不同麻醉方式下经皮针刺旋切制备椎间盘退变模型

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.012

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (24): 3839-3844.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.012

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不同麻醉方式下经皮针刺旋切制备椎间盘退变模型

赖居易¹，何升华¹，孙志涛¹，王业广¹，王建¹，冯华龙²，黄飞强²

¹深圳市中医院骨三科，广东省深圳市 518000；²广州中医药大学第四临床医学院，广东省深圳市 518000

修回日期:2017-03-28 出版日期:2017-08-28 发布日期:2017-08-30
通讯作者: 何升华，硕士，主任医师，研究生导师，深圳市中医院骨三科，广东省深圳市 518000
作者简介:赖居易，男，1989年生，江西省赣州市人，汉族，硕士，主要从事脊柱外科的研究。
基金资助:
深圳市科技计划项目(JCYJ20150401163247232)；深圳市卫生计生系统科研项目(201401066)；广东省科技厅(自筹项目)(2015[110号])；广东省中医药局项目(20162126)

Preparation of intervertebral disc degeneration models by percutaneous acupuncture rotary-cut under different anesthesia methods

Lai Ju-yi¹, He Sheng-hua¹, Sun Zhi-tao¹, Wang Ye-guang¹, Wang Jian¹, Feng Hua-long², Huang Fei-qiang²

¹Third Department of Orthopedics, Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China;²Fourth Clinical Medical College, Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China

Revised:2017-03-28 Online:2017-08-28 Published:2017-08-30
Contact: He Sheng-hua, Master, Chief physician, Master’s supervisor, Third Department of Orthopedics, Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
About author:Lai Ju-yi, Master, Third Department of Orthopedics, Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518000, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Program of Shenzhen City, No. JCYJ20150401163247232; the Science Research Program of Health and Family Planning System of Shenzhen City, No. 201401066; the Self-Financing Project of Science and Technology Department of Guangdong Province, No. 2015[110]; the Project of Guangdong Provincial Bureau of Traditional Chinese Medicine, No. 20162126

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
腰椎间盘退变：1934年Mixter等开始直观地认为，突出的腰椎间盘进入硬膜腔后，直接压迫并刺激神经根，是引发坐骨神经痛等症状的基础。从此，机械性压迫一直是被公认的原因。但研究发现，机械性致痛原理并不能完全囊括该病变的病理生理变化。椎间盘退变与突出过程中的炎症因素包含于机械因素中而起作用，产生腰背痛及下肢神经症状，这样同时也就能够解释为何皮质类固醇激素等药物对该类疾病有一定的治疗作用。目前，虽然尚不能完全确定髓核组织中具体是那一类组织成分或是化学因子导致炎症反应，但普遍认为磷脂酶A2的存在及其活性的改变也是发生腰椎间盘病变的重要因素。
纤维环：位于椎间盘的周缘部，由纤维软骨组成，纤维环的纤维在椎体间斜行，在横切面上排列成同心环状，相邻环的纤维具有相反的斜度，而相互交叉。

摘要
背景：研究发现，不同的麻醉方式对大鼠的平均动脉压、收缩压和舒张压、动脉血pH值以及血液黏度均有明显的影响，但当前针对采用何种麻醉方法进行制备动物模型并未达成一致。
目的：比较采用局部麻醉及全身麻醉方式下经皮针刺旋切制备的兔椎间盘退变模型的有效性。

方法：将48只新西兰大白兔按随机分为局麻组和全麻组，局麻组采用0.5%利多卡因麻醉，全麻组动物予以腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)，2组均采用经皮微创针刺旋切兔L_4/5、L_5/6椎间盘建立椎间盘退变模型。观察2组动物的造模时间，并于造模后4，8，12，16周通过大体观察及MRI检测、组织病理学检查评价椎间盘退变情况。

结果与结论：①大体观察：造模后2组髓核组织颜色逐渐暗且弹性降低；②MRI显示T2 加权像椎间盘信号强度早期均未见明显改变，但信号强度随时间延长呈减弱趋势；③根据Pfirrmann分级法评价椎间盘退变程度：2组动物椎间盘退变程度均随时间延长逐渐加重(P < 0.05)，2组术后各时间点椎间盘退变程度差异无显著性意义(P > 0.05)；④Masson染色显示：造模后8，12周2组纤维环均出现不同程度排列不规整，但结构仍完整，16周后2组纤维环排列紊乱，甚至出现断裂现象，2组间无明显差异；⑤番红O染色示：2组造模后4周髓核细胞均未见明显减少，造模后16周2组髓核细胞均明显减少；⑥造模时间：局麻组平均(15.24± 2.67) min明显要短于全麻组(25.64±6.85) min(P < 0.05)；⑦结果说明，采用局麻和全麻方法经皮微创针刺旋切椎间盘均可成功建立椎间盘退变模型，但是在微创制备兔椎间盘退变模型中采用局麻具有操作时间更短、操作更简单的优点，且其造模效果与采用全身麻醉几乎相同。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-8033-5641(赖居易)

关键词: 组织构建, 组织工程, 脊柱退变, 椎间盘, 体外模型, 动物模型, 兔, 微创, 麻醉, 针刺

Abstract:

BACKGROUND: Different anesthesia methods significantly impact mean arterial pressure, systolic and diastolic blood pressure, arterial blood pH and blood viscosity, but what kind of anesthesia method is more suitable for preparation of animal model does not reach an agreement.

OBJECTIVE: To compare the effectiveness of local anesthesia and general anesthesia for preparation of rabbit intervertebral disc degeneration model in procession of percutaneous acupuncture rotary cut.

METHODS: A total of 48 New Zealand white rabbits were randomly divided into the local anesthesia group and the general anesthesia group. The local anesthesia group was anesthetized with 0.5% lidocaine. The general anesthesia group was intraperitoneally injected with 3% sodium pentobarbital (30 mg/kg). In the two groups, models of intervertebral disc degeneration were established by minimally invasive percutaneous acupuncture rotary cut at L_4/5, L_5/6 levels. Modeling time was observed in both groups. Disc degeneration was evaluated by the gross observation, MRI detection, and histopathological examination at 4, 8, 12, and 16 weeks after modeling.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) General observation: the nucleus pulposus gradually with darker color and elasticity reduced in two groups after modeling. (2) MRI T2-weighted image results showed no significant changes in disc signal intensity at early stage, but the signal strength showed a decreasing trend with time. (3) Disc degeneration was evaluated according to Pfirrmann grading. Disc degeneration was gradually increased with time in two groups (P < 0.05), but there was no significant difference at postoperative time points in both groups (P > 0.05). (4) Masson staining showed that different degrees of annulus irregular arrangement appear in the two groups 8 and 12 weeks after modeling, but the structure was still intact. 16 weeks later, annulus disorganized, or even breakage in the two groups; no significant difference was detected between the two groups. (5) Safranin O staining showed that nucleus pulposus cells were not significantly reduced in the two groups at 4 weeks, but were significantly reduced at 16 weeks. (6) The average modeling time of local anesthesia group [(15.24±2.67) minutes] was significantly shorter than that in the general anesthesia group [(25.64±6.85) minutes] (P < 0.05). These results indicate that intervertebral disc degeneration model can be successfully established by minimally invasive percutaneous acupuncture rotary cut by using local anesthesia and general anesthesia; however, local anesthesia has a shorter operating time and simple anesthetic procedure. The efficacy was identical between the two methods.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Spine, Intervertebral Disk, Models, Animal, Anesthesia, Acupuncture

中图分类号:

R318

赖居易，何升华，孙志涛，王业广，王建，冯华龙，黄飞强. 不同麻醉方式下经皮针刺旋切制备椎间盘退变模型[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(24): 3839-3844.

Lai Ju-yi, He Sheng-hua, Sun Zhi-tao, Wang Ye-guang, Wang Jian, Feng Hua-long, Huang Fei-qiang. Preparation of intervertebral disc degeneration models by percutaneous acupuncture rotary-cut under different anesthesia methods[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(24): 3839-3844.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 实验选用新西兰大白兔48只，分为2组，局麻组造模后至实验结束未出现动物意外死亡，全麻组1只兔在穿刺操作过程死亡，1只兔于造模后1 d死亡(2只兔死亡后均立即按原实验设计进行补充)；进入结果分析48只。

2.2 动物一般情况 2组动物术后2 d四肢活动度好，精神状态恢复至造模前，2组均未见穿刺后并发症发生；局麻组的平均造模时间为(15.24±2.67) min，全麻组的平均造模时间为(25.64±6.85) min，造模时间2组相比较差异有显著性意义(t=6.66，P < 0.05)。

2.3 MRI观察 MRI T2加权像显示2组动物椎间盘信号强度造模后4周未见明显改变，8周后均略有减弱，造模后12，16周信号强度明显降低。2组动物造模椎间盘信号强度均随时间延长呈减弱趋势(图2)。

根据Pfirrmann分级法对2组动物椎间盘退变程度进行统计对比发现，随着观察时间的延长，2组椎间盘退变程度均逐渐加重，但2组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表1。

2.4 椎间盘组织大体及组织学观察 大体观察造模前2组兔髓核外观透亮、含水量高；造模后4周2组穿刺后的髓核颜色稍较造模前暗淡；造模后8，12周时髓核组织含水量减少较明显，并呈淡黄色；造模后16周时髓核含水量显著减少并呈干瘪样(图3)。

组织学观察Masson染色显示2组纤维环在造模后4周呈序列整齐的同心圆形状分层结构；8周后2组染色结果均见部分纤维环排列紊乱，有少量裂隙存在；造模后12周时纤维环排列紊乱明显加重，裂隙增多(图4)；造模后16周时列紊乱程度进一步加重，甚有纤维环不连续现象。番红O染色结果发现2组椎间盘髓核细胞在造模4周后呈紫红色，分布情况均匀；至造模后8周时2组髓核细胞均有略减少；造模后12周髓核细胞染色变淡，分布不均；16周后2组髓核细胞均明显减少，染色更淡。

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引言

椎间盘退变性变是椎间盘组织在多种因素作用下使椎间盘纤维环破坏，髓核组织突出，对腰骶神经产生压迫导致出现相应临床症状和体征的综合征^[1-2],是腰腿痛的主要病因之一，但是针对椎间盘退变性变生理及病理的研究至今仍未十分明确。因此，通过安全有效的方法构建动物模型是进一步研究的重要基础，由于受动物来源、实验经费、操作等方面的限制，采用新西兰大白兔进行动物模型研究越来越广泛的被采用^[3-5]，制备模型的方法主要有通过改变力学特性、椎间盘组织损伤、自然退变。

近年来，随着微创技术的不断发展，经皮穿刺技术也逐渐应用于动物模型制备^[6-7]。吴志强等^[8]通过对SD大鼠的研究发现X射线透视引导下穿刺纤维环可有效建立盘源性疼痛模型。贺庆等^[9]对比经皮纤维环穿刺与经肌间隙纤维环刀刺法制备兔椎间盘退变性变模型证明经皮纤维环穿刺法具有建模时间短，感染率低的优点。然而，对于在制备模型操作过程中，动物该采用局部麻醉还是全身麻醉并未达成共识。采用全身麻醉可获得较佳的麻醉效果，而采用局部麻醉方式具有操作简单、并发症发生率低的优点，尤国兴等^[10]和卢庭婷等^[11]通过对比不同的麻醉方式制备动物模型的研究发现，不同的麻醉方式对大鼠的平均动脉压、收缩压和舒张压、动脉血pH值以及血液黏度均有明显的影响。

因此，本文通过对比局部麻醉及全身麻醉方式下经皮针刺旋切制备的兔椎间盘退变模型，探讨不同麻醉条件下制备兔椎间盘退变模型的有效性，以期为兔椎间盘退变性变模型制备提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3月至2016年1月在北京大学深圳医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：选用48只普通级雄性新西兰大白兔，2月龄，体质量(1.8±0.3) kg，由广东省医学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(粤)2013-0002。均于造模前行X射线及MRI检查以排除先天性脊柱畸形和椎间盘退变兔，标准条件下常规单笼喂养。

试剂与仪器：C臂机(Philips公司)；3.0 T磁共振机(德国西门子公司)；光学显微镜(Olympus公司)；利多卡因注射液(山西晋新双鹤药业有限责任公司)；戊巴比妥钠(美国Sigma公司)；注射用青霉素钠(广州白云山天心制药股份有限公司)；Masson 染色试剂盒(上海博谷生物科技有限公司)；番红O 染色液(北京索莱宝科技有限公司)；4%甲醛液(上海泸震实业有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组 入选48只新西兰大白兔采用随机数表法分为局麻组(n=24)和全麻组(n=24)。

1.4.2 建立模型

局麻组：实验兔行穿刺造模前禁食8 h。动物四肢牢固固定后俯卧于桌面上，软垫垫高腹部。取髂嵴最高点平L₇棘突，并以L₇棘突为定位点相上分别定位L₆、L₅、L₄棘突和关节突，0.5%利多卡因对相应进针部位周围3 cm²范围进行逐层浸润麻醉。取18G穿刺针以右外侧约45°角度进针，C臂X射线机透视下经椎间盘后外侧刺入L_4/5、L_5/6椎间隙(图1)，刺入椎间隙后，手下有落空感，并且针体卡在上下椎体之间，难以移动，再次经C臂X射线机透视证实针尖位于髓核内后采用旋转针体法带动针尖旋切髓核组织，顺、逆时针旋转360°各1次，以促使其退变。在操作过程中保持安静，如果遇到试验动物出现强烈挣扎，则立即停止操作，并对实验兔进行安抚，待实验兔状态良好时再进行下一步操作。后于一侧下肢肌肉注射青霉素钠(40×10⁴ U/只)预防穿刺后感染。

全麻组：实验兔行穿刺造模前禁食8 h。经腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)，动物四肢固定后俯卧于桌面上，软垫垫高腹部。取髂嵴最高点平L₇棘突，并以L₇棘突为定位点相上分别定位L₆、L₅、L₄棘突和关节突，余穿刺等步骤同局麻组。

1.4.3 一般情况 观察2组大白兔造模时间、造模后存活情况、感染发生率、以及四肢活动度、精神状态。

1.4.4 MRI观察 穿刺前及穿刺后4，8，12，16 周分别从各组取5只动物行腰椎MRI检测：MRI检测前禁食、水24 h，动物经腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉后固定于木板上，兔耳内塞入少许棉花以减少噪声刺激，行MRI观察L_4/5、L_5/6椎间盘变化。T2 加权像检查参数：脉冲重复间隔时间/回波时间=3 000 ms/125 ms，层厚为2 mm，层间距=1 mm。

参照Pfirrmann分级法评价椎间盘退变程度：Ⅰ级：椎间盘的结构呈均匀的白色高信号，其椎间盘的高度正常。Ⅱ级：椎间盘的结构呈不均匀的白色高信号；纤维环和髓核的区别比较明显，有或没有水平灰色带；Ⅲ级：椎间盘结构的信号不均匀，中间是灰白的信号强度；纤维环和髓核的区别不明显，椎间盘的高度正常或略微下降；Ⅳ级：椎间盘结构的信号不均匀，呈黑色低信号；髓核和纤维环之间的区别消失，椎间盘的高度正常或适度下降；Ⅴ级：椎间盘结构的信号不均匀，呈黑色低信号；髓核和纤维环之间的区别消失，并有椎间隙的塌陷。

1.4.5 椎间盘组织大体及组织学观察 2组随机取2只穿刺前及穿刺后各时间点经MRI检测的大白兔用耳缘静脉注射空气处死。取背部正中切口暴露L₁_-₇棘突及关节突后剪下L_1-7整个脊柱，取出整个椎间盘。大体观察髓核组织大体含水量、颜色及光泽。观察完毕后置入体积分数4%甲醛固定，常规进行脱水包埋，切片，行纤维环Masson染色和髓核番红O染色，镜下观察变化。

1.5 主要观察指标 两组造模时间、造模后存活率、腰椎间盘组织退变MRI检测及组织病理检测。

1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行分析，造模时间比较采用LSD-t 检验进行比较，等级资料组间比较采用秩和检验，检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

建立椎间盘退变性变动物模型是明确椎间盘退变性变病理机制和治疗研究的重要基础，应用于建立椎间盘退变性变模型的动物通常要求椎间盘应与人类有良好的相似性，模型建立可重复性佳，其次操作性和经济性也是重要的考虑因素^[12]。灵长类动物的生理构造与人类虽然符合有较好的相似性，但是因受动物来源、经费、操作以及伦理道德的限制，灵长类动物较少应用于椎间盘退变性变的实验研究。目前制备椎间盘退变性变动物模型多采用大白兔以及鼠，其具获取、饲养容易及价廉等优点^[13]。椎间盘退变性变动物模型制备方法主要有体外和体内培养两大类^[14]，其中体外模型主要通过建立椎间盘细胞模型和组织块模型，此类方法建立的模型多适用于于细胞方面的研究，但具培养要求高，体内环境模拟条件差的局限性^[15]。体内模型则主要有机械压缩法模型、椎体不稳法模型、椎间盘组织损伤模型^[16]、自然退变模型、基因敲除模型等^[17]。

近年来，经皮微创穿刺术广泛用于制备椎间盘退变性变动物模型。王靖等^[6]采用18G穿刺针从兔皮肤外侧刺入L_3/4、L_4/5、L_5/6椎间盘的纤维环，对比术前及术后3，6，10周的椎间盘变化发现造模后随着时间的延长，造模后的椎间盘在MRI T2WI信号呈明显减弱趋势，免疫组织化学结果也证实造模后椎间盘髓核细胞的数量及Ⅱ型胶原进行性减少，研究结果证实该法可有效制备椎间盘退变性变动物模型。

孔杰等^[18]在CT引导下经皮穿刺纤维环建立恒河猴椎间盘退变性变动物模型,结果发现造模组恒河猴的椎间盘信号在MRI呈弱化趋势，髓核内细胞在苏木精-伊红染色显示造模后细胞数量减少，Masson染色则见各层纤维间出现裂隙，该实验结果表明20G穿刺针可以诱发恒河猴椎间盘的退变，并认为MRI平均信号强度并不是观察椎间盘退变的敏感指标,仍需要组织学进一步证实。

彭俊等^[19]认为普通针头穿刺纤维环虽然是较为公认的理想椎间盘退变性变动物模型制作方法,但是对动物损伤大,操作复杂等缺点，因此其利用C臂机透视辅助下经皮穿刺比格犬腰椎间隙建立椎间盘退变性变动物模型，并成功建立模型，造模的犬椎间盘组织出现了明显退变。

贺庆等^[9]通过对比经皮纤维环穿刺与经肌间隙纤维环刀刺两种方法建立兔椎间盘退变性变动物模型发现，2组椎间隙造模后均见明显变窄，椎间盘MRI信号检测显示均降低，两组在造模的成功率无明显差异，但是经皮纤维环穿刺组手术时间明显要少于经肌间隙纤维环刀刺组，且具有较低的感染率，说明经皮纤维环穿刺制备椎间盘退变性变动物模型具有一定的优越性。

黄杰烽等^[20]最新的一项利用自制穿刺针经皮穿刺纤维环制备兔椎间盘退变性变动物模型的可行性报道同样认为经皮穿刺纤维环法可成功建立兔椎间盘退变性变动物模型,且具损伤小、操作简单及动物存活率高等优点。

本研究结果中，MRI T2加权像显示2组动物在造模后16周造模椎间盘信号明显降低，椎间盘颜色变暗，且在组织学观察中也发现造模后2组动物的髓核含水量均有减少，纤维环染色下见断裂，这些研究结果说明2组均成功制备椎间盘退变性变动物模型。

经皮微创穿刺纤维环建立椎间盘退变性变动物模型相对传统的纤维环切开术具有明显的优势。然而，在造模过程中，不同的研究者往往采用不同的麻醉方式下进行模型制备，研究者往往忽略了麻醉方式对造模动物的结局影响^[21-22]。实验动物麻醉方式主要有吸入麻醉、皮下注射、静脉给药麻醉、腹腔注射、肌肉注射麻醉等^[23]，在建立兔动物模型过程多采用后3种麻醉方法^[24-25]。研究证明，动物采用全身麻醉造模较局部麻醉更易发生意外。采用全身麻醉经皮微创穿刺纤维环建立椎间盘退变性变动物模型虽然在操作过程中动物的意识消失、肌肉松弛、痛觉消失，但是更易对动物的心肺功产生抑制作用而出现造模后动物死亡等其他不良事件发生^[26]。而在局麻条件下，结合C臂机的有效监控，穿刺过程如有偏差，动物便会有刺激性反应，此时穿刺者可适当进行调节穿刺方向及方法，如此可提高造模的成功率。其次，局部麻醉只是对动物的局部肌肉进行浸润麻醉，造模后因麻醉带来的并发症小，对于提高造模后动物的存活率有重要作用^[27]。

在本研究结果中，全麻组有1只动物在穿刺操作过程死亡，1只于造模后1 d死亡，考虑均是因在全麻状态下穿刺过程无动物的及时反馈而造成穿刺失误造成。从造模时间看，局麻组平均造模时间为(15.24±2.67) min，全麻组为(25.64±6.85) min，局麻组的造模时间要明显短于全麻组，2组的造模方法均为经皮针刺旋切椎间盘法，说明在采用同一制备方法，局部麻醉动物较全麻效率更佳。

综上所述，经皮微创针刺旋切椎间盘是制备椎间盘退变模型的有效方法^[28-35]，采用局部麻醉动物和全身麻醉的条件下经皮微创针刺旋切椎间盘均可成功建立椎间盘退变模型，但是采用局麻是操作时间更短，操作更简单的造模方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

不同麻醉方式下经皮针刺旋切制备椎间盘退变模型

Preparation of intervertebral disc degeneration models by percutaneous acupuncture rotary-cut under different anesthesia methods

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