突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体对骨髓间充质干细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.004

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (25): 3956-3963.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.25.004

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突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体对骨髓间充质干细胞增殖的影响

张蔚威¹，王钰²

锦州医科大学附属第一医院，¹整形外科，²临床生物样本中心，辽宁省锦州市 121000

修回日期:2017-03-24 出版日期:2017-09-08 发布日期:2017-10-09
通讯作者: 王钰，主治医师，锦州医科大学附属第一医院临床生物样本中心，辽宁省锦州市 121000
作者简介:张蔚威，女，1986年生，辽宁省辽阳市人，汉族，硕士，医师，主要从事整形外科学研究。
基金资助:
辽宁医学院校长基金——临床医学建设专项基金项目资助(XZJJ20140215)

Mutant hypoxia inducible factor 1alpha transfection promotes proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

Zhang Wei-wei¹, Wang Jue²

¹Department of Plastic Surgery, ²Center for Clinical Biological Samples, First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China

Revised:2017-03-24 Online:2017-09-08 Published:2017-10-09
Contact: Wang Jue, Attending physician, Center for Clinical Biological Samples, First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China
About author:Zhang Wei-wei, Master, Physician, Department of Plastic Surgery, First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China
Supported by:
the Principal’s Fund of Liaoning Medical University – Special Fund for Clinical Medical Construction, No. XZJJ20140215

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
构建Ad-CMV-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1双基因单腺病毒系统：构建同时表达具有FLAG抗原标记的HIF1αmu基因和示踪因子hrGFP基因，首先对目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α所携带的HIF1α基因进行了酶切、测序鉴定，并对其内部存在的限制性内切酶位点进行了分析。由于突变后的HIF1αmu基因有自身的翻译终止密码子，并且供体质粒与穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1之间不存在将HIF1αmu基因定向克隆于穿梭质粒相匹配的限制酶切位点，又利用PCR技术复制了CDS区并去除了HIF1αmu基因中翻译终止密码子之后的序列，分别添加NotⅠ和PvuⅠ，并且在PvuⅠ酶切位点后添加碱基G以保证读码框正确。

摘要
背景：目前发现低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1，HIF1α)可提高组织和细胞在缺血环境下继续生存的能力，在促进血管再生方面有重要意义。

目的：构建三点突变型HIF1α联合示踪因子hrGFP双基因重组腺病毒载体Ad-CMV-HIF1α^mu- IRES-hrGFP-1，研究其对骨髓间充质干细胞增殖的影响。

方法：将第3代骨髓间充质干细胞分组培养，实验组以突变基因Ad-CMV-HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1病毒液转染细胞，阳性对照组以未突变基因Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1病毒液转染细胞，阴性对照组以Ad-CMV-IRES-hrGFP-1空病毒液转染细胞，空白对照组不转染任何病毒液。转染72 h后，进行HIF1α基因mRNA及蛋白检测；转染24，48，72，96，120 h，MTT法检测细胞增殖。

结果与结论：①HIF1α基因mRNA检测：实验组、阳性对照组HIF1α基因mRNA表达高于阴性对照组、空白对照组(P < 0.05)，其余组间两两比较差异无显著性意义；②HIF1α蛋白检测：实验组细胞中HIF1α蛋白表达高于阳性对照组、阴性对照组、空白对照组(P < 0.05)，后3组间比较差异无显著性意义；③细胞增殖：阳性对照组与空白对照组细胞生长速度均较慢，两组间相比较无显著性意义；实验组细胞增殖程度高于阳性对照组、空白对照组(P < 0.05)；④结果表明，重组腺病毒介导的三点突变型HIF1α联合hrGFP基因转染骨髓间充质干细胞后，不仅可在常氧条件下持续表达目的蛋白HIF1α，同时也可促进骨髓间充质干细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8641-7856(王钰)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, 低氧诱导因子1α, 基因突变, hrGFP, 病毒载体, 血管化

Abstract:

BACKGROUND: It has been found that hypoxia inducible 1α (HIF1α) gene can improve the ability of tissues and cells to survive in the ischemic environment, which is of great significance in promoting blood vessel regeneration.
OBJECTIVE: To investigate the effect of the recombinant adenovirus Ad-CMV-HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1 on the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were cultured and transfected with Ad-CMV-HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1 virus (experimental group), with non-mutated gene Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP (positive control group), with Ad-CMV-IRES-hrGFP-1 empty virus (negative control group), or with no virus solution (blank control group). After transfection for 24 hours, the expression of HIF1α mRNA and protein was detected. Cell proliferation was detected by MTT assay at 24, 48, 72, 96 and 120 hours after transfection.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Except that the mRNA expression of HIF1α in the experimental group and the positive control group was significantly higher than that in the negative control group and the blank control group (P < 0.05), there was no significant difference between two groups. (2) The expression of HIF1α protein in the experimental group was significantly higher than that in the positive control group, the negative control group and the blank control group (P < 0.05), and there was no significant difference between the latter three groups. (3) Cell proliferation was faster in the experimental group than the positive control group and the blank control group (P < 0.05), and moreover, there was no significant difference between the latter two groups. Our experimental findings indicate that the recombinant adenovirus-mediated three-point mutant HIF1α combined with hrGFP gene transfected bone marrow mesenchymal stem cells could not only express the target protein, HIF1α, under normoxic conditions, but also promote the proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Mesenchymal Stem Cells, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张蔚威，王钰. 突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体对骨髓间充质干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(25): 3956-3963.

Zhang Wei-wei, Wang Jue. Mutant hypoxia inducible factor 1alpha transfection promotes proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(25): 3956-3963.

图/表（结果） 2

2.1 HIF1α基因测序结果 测序显示，供体质粒携带的HIF1α基因与GenBank上登记的HIF1α mRNA序列(NM_001530)完全一致，序列全长为4 082 bp，CDS区序列长度为2 481 bp(405-2 885 bp)，共编码了826个氨基酸。对供体质粒行SmaⅠ单酶切及SmaⅠ/NotⅠ双酶切，与预期结果相符(图1)。对HIF1α基因序列内部的限制性内切酶识别位点分析结果显示，序列内部不含有PacⅠ、PvuⅠ、XhoⅠ及NotⅠ、PmeⅠ、SamⅠ等关键酶切位点。

2.2 HIF1α突变后基因测序结果 测序显示，供体质粒中所携带的HIF1α基因CDS区402位氨基酸由CCA突变成GCA，564位氨基酸由CCC突变成GCC，803位氨基酸由ATT突变成AGC，均为丙氨酸(图2)。

2.3 双基因载体构建结果 电泳显示，腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV-HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1及重组腺病毒突变型真核表达载体pAd-HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1均构建成功(图3，4)。

2.4 HEK293A细胞培养情况 HEK293A细胞从50%汇合到70%汇合约需2 d；显微镜下观察细胞密度大时呈铺路石状并有伪足伸展(图5A)，腺病毒经Lipofectamine 2000转染HEK293A细胞后24 h可见绿色荧光表达，随着时间延长，绿色荧光表达越来越强，可见明显的细胞脱落、变圆等病变效应(图5B-D)。

2.5 骨髓间充质干细胞培养情况 骨髓间充质干细胞原代培养5 d首次换液后，在倒置显微镜下见有长条形细胞贴壁生长，培养至第3代80%汇合，细胞纯度较高、状态饱满、贴壁良好(图6A)；最佳MOI值经计算为100，以MOI=100转染腺病毒后24 h即可见绿色荧光表达(图6B)，48 h后荧光细胞显著增多(图6C)。

2.6 腺病毒滴度测定结果 重组腺病毒Ad-CMV- HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1按终点稀释法测得病毒滴度为1.6×10⁸ pfu/mL，阳性及阴性对照的病毒滴度分别为1.3× 10⁸ pfu/mL和2.0×10⁸ pfu/mL，滴度满足后续实验要求。

2.7 RT-PCR检测结果 实验组和阳性对照组细胞内HIF1α mRNA表达比较差异无显著性意义(P > 0.05)；阴性对照组和空白对照组细胞内HIF1α mRNA表达量非常低，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组、阳性对照组细胞内HIF1α mRNA表达量均明显高于阴性对照组、空白对照组(P < 0.05)，见图7。

2.8 Western blot检测结果 实验组细胞中HIF1α蛋白表达高于阳性对照组、阴性对照组、空白对照组(P < 0.05)，后3组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图8。提示三点突变型HIF1α可在常氧条件下正常且高效表达，有利于促进种子细胞移植后的持续增殖及新血管再生。

2.9 细胞增殖结果测定 阳性对照组及空白对照组的骨髓间充质干细胞生长速度均较慢，两组之间相比较差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组细胞增殖程度快于阳性对照组及空白对照组(P < 0.05)，见图9，说明三点突变型HIF1α可显著提高骨髓间充质干细胞的增殖。

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引言

自体脂肪组织移植是指将患者本人健康部位的脂肪组织移植到缺损部位，使得受损移植区域可达到塑形的疗效。目前自体脂肪移植在临床上已被很广泛地应用于整形烧伤美容等方面^[1-2]。然而，通过长时间的随访观察，移植脂肪组织1年存活率仅为30%-70%。存活率较低的原因是在移植修复后的早期，移植的脂肪和受区之间尚未建立充足的血液供应，只能靠周围局部组织组织液的渗出来提供营养支持，而组织液的渗出距离仅为100-200 μm范围^[3-4]。由此可见在移植后的早期，充分及时的建立缺损区与周围区域的血供网络对于移植脂肪的后期存活是必不可少的。

为解决这一问题，提高移植组织的存活率，多数学者把研究焦点放在了细胞治疗上面，特别是将干细胞作为辅助脂肪移植的相关领域。采用骨髓间充质干细胞辅助自体脂肪进行联合游离移植，被证实为可有效提高移植后局部脂肪组织和细胞生存率。骨髓间充质干细胞是干细胞疗法的最常见种子细胞来源之一，它不仅可向多种细胞组织分化，同时取材方便，培养标准国际化，被认为是细胞辅助脂肪移植的最佳选择^[5-6]。

血管新生过程比较复杂，受到许多生长因子的相互调节，目前发现低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF1)基因可提高组织和细胞在缺血环境下继续生存的能力，在促进血管再生方面有重要意义，因此许多学者认为HIF1基因是个较为恰当的候选基因。在常氧状态下，细胞产生的HIF1α将很快被机体降解(数分钟内)，其机制是HIF1α亚单位CDS区编码826个氨基酸，其中有1个由203个氨基酸(401-603位氨基酸)组成的氧依赖性降解结构域，在脯氨酸羟化酶的催化下，使HIF1α分子氧依赖性降解结构域中的第402，564位脯氨酸残基羟化(该羟化过程必需氧)，羟化修饰后的HIF1α迅速被泛素蛋白酶降解，而在低氧条件下，由于脯氨酸402、564不能被羟化，这一过程被阻断，HIF1α得以积累并转移到细胞核内，在那里激活低氧反应基因群。决定HIF1α的转录活性区位于其羧基端的第803位天冬酰胺，用化学抑制剂或基因重组法阻止其羟化，可导致HIF1α的强烈转录活性。因此，阐明了HIF1α的重要结构区不仅包括氧依赖性降解结构域的脯氨酸402和564，而且还包括了羧基端的天冬酰胺803。研究证实氧依赖性降解结构域丧失的HIF1α，在常氧条件下可促进皮肤形态功能正常的血管新生。正常氧条件下，替代氧依赖性降解结构域的单个脯氨酸564，能产生稳定的蛋白，但转录活性低；替代羧基端区的天冬酰胺803，其转录活性不受影响，但蛋白易分解。那么理论上来说3个氨基酸(包括氧依赖性降解结构域的脯氨酸402)全部被替代应该为HIF1α在常氧下能表达的最大活性^[7-8]。

常用的基因载体包含非病毒和病毒载体2大类。非病毒载体主要为质粒，但弊端较多。目前流行的基因治疗实验研究中病毒载体应用是最多的，尤其以腺病毒载体的应用已达到了成熟的地步，具有一系列的优点^[9-11]。为选择将腺病毒载体作为HIF1α与示踪标记物人源化绿色荧光蛋白(human Renilla reniformis green fluorescent protein，hrGFP)双基因共表达的单一载体提供了有利条件，而且单载体思路可绝对降低转染细胞后病毒的用量。

综上，本着使基础研究的成果服务于临床工作的目的，为了更加直观地研究HIF1α在促血管生成中的作用，实验采用基因突变及转染技术，构建三点突变的HIF1α重组腺病毒表达载体，为了更加直观研究HIF1α在细胞内的表达情况，进而构建Ad-CMV-HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1双基因单腺病毒系统，病毒包装后将其转染骨髓间充质干细胞，稳定表达三点突变型HIF1α和hrGFP基因的骨髓间充质干细胞体系，研究该双基因表达载体在细胞移植过程中的促血管新生作用，进而发挥其促进脂肪移植成活率的作用，为提高成活率提供新的方法和理论依据。

材料方法

1.1 设计 体外细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年1至12月在锦州医科大学附属第一医院脑与脊髓重点实验室完成。

1.3 材料

实验细胞与试剂：含人三点突变型HIF1α基因供体质粒(HIF1α^mu质粒)由锦州医科大学附属第一医院中心实验室提供；HEK293A细胞由锦州医科大学附属第一医院脑与脊髓重点实验室提供；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；pAdEasy-1腺病毒重组试剂盒购自美国Stratagene公司；DNA连接试剂盒、切胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒及RT-PCR试剂盒等购自日本TaKaRa公司；兔抗人HIF1α单克隆抗体等购自美国Santa Cruz公司；超纯质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；干细胞DMEM培养基、特级胎牛血清等购自美国Gibco公司；其他常规试剂及耗材均由锦州医科大学附属第一医院临床生物样本中心提供。

实验动物：三四月龄纯种清洁级新西兰大白兔1只，体质量2.0-2.8 kg，雌雄不拘，由锦州医科大学附属第一医院SPF级实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(辽) 2003-0007，在实验动物操作及处理过程均遵循动物福利要求并获得锦州医科大学附属第一医院实验动物伦理委员会批准。

引物：A，HIF1α测序引物7条；B，HIF1α基因CDS定点突变区引物6条；C，CDS区扩增引物5条；pMD19-T Simple载体两端的引物2条。

引物均由日本TaKaRa公司设计并合成，其中C-F1引物中GCG GCC GC为新添加的NotⅠ酶切位点；C-R1引物中CGA TCG为新添加的PvuⅠ酶切位点。

1.4 实验方法

1.4.1 供体质粒扩增及基因序列分析 将大肠杆菌DH5α化学感受态细胞加入用于转化的pCMV6-XL5-HIF1α质粒 2 μL(10 ng以下)，冰中放置30 min，42 ℃水浴放置50 s。加入37 ℃预温好的SOC培养基，37 ℃、225 r/min振荡1h。涂布LB-氨苄青霉素抗性固体培养基，37 ℃培养18 h。挑选单菌落继续振荡培养14 h。抽提并扩增HIF1α供体质粒。建立SmaⅠ单酶切和NotⅠ/SmaⅠ双酶切体系，37 ℃反应4 h，1%琼脂糖凝胶电泳，鉴定筛选出阳性克隆。HIF1α基因cDNA片段位于pCMV6-XL5-HIF1α供体质粒多克隆位点NotⅠ/SmaⅠ之间，对供体质粒中目的基因进行测序，测序引物分别为A-F、A-R、A-F1、A-F2、A-R1、A-R2和A-R3，共进行7组反应；查找出HIF1α基因序列CDS区的第402，564，803位氨基酸分别为脯氨酸(CCA)、脯氨酸(CCC)和天冬酰胺(AAT)，与GenBank(NM_001530)所示一致。

1.4.2 基因定点突变 以供体质粒为模版，以B-F1、B-F2、B-F3、B-R1、B-R2、B-R3为引物对其进行PCR扩增，之后1%琼脂糖凝胶电泳，以B-F1/B-R3为引物，胶回收后的产物作为模板进行二次PCR扩增，切胶回收约1 800 bp片段，SalⅠ和PstⅠ双酶切后命名为Insert DNA1。将供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α使用限制性内切酶SalⅠ和PstⅠ进行双酶切，37 ℃反应4 h，胶回收约6.2 kb的DNA片段后，命名为Vector DNA。将Insert DNA1和Vector DNA连接后热转化至大肠杆菌DH5α，37 ℃过夜培养。挑选阳性菌落测序验证，完成pCMV6-XL5-HIF1α^mu克隆。

1.4.3 构建穿梭质粒 以pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1穿梭载体和pCMV6-XL5-HIF1α^mu质粒为底物，建立2个NotⅠ/PvuⅠ酶切体系，1%琼脂糖凝胶电泳后回收大小约2.5 kb的HIF1α^mu片段和约8.9 kb的穿梭载体大片段。将两者连接，挑选阳性菌落提取质粒，行NotⅠ/PvuⅠ双酶切鉴定，筛选阳性克隆。

1.4.4 HEK293A细胞培养及传代 对于冻存的HEK293A细胞进行常规复苏和传代，转染前24 h以2×10⁶的密度接种于培养皿中，加入3 mL DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清且不含任何抗生素)，37 ℃、体积分数5%CO₂条件下过夜培养至60%-70%汇合，传代备用。

1.4.5 双基因重组腺病毒载体构建 分别用300 μL OPTI-MEM培养基稀释20 μL Lipofectamine 2000及20 μL穿梭质粒纯化片段，混合后与HEK293A细胞室温孵育20 min，再加入600 μL OPTI-MEM低血清培养基于培养箱中孵育4.0-5.0 h，更换为含体积分数5%胎牛血清的DMEM培养基4 mL继续培养24 h，荧光下观察绿色发光细胞的分布及增殖情况。7-12 d大部分细胞出现细胞病变效应后开始收集并裂解细胞，离心后收集上清称为Ad-CMV- HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1病毒原液，完成包装。

1.4.6 骨髓间充质干细胞的培养及传代 取新西兰大耳白兔，选取双股骨下端内侧为穿刺点，抽取骨髓共4 mL，加入4 mL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，按每瓶1 mL加入到8个25 cm²的培养瓶中，37 ℃、体积分数5%CO₂恒温培养，显微镜下观察细胞生长增殖情况。约10 d后细胞长到80%汇合，吸去生长培养基，用无血清DMEM洗1次，每瓶加入0.25%胰酶1.5 mL消化3-5 min。用吸管吹打制成细胞悬液，800 r/min离心5 min，弃上清，以1∶3比例分装传代，保存备用。预实验诱导分化鉴定可确认是为骨髓间充质干细胞。

1.4.7 病毒滴度测定 取出96孔板，每孔中加入约含10⁴个HEK293A细胞的悬液100 μL，孵育20-24 h使细胞贴壁。实验组将Ad-CMV-HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1病毒原液10 μL作1∶100稀释，浓度即为原病毒液的10^-²，依次作1∶10倍比稀释，加入96孔板。按照公式测定病毒滴度(pfu/mL)= 10(X+0.8)计算每排阳性孔的比率，计算总和X(包括10^-¹、10^-²两种浓度)。阳性对照为携带未突变HIF-1α基因的腺病毒液，阴性对照为未携带任何基因的空腺病毒液。

1.4.8 最佳感染复数MOI测定 取第3代骨髓间充质干细胞，以5×10⁵/孔的密度接种于6孔板，按照公式感染复数= pfu/mL的值×病毒液体积/待转染的细胞数进行计算，取Ad-CMV-HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1腺病毒病毒液，感染复数MOI=50、100、200、300四个梯度值分别转染骨髓间充质干细胞。荧光显微镜下以GFP作为标记物进行示踪，以不引起明显细胞病变效应的最大MOI作为转染的最佳MOI。

1.4.9 骨髓间充质干细胞的转染 取2×10⁵第3代骨髓间充质干细胞，分4组培养：实验组以含突变基因病毒液Ad-CMV-HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1转染细胞，阳性对照组以未突变基因病毒液Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1转染细胞，阴性对照组以空病毒液Ad-CMV-IRES-hrGFP-1转染细胞，空白对照组未转染任何病毒液。

RT-PCR检测HIF1α基因mRNA表达情况：转染72 h，提取4组细胞总RNA，检测A₂₆₀/A₂₈₀，使比值均分布在1.8-2.0之间。反应条件：50 ℃ 30 min，1个循环进行逆转录反应；94 ℃2 min，1个循环；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环进行PCR反应。反应结束后分别取5 μL行琼脂糖凝胶电泳验证，分析各条带吸光度A值，取3次实验的平均相对A值。

Western blot检测HIF1α基因蛋白表达情况：转染72 h，提取各组细胞总蛋白并检测浓度；配制5%浓缩胶与8%分离胶，以60 V×30 min，150 V×1 h为条件进行SDS电泳，电泳结束后分离胶以100 mA×30 min为条件进行转膜操作，以1∶1 500的浓度孵育一抗，4 ℃震荡过夜，孵育二抗及显影液，洗涤3次终止反应，成像系统分析膜上A值，取3次实验的平均相对A值。

细胞增殖情况检测：转染24，48，72，96，120 h后，将各组细胞(实验组、阳性对照组、空白对照组)以2×10³/孔接种于96孔培养板上，继续培养24 h待贴壁后，另行加入15 g/L的MTT溶液20 μL，继续培养4 h弃上清，加入200 μL细胞培养级DMSO，检测490 nm处的吸光度值。

1.5 主要观察指标 双基因重组腺病毒载体Ad-CMV- HIF1α^mu-IRES-hrGFP-1对骨髓间充质干细胞增殖的影响。

1.6 统计学分析 所有实验数据均采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料用x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前治疗组织缺损的方法存在着诸多缺点，例如缺损部位发生坏死和吸收效应，组织量供给不足，供区出现瘢痕等缺陷，因此很多类型的组织缺损目前尚未找到最佳治疗方法。而随着组织工程技术的发展，为该项疾病治疗带来了新的希望。随着目前干细胞移植技术、基因转染技术及组织工程技术的快速发展，使得基因治疗技术在促进缺血组织血管新生方面的研究中取得了较大进步。

随着HIF1α在促血管新生领域的重要作用，使得其在组织工程领域的应用被一致看好。有研究表明HIF1α在促进新血管完整再生、微血管系统的完美形成方面及提高细胞在缺血缺氧环境下的生存能力方面均有着极其重要的作用^[12-24]。但HIF1α仅能在低氧条件下表达并积累，其CDS区中氧依赖性降解结构域中的第402，564位脯氨酸不能被羟化是HIF1α很快再次被降解的主要原因。同时有研究提示HIF1α的转录活性随着803位天冬酰胺的作用而进一步降低^[25-26]。为了能够获得HIF1α在常氧条件下的最强转录活性，实验突变了第402，564和803位氨基酸，并且构建了三点突变的HIF1α重组腺病毒表达载体。

通过细菌内同源重组法构建了重组腺病毒双基因载体。内部核糖体进入位点IRES可使HIF1α被翻译成目的蛋白后，核糖体可以与hrGFP对应的mRNA继续结合，进一步使得目的基因与hrGFP同时表达。由于hrGFP可通过多种荧光检测方法进行检测，因此可作为一种有用的示踪分子，即可以通过荧光强度即时监测目的蛋白的表达情况，又可保持监测中的细胞活性，可继续用于后续实验。FLAG是一种人工合成的小多肽，具有高度特异性的抗体。在其序列内部设计了自己的翻译终止密码子。将目的基因的终止密码子去除后，可使FLAG与目的蛋白融合表达，使其变为目的蛋白的一种抗原成分，这无疑可丰富目的基因的检测手段。与增强型绿色荧光蛋白相比，在各种细胞系中hrGFP的光谱要窄，因此均比增强型绿色荧光蛋白要亮，也更容易被检测，稳定性和毒性也比增强型绿色荧光蛋白要低很多，因此更适合在细胞转染实验中作为报告基因所使用^[27-28]。

为了构建同时表达具有FLAG抗原标记的HIF1α^mu基因和示踪因子hrGFP基因，首先对目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α所携带的HIF1α基因进行了酶切、测序鉴定，并对其内部存在的限制性内切酶位点进行了分析。由于突变后的HIF1α^mu基因有自身的翻译终止密码子，并且供体质粒与穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1之间不存在将HIF1α^mu基因定向克隆于穿梭质粒相匹配的限制酶切位点，又利用PCR技术复制了CDS区并去除了HIF1α^mu基因中翻译终止密码子之后的序列，分别添加NotⅠ和PvuⅠ，并且在PvuⅠ酶切位点后添加碱基G以保证读码框正确。

实验同时还采用了先进的细菌内同源重组法来构建腺病毒载体，显著节省了时间与相关的各项费用^[29-30]。构建载体大部分均是对细菌进行操作，其培养、转化和重组克隆的筛选远较对细胞操作更为方便和快捷，技术也更为成熟，从质粒转化到克隆重组的出现仅需12-20 h即可完成；最重要的是，腺病毒DNA重组后在HEK293A细胞内直接完成包装，不需要再对病毒进行筛选和鉴定，使得获得的病毒滴度更高^[31]。

分析HIF1α基因mRNA和蛋白发现一种有趣的现象，尽管阳性对照组HIF1α基因mRNA表达量明显增加，但在该组的蛋白检测中并没有发现其有任何的增加现象，结果提示阳性对照组或许已增加了HIF1α蛋白的表达量，但增加的HIF1α蛋白由于其CDS区中的氧依赖性降解结构域的存在，使其又随之发生了降解而不能蓄积，进而不能发挥其促血管生成的功能。与阳性对照相比，实验组能在常氧条件下检测到骨髓间充质干细胞内含有较高水平的HIF1α蛋白，说明转染的这种突变的腺病毒真核表达载体在常氧条件下是可高效表达HIF1α蛋白并积累的，因此认为降解对HIF1α表达的影响主要发生在蛋白的翻译水平；三点突变后HIF1α在常氧条件下较之野生型更加的稳定而不被降解。

同时在转染突变后的腺病毒24 h后，发现骨髓间充质干细胞的增殖水平相对于另外两组来说有了一个明显的激增，推测腺病毒承载的突变型HIF1α基因转染骨髓间充质干细胞后，不仅可以持续表达蛋白，同时也能促进骨髓间充质干细胞的进一步增殖，属于双赢，这为在后续实验中将突变型HIF1α联合骨髓间充质干细胞移植入体内促进局部新组织生长奠定了良好的实验基础。

突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体对骨髓间充质干细胞增殖的影响

Mutant hypoxia inducible factor 1alpha transfection promotes proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells

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