间充质干细胞贴壁后呈短梭形或多角形，可见宽度不均的突起，细胞核大，核仁清晰，细胞大小不一。消化传代至第3代，细胞生长速度加快，形态呈长梭形，排列紧密呈漩涡状，密度达80%-90%(图1)。

2.2 不同浓度miR/PEI复合物转染骨髓间充质干细胞 24 h后对增殖能力影响在浓度10-100 nmol/L时miR-218/PEI组与miR-26a/PEI组细胞增殖率随浓度的增加而有下降趋势，但与空白对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，而与空白对照组相比，100和200 nmol/L miR-218+miR-26a/PEI共转染组细胞增殖率降低(P < 0.01)，其他浓度miR-218+miR-26a/PEI共转染组中细胞增殖率无明显变化(P > 0.05；图2)。

2.3 RT-PCR检测成骨相关基因碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的mRNA表达水平 转染后3，7，14 d时，与空白对照组相比，各组碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原mRNA水平均有升高(P < 0.05)，其中miR-218/PEI组和miR-26a/PEI组最明显(图3)。

2.4 碱性磷酸酶染色及定量测定 成骨诱导7 d后，与空白对照组相比，阴性对照染色面积接近(P > 0.05)，而各组胞质中均产生了较为明显的着色，其中 50 nmol/L miR-218/PEI组与50 nmol/L miR-26a/PEI组胞浆丰富，染色面积和染色程度明显增强，单一转染组碱性磷酸酶阳性细胞比例稍高于共转染组。定量分析也提示miR-26a/PEI组阳性细胞比例稍高于miR-218/PEI组(P < 0.05)，见图4。

2.5 茜素红染色及定量分析 成骨诱导21 d后，茜素红染色结果显示，与空白对照组相比，其他组细胞均不同程度地产生了矿化结节(图5A，B)。其中，miR-26a/PEI组矿化结节密度高于miR-218/PEI组。定量分析结果显示， 50 nmol/L miR-218/PEI组、50 nmol/L miR-26a/PEI组、25 nmol/L miR-218+25 nmol/L miR-26a/PEI组和50 nmol/L miR-218+50 nmol/L miR-26a /PEI组细胞中钙化结节含量明显高于空白对照组(P < 0.01)，其中50 nmol/L miR-26a/PEI组钙化结节含量高于50 nmol/L miR-218/PEI组，提示miR-26a成骨能力优于miR-218 (P < 0.01；图5C)。

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引言

因创伤、肿瘤切除等原因造成的骨缺损的修复治疗是临床的重大难题之一，虽然自体骨移植、同种异体骨移植和人工骨移植等治疗手段应用广泛，但仍存在诸多弊端，供体来源有限，同种异体骨移植植入后感染，迟愈合、骨不连等^[1]，在临床应用中受到了不同程度的限制。

骨髓来源的间充质干细胞是源于骨髓基质的一类具有自我更新、分化为组织功能细胞的能力的成体干细胞^[2]，来源广、取材、分离方便高效，且免疫排斥发生率小，不涉及伦理道德问题，是组织工程学良好的种子细胞^[3]。骨髓间充质干细胞的成骨分化受多种因素影响。

miRNA是参与转录后调控的一类小的非编码RNA，长度为19-25个核苷酸，可以通过与靶基因mRNA的碱基互补配对使其降解或沉默，参与调控细胞信号转导、生长、分化和凋亡，进而影响生物体的生长发育，疾病发生等过程^[4-6]。多项研究证实，miRNA通过多靶点、多途径对骨髓间充质干细胞的成骨分化起到了显著的调控作用^[7-8]。有研究表明, 在MC3T3前成骨细胞和小鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中，miR-218主要能通过下调3种Wnt信号抑制剂：硬骨素、Dickkopf2(DKK2)和分泌型卷曲相关蛋白2的表达水平间接激活Wnt通路，并同时启动一种自放大的正反馈调节，增加miR-218的表达^[9]。另外，Su等^[10]研究发现miR-26a主要通过靶向糖原合成酶激酶3激活骨髓间充质干细胞成骨分化的Wnt信号，促进成骨分化。目前，非病毒阳离子载体聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)因其低毒性、基因转染能力以及共同递送核酸和化疗药物的能力^[11]，被众多研究用于PEI纳米载体的构建，在基因转染过程中发挥作用^[12-14]。

因此作者所在课题组以PEI为载体，构建miR-218/ PEI、miR-26a/PEI、miR-218+miR-26a/PEI复合物，观察miR-218和miR-26a对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年7月至2017年2月在吉林大学口腔医学院实验室完成

1.3 材料

实验动物：雄性健康清洁级Wistar大鼠6只，鼠龄4周，体质量80-100 g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK(吉)2013-0005。

主要试剂与仪器：α-MEM培养基粉、胎牛血清购自美国Gibco公司，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)购自美国Sigma-Aldrich公司，胰蛋白酶粉购自中国宝泰克生物有限公司，青霉素-链霉素购自美国Hyclone公司，β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、PEI(相对分子质量为1 800)购自美国Sigma公司、碱性磷酸酶、茜素红剂盒自美国Sigma-Aldrich公司，MTT粉剂购自宝泰克生物有限公司，SYBR^® Premix Ex Taq^TM购自大连Takara公司，miR-218 mimics、miR-26a mimics购自中国Ribobio公司，酶标仪购自深圳雷杜生命科学技术有限公司，倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司，实时荧光定量PCR仪购自美国安捷伦公司。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离培养 大鼠颈脱臼处死，取双侧股骨，PBS冲洗5次。在无菌超净工作台内去除股骨表面多余组织后剪开干骺端，完整暴露骨髓腔。用5 mL注射器吸取含体积分数20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、链霉素的L-DMEM培养基充分冲洗骨髓腔，至冲洗液变澄清。吹打冲洗液数次后接种于培养皿中，置于37 ℃，体积分数5% CO₂恒温培养箱中静置3 d。3 d后更换培养基，待细胞密度长至80%左右，胰酶消化细胞，按1∶3比例传代。细胞传代后更换为含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基。

1.4.2 MTT法筛选miRNA mimics转染合适浓度 将第3代处于对数生长期的骨髓间充质干细胞以3×10³个/孔的密度接种到2个96孔板中。在37 ℃、体积分数5% CO₂孵箱中培养24 h后更换无血清培养基30 min，设置空白对照组、阴性对照组(100 nmol/L NC/PEI)、miR-218/PEI组(miR-218浓度为10，20，50，100 nmol/L)、miR-26a/PEI组(miR-26a浓度为10、20、50、100 nmol/L)、miR-218+ miR-26a/PEI组(miR-218和miR-26a各自浓度同时为10，20，50，100，200 nmol/L)。用无血清培养基转染骨髓间充质干细胞，每组设置5个副孔。转染4-6 h后更换体积分数10%胎牛血清培养基。转染后24 h，每孔加入20 μL MTT液(5 g/L)，37 ℃孵育4 h，弃上清后加入DMSO 150 μL/孔，轻轻振荡混匀。酶标仪检测490 nm处的吸光度(A)值。细胞增殖率(%)=实验组A值/对照组A值×100%。

1.4.3 实验分组及PEI介导下转染miR-218和miR-26a 设置空白对照组、阴性对照组(50 nmol/L NC/PEI组)、 50 nmol/L miR-218/PEI组、50 nmol/L miR-26a/PEI组、25 nmol/L miR-218+25 nmol/L miR-26a/PEI组，50 nmol/L miR-218+50 nmol/L miR-26a /PEI组。第3代骨髓间充质干细胞接种至6孔板，37 ℃，体积分数5% CO₂孵箱中培养，至细胞密度长至70%左右，保持PEI/miRNA混合物中二者以N/P=10的标准，将PEI与miRNA mimics按照各组浓度以无血清培养基混合，37 ℃恒温箱中孵育30 min后转染细胞，4-6 h后更换含体积分数10%胎牛血清培养基,完成转染过程。每隔3 d瞬时转染1次。

1.4.4 细胞的成骨诱导 将瞬时转染后的细胞培养基更换为成骨诱导培养基(含10 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 mg/L抗坏血酸的体积分数10%胎牛血清L-DMEM培养基)，每隔3 d重复瞬时转染及更换诱导培养基过程，分别诱导3，7，14，21 d。

1.4.5 碱性磷酸酶染色 骨髓间充质干细胞成骨诱导7 d后，按照碱性磷酸酶染色试剂盒说明书，配制柠檬酸-丙酮-甲醛固定液和染色液。固定液固定细胞30 s后去离子水冲洗，避光染色15 min，弃去染色液，去离子水冲洗2次。苏木精复染2 min。PBS冲洗2次后镜下观察。使用ImageJ软件对染色面积比例进行定量分析。

1.4.6 茜素红钙结节染色 骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后，用体积分数95%或100%乙醇(提前4 ℃预冷处理)固定10 min，PBS漂洗2次，加入茜素红染液，于37 ℃孵箱中染色30-45 min。弃去染液后去离子水冲洗，镜下观察。酶标仪测量波长为562 nm时的吸光度值，用氯化十六烷基溶液调零。每个样本重复3次，计算平均值。

1.4.7 qRT-PCR检测成骨相关基因表达 在骨髓间充质干细胞转染后3，7，14 d使用TRIzol reagent提取各组细胞总RNA，调整其浓度为1 g/L，用反转录试剂盒进行反转录。得到的cDNA模板按照real time RT-PCR反应检测成骨相关基因碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的mRNA表达水平。按照SYBR Green Ex Taq体系，以β-actin为内参基因，定量PCR仪检测，采用MxPro软件对结果进行分析。碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原及内参基因β-actin引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞的培养及形态；②不同浓度miRNA/PEI转染后细胞增殖率；③碱性磷酸酶染色情况及定量分析；④成骨相关基因碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的mRNA表达水平；⑤骨基质钙化情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行分析，数据以 x(_)表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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病毒载体介导的基因转染虽应用广泛，但因其免疫原性、转染时间短及体内无法重复使用等问题，应用受到了一定的限制。而非病毒载体具有安全性高、操作简便、重复性好、成本低等独特的优势。在常用的非病毒载体中，脂质体介导的基因转染通过直接与细胞膜融合将基因递送至胞质中，但这种转染方式会使内质膜不稳定，使DNA在胞质中解离，导致转染效率低。而多肽载体的制备条件要求较高，需要经过多个产率较低的分离纯化步骤，获得困难。自Boussif等^[15]在1995年首次利用PEI成功介导寡核苷酸转移以来，PEI作为一种良好的非病毒阳离子基因载体得到了广泛的研究^[16]，近年来被认为是能够进行基因转染的阳离子聚合物最突出的例子之一^[17-18]。Godbey等^[19]早期实验表明PEI聚合物的相对分子质量自600至70 000过程中，PEI与基因的复合物的转染效率随着分子量的增加而升高，而最佳相对分子质量通常在5 000-25 000之间。实验选用相对分子质量为25 000的PEI聚合物，通过MTT法检测不同浓度miR/PEI复合物转染骨髓间充质干细胞24 h后对细胞增殖能力影响，确定基因转染浓度为50 nmol/L，最大程度降低PEI的细胞毒性对实验结果的干扰。

间充质干细胞分化为某种类型的成熟细胞的过程，是由多种转录因子、生长因子、信号通路在分化的不同时期参与调控的过程^[20]。骨形态发生蛋白等细胞因子是骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞形成新骨的重要环节^[21]，近年来研究证实，miRNA已经成为间充质干细胞谱系定向和骨发育的重要调节因子^[22]。一方面，miRNA对于骨形成起到正调节作用。Li等^[23]发现沉默miR-2861的表达，可以降低Runx2蛋白表达量，抑制骨形成，使骨密度减低。后续研究证实，miR-2861通过以组蛋白去乙酰化酶5为靶点，使成骨分化中关键的转录因子Runx2表达增高，促进了成骨细胞的分化^[24]。miR-29b通过结合靶mRNA中的3’-UTR序列，直接降低成骨细胞分化的抑制剂：HDAC4，TGFb3，ACVR2A，CTNNBIP1和DUSP2的表达水平，促进小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞的成骨分化^[25]。另一方面，miRNA也能起到到负调节作用。例如，miR-23a通过以低密度脂蛋白受体相关蛋白5为直接靶点，在人骨髓间充质干细胞的成骨分化中起抑制作用^[26]。CXC趋化因子配体13通过抑制miR-23a表达促进骨髓基质干细胞的成骨分化^[27]。Cao等^[28]证实miR-153属于机械敏感性miRNA，以骨形态发生蛋白Ⅱ型受体的3’-非翻译区为靶点，抑制人间充质干细胞的成骨分化。Zuo等^[29]研究表明miR-103a是第1个被确认通过直接靶向Runx2调节成骨细胞分化的机械敏感性miRNA，其表达的波动对成骨细胞活性和基质矿化具有显著影响。

另外，由于单个miRNA分子潜在靶向作用于多个mRNA，同种miRNA分子对于不同类型干细胞的分化也能产生不同影响。例如：Su等^[10]实验结果显示对于骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞的分化，miR-26a能通过不同的信号传导通路，行使相反的功能。miR-26a通过抑制GSK3β的表达，增加活化的β-连环蛋白的水平，从而激活Wnt信号传导促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。相反，miR-26a能抑制Smad1的表达继而干扰BMP信号传导，起到抑制脂肪组织来源的间充质干细胞的成骨分化的作用。还有研究发现miR-26家族及其下游效应物ADAM17通过促进产热脂肪细胞的功能，在人脂肪细胞分化中发挥作用^[30]。其中miR-26a和miR-26b作为人白色和浅褐色脂肪细胞分化的关键调节因子在脂肪形成的早期表达上调。另外，通过查阅文献，作者发现miR-218对不同细胞的定向分化也有程度机制各不相同的影响^[31]。miR-218可以和成纤维细胞生长因子相继作用，通过调节Wnt信号通路的时序性促进脂肪干细胞的神经元分化。在对小鼠巨噬细胞的研究中^[32]，miR-218能够通过部分抑制p38MAPK-c-Fos-NFATc1信号，阻碍破骨细胞形成和骨吸收。而拮抗miR-218则可以抑制成骨分化^[33]。Sun等^[34]证实miR-218可以靶向作用于分泌型卷曲相关蛋白2以激活Wnt信号通路，从而促进牙周膜干细胞的成骨分化。其促进人脂肪组织来源的干细胞的成骨分化的作用也是通过类似的Wnt信号激活途径^[35]。研究表明，miR-218参与的Wnt/beta-catenin信号的正反馈回路存在于MC3T3-E1与骨髓间充质干细胞细胞中^[9]。另外，miR-218可以靶向作用于BMP/Smad抑制剂TOB1，形成精细的BMP信号和Wnt信号的调节网络，通过多种途径发挥效能。这些结果都证实了miR-26a与miR-218能够在干细胞谱系定向中起到重要的调节作用。

实验结果表明，以非病毒阳离子载体PEI为载体转染miR-218与miR-26a对骨髓间充质干细胞成骨分化都具有一定的促进作用，其中miR-26a成骨能力稍优于miR-218。能够为利用RNA干扰技术诱导骨髓间充质干细胞成骨分化提供理论依据和选材参考。此外，虽然二者都能作用于Wnt信号通路的调节网络，达到促进骨髓间充质干细胞成骨分化的目的，但不排除二者分子机制上存在交叉作用或互为干扰的可能，导致共转染组促成骨效果稍差，但这一观点还有待进一步研究阐明。

聚乙烯亚胺递送miR-218及miR-26a对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

Effects of miR-218 and miR-26a on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by polyethyleneimine delivery

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