建立兔脊髓缺血再灌注损伤模型PDIA3的表达变化及临床意义

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.013

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (24): 3845-3850.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.24.013

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建立兔脊髓缺血再灌注损伤模型PDIA3的表达变化及临床意义

李春旭，张善勇，齐治平，夏鹏，潘肃，昝春芳，杨小玉

吉林大学第二医院骨科，吉林省长春市 130041

修回日期:2017-05-23 出版日期:2017-08-28 发布日期:2017-08-30
通讯作者: 昝春芳，硕士研究生，吉林大学第二医院骨科，吉林省长春市 130041；并列通讯作者：杨小玉，主任医师，教授，博士生导师，吉林大学第二医院骨科，吉林省长春市 130041
作者简介:李春旭，男，1991年生，吉林省长春市人，汉族，吉林大学临床医学在读硕士，主要从事脊柱外科的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(31572217, 81350013)；吉林省科技型中小企业技术创新基金(SC201502001)；吉林大学研究生创新基金资助项目(2017176)

Expression and clinical significance of protein disulfide-isomerase A3 in a rabbit model of spinal cord ischemia/reperfusion injury

Li Chun-xu, Zhang Shan-yong, Qi Zhi-ping, Xia Peng, Pan Su, Zan Chun-fang, Yang Xiao-yu

Department of Orthopedics, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin Province, China

Revised:2017-05-23 Online:2017-08-28 Published:2017-08-30
Contact: Zan Chun-fang, Master, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin Province, China; Yang Xiao-yu, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin Province, China
About author:Liu Chun-xu, Studying for master’s degree, Department of Orthopedics, the Second Hospital of Jilin University, Changchun 130041, Jilin Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31572217 and 81350013; the Technology Innovation Foundation of Small and Medium-Sized Technology-Based Enterprise in Jilin Province, No. SC201502001; the Innovation Foundation for the Graduate in Jilin University, No. 2017176

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脊髓缺血再灌注损伤：脊髓长期受到压迫形成了慢性缺血缺氧状态，通过减压术解除脊髓压迫，而后脊髓血液灌注较术前迅速增加，但是由于氧自由基、原发性缺血缺氧损伤和细胞内钙离子超载等损伤机制，脊髓发生缺血再灌注损伤进而导致“二次瘫痪”，因此脊髓缺血再灌注损伤的预防及治疗对于改善减压术患者预后具有重要意义。
未折叠蛋白反应：细胞凋亡只在长时间过强的内质网应激下发生，而适量应激则通过提高蛋白折叠能力、抑制蛋白合成来适应应激，称为未折叠蛋白反应。

摘要
背景：目前认为脊髓缺血再灌注损伤是造成脊髓减压手术后“二次瘫痪”的主要原因，而控制应激相关蛋白和兴奋性氨基酸对脊髓缺血再灌注损伤的治疗至关重要。
目的：观察蛋白质二硫键异构酶A3(PDIA3)在兔脊髓缺血再灌注损伤后表达变化。
方法：依据Zivin法建立兔脊髓缺血再灌注损伤模型，将36只新西兰白兔随机均分成6组，对照组只显露腹主动脉而不阻断血流，30 min后关闭腹腔；实验组阻断腹主动脉血流30 min后分别再灌注0，6，12，24，48 h再关闭腹腔。首先均利用改良Tarlov评分进行运动功能评价；随后取损伤段腰髓(L₃-L₅)，结合荧光差异双向凝胶电泳和质谱分析筛选出PDIA3；其次应用免疫印迹印证质谱；最后通过免疫组织化学结果观察其在脊髓内的时间和空间表达变化特点。
结果与结论：①运动功能评分结果：实验动物于脊髓缺血再灌注损伤发生后均可见后肢功能逐渐好转现象，评分结果为缺血再灌注24 h达最高水平，48 h又略有下降；②免疫印迹结果：对照组 PDIA3表达有清晰印迹显示，缺血再灌注0 h印迹轻度增强，6-12 h进一步增强，24 h显著减弱至最低水平，48 h再次升高到6-12 h水平；③免疫组织化学结果：神经元胞浆中可见PDIA3表达，且中间神经元表达量明显多于运动神经元；④结果表明：脊髓缺血再灌注损伤发生发展过程中PDIA3异常上调，说明PDIA3与脊髓缺血再灌注损伤密切相关，可作为其诊断和治疗的新靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9455-874X(李春旭)

关键词: 组织构建, 组织工程, 脊髓缺血再灌注损伤, 蛋白质二硫键异构酶A3, 应激, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: At present, spinal cord ischemia/reperfusion injury is considered as the main reason for “secondary paralysis” after spinal decompression, and to control the levels of stress-related proteins and excitatory amino acids plays an important role in the treatment of spinal cord ischemia/reperfusion injury.

OBJECTIVE: To investigate the expression level of protein disulfide-isomerase A3 (PDIA3) after spinal cord ischemia/reperfusion injury in rabbits.

METHODS: Thirty-six New Zealand white rabbits were enrolled, the models of spinal cord ischemia/reperfusion injury were established using Zivin’s method, and were then randomized into six groups (n=6 per group). The rabbit abdominal aorta in control group was exposed without vascular occlusion and then the abdominal cavity was closed 30 minutes later. In experimental groups, the abdominal aorta was blocked for 30 minutes, followed by 0, 6, 12, 24 and 48 hours of reperfusion, and then the abdominal cavity was closed. The neurological function was evaluated with a modified Tarlov score. The L₃_-₅lumbar vertebrae were removed, and PDIA3 was screened by two-dimensional fluorescence differential gel electrophoresis combined with mass spectrometry, and then its temporal and spatial changes in the spinal cord were detected by western blot assay and immunohistochemistry.

RESULTS AND CONCLUSION: The function of hind limbs was improved in all the experimental groups after spinal cord ischemia/reperfusion injury, and the modified Tarlov scores reached the peak at 24 hours after schemia/reperfusion injury, and decreased slightly at 48 hours. The expression of PDIA3 in the control group showed clear imprinting, which was slightly strengthened at 0 hour, became more strengthened at 6-12 hours, significantly reduced to the minimum level at 24 hours, and returned to the level of 6-12 hours at 48 hours after ischemia/reperfusion. Immunohistochemical results showed that there was visible PDIA3 in the cytoplasm of neurons, and the expression level in the interneurons was significantly higher than that in the motor neurons. These results suggest that upregulated PDIA3 appears in the development and progression of spinal cord ischemia/reperfusion injury, indicating that PDIA3 is closely related to spinal cord ischemia/reperfusion injury, which can be used as a new diagnosis and treatment target.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Spinal Cord, Ischemia, Reperfusion Injury, Protein Disulfide-Isomerases

中图分类号:

R318

李春旭，张善勇，齐治平，夏鹏，潘肃，昝春芳，杨小玉. 建立兔脊髓缺血再灌注损伤模型PDIA3的表达变化及临床意义[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(24): 3845-3850.

Li Chun-xu, Zhang Shan-yong, Qi Zhi-ping, Xia Peng, Pan Su, Zan Chun-fang, Yang Xiao-yu. Expression and clinical significance of protein disulfide-isomerase A3 in a rabbit model of spinal cord ischemia/reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(24): 3845-3850.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验选用新西兰白兔36只，分为6组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 运动功能评分 对照组和实验组缺血再灌注0 h组动物苏醒前即被处死，未进行评分；其他组动物在清醒状态下后肢均全瘫并随着时间双侧后肢均逐渐出现活动以及对疼痛刺激作出反应。缺血再灌注6 h组和缺血再灌注24 h组比较(P < 0.05)，差异有显著性意义(见表1)。实验动物在脊髓缺血再灌注损伤发生后均可见后肢功能逐渐好转现象，评分为再灌注24 h达最高水平，48 h又略有下降。

2.3 PDIA3免疫印迹研究结果 对照组PDIA3表达有清晰印迹显示，缺血再灌注0 h印迹轻度增强，缺血再灌注6-12 h进一步增强，缺血再灌注24 h显著减弱至最低，缺血再灌注48 h则回到缺血再灌注6-12 h水平(图1)。

2.4 PDIA3免疫组织化学研究结果 对照组中间神经元及前角运动神经元可见轻度免疫反应(+)，后角神经元未见免疫反应(见图2A)；缺血再灌注0 h组中间神经元及前角运动神经元免疫反应强度未变但后角神经元出现轻度免疫反应(+) (见图2B)；相比之下，缺血再灌注6 h组神经元免疫反应增强至中度(++)，后角神经元仍为轻度(+)(见图2C)；缺血再灌注12 h组中间神经元免疫反应明显增强(+++)，前角运动神经元免疫反应不明显(见图2D)；实验组缺血再灌注24 h组神经元免疫反应明显减轻，中间神经元免疫反应下降至对照组水平以下(+)，前角运动神经元

免疫反应减轻(+)而后角神经元免疫反应消失(-)(见图2E)；缺血再灌注48 h组神经元免疫反应强度与缺血再灌注6 h组水平相近(++)，明显可见中间神经元免疫反应增强(++)(见图2F)。

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引言

中国现已处于高度老龄化社会，而脊髓压迫性疾病发生率随年龄增长呈递增趋势，老年人为罹患此病最大群体。目前认为对于脊髓损伤尚无有效治疗措施，也仅有0.4%的脊髓损伤病例在出院时完全康复^[1]。虽然近期出现了类似远端缺血预处理这种预防缺血再灌注损伤的新方法^[2]，但脊柱减压手术仍是现今最常用方法，在行减压手术后部分病例可有短暂的神经功能恢复，而后逐渐出现神经功能恶化的现象，即“二次瘫痪”。而脊髓缺血再灌注损伤则被认为是脊柱减压手术后“二次瘫痪”的主要原因。

脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)是指去除如黄韧带、后纵韧带增厚骨化、椎间盘突出所致椎管狭窄或椎管内肿瘤逐渐增大压迫脊髓等导致脊髓缺血的因素后，脊髓的神经功能不但没有改善，反而进一步加重的一种继发性损伤，通常损伤平面以下感觉和运动缺失，更有甚者出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象^[3-6]。在1911年Allen^[7]首先描述，多于脊柱外科及胸腹主动脉瘤修复手术后发生^[8-10]，严重者可导致截瘫、全瘫，发生率达1%-32%^[11]，有些甚至死亡，严重影响着患者的生存质量。

蛋白质二硫键异构酶A3(Protein disulfide isomerase family A member3，PDIA3)^[12]，又名 P58，ER60，ER57，ERp60，ERp61，GRP57，GRP58，PI- PLC，HsT17083，是一种包含4个硫氧还原蛋白区域的应激相关蛋白。作为内质网腔中重要的分子伴侣^[13]，在其协助下可将新生多肽转运出内质网并送到特定位置。1988年Bennett等^[14]首次将PDIA3基因的互补DNA编码链从不同物种中分离出来。

脊髓缺血再灌注损伤虽致病过程简单，但损伤机制因异常复杂而尚不明确，例如血脊髓屏障的破坏等机制在不断研究中^[15-17]，脊髓缺血再灌注损伤对脊髓明显是一种应激性损害^[18-20]。细胞内应激相关蛋白的表达对于抵御应激压力^[21-22]，防止神经细胞死亡，恢复正常神经功能十分关键。然而目前对于脊髓缺血再灌注损伤的治疗结果并不理想^[23]，因此研究应激相关蛋白PDIA3在脊髓缺血再灌注损伤后表达变化对于探索其防治措施具有重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年1月至5月在吉林大学公共卫生学院动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 36只成年4-6月龄新西兰白兔，体质量2.5-3.0 kg，由吉林大学基础实验动物中心提供，许可证编号：SCXK-(吉)2010-0006。将36只新西兰白兔随机均分6组，每组6只：分别为对照组，缺血再灌注0 h组、缺血再灌注6 h组、缺血再灌注12 h组、缺血再灌注24 h组、缺血再灌注48 h组。

1.3.2 主要试剂与仪器 SP免疫组织化学试剂盒购自美国Santa Cruz公司；ECL Plus试剂盒美国Thermo公司；Anti-PDIA3(bs-1476R)、β-Actin(内参抗体)、二抗山羊抗兔IgG均购自中国博奥深公司；紫外检测仪Uvicord SⅡ(美国Pharmacia)；稳流电泳仪(POWER PAC 200型，美国Bio-Rad)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立脊髓缺血再灌注损伤兔模型 依据Zivin法^[24]建立36只脊髓缺血再灌注损伤兔模型。对照组只显露腹主动脉而不阻断血流，30 min后关闭腹腔；实验组(0 h组、6 h组、12 h组、24 h组、48 h组)分别阻断腹主动脉血流30 min后停止夹闭再灌注0，6，12，24，48 h关闭腹腔。所有组分别采用改良Tarlov评分进行运动功能评价，3人单盲评分，取3人评分均值记录。

1.4.2 取材 将取出的损伤段腰髓(L₃-L₅)迅速存于-80 ℃深低温冰箱，留作备用。保持在低温下粉碎后依次加入蛋白酶抑制剂、裂解液，充分匀浆10次再行超声处理后提取蛋白，最后于-80 ℃保存。

1.5 主要观察指标

1.5.1 结合荧光差异双向凝胶电泳和质谱分析 质谱要求研究电泳结果差异在2倍以上的蛋白，差异点由对比荧光标记获得。NCBI兔蛋白库和物种全蛋白库利用基于MASCOT算法的检索平台分别检索，筛选出脊髓缺血再灌注损伤前后显著差异表达的PDIA3。

1.5.2 应用免疫印迹印证质谱 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为高分辨率，用其分离提取蛋白样品，随后转移至转印膜，应用特异性抗体结合转印膜上的抗原，再结合酶或同位素标记的二级抗体，通过放射自显影技术分析结果。

1.5.3 应用免疫组织化学研究PDIA3在脊髓内的时间和空间表达变化特点 取损伤段腰髓(L₃-L₅)石蜡标本制成纵向连续切片，应用Anti-PDIA3(bs-1476 R)和山羊抗兔IgG(二抗)(均购自中国博奥深公司)、SP免疫组织化学试剂盒、DAB显色(美国 Santa Cruz公司)进行免疫组织化学检测。按照说明书进行相应实验步骤。严格执行双盲阅片，由2位经验丰富的病理医师分别对镜下阳性细胞百分比和染色强度给予评分，阳性等级则为两者计分相乘。

1.6 统计学分析 所有计量资料以x(_)±s表示，采用SPSS 21.0统计软件进行分析，运用t 检验进行评价，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

脊髓直接受损部位的组织被破坏造成出血、坏死等属于原发机械损伤。而脊髓缺血再灌注损伤是继发性损伤,同时神经组织和轴突的再生也在继发性损伤中受到损害^[25]。原发性损伤通常无法人工挽回，而继发性损伤可通过药物等方法恢复部分脊髓功能。近年来细胞凋亡在脊髓继发性损伤研究中占有重要地位^[26-27]，而新发现了内质网应激也可启动凋亡信号传导。内质网应激即内质网功能失调，通常在缺氧、Ca²⁺耗竭、蛋白质糖基化抑制和转运异常等刺激下产生^[28]。细胞凋亡只在长时间过强的内质网应激下发生，而适量应激则通过提高蛋白折叠能力、抑制蛋白合成来适应应激，称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)^[29]。所以通过控制应激相关蛋白来避免过度应激则成为治疗脊髓缺血再灌注损伤的新途径。

在研究中，免疫印迹和免疫组织化学结果均显示对照组PDIA3在神经元内表达丰富，说明PDIA3在神经元的正常生理活动中发挥重要作用。经过30 min缺血氧和葡萄糖含量在脊髓中降低，而PDIA3在灰质中部中间神经元和前后角神经元表达增强，说明缺氧及低血糖能够诱导脊髓神经元PDIA3表达增加，而PDIA3亦能减轻内质网应激压力，提高神经元缺血耐受能力。再灌注后PDIA3表达逐渐增强，再灌注12 h表达至顶峰，说明再灌注后虽脊髓供氧恢复，脊髓内葡萄糖增加，但PDIA3表达仍进一步增加。即细胞内免疫反应随着再灌注时间逐渐增强，于12 h至脊髓缺血再灌注损伤早期高峰。

既往研究表明，PDIA3表达上调主要由细胞内钙离子失衡以及细胞内质网内蛋白质转运和分泌障碍导致^[30]。故推测本实验中脊髓缺血再灌注损伤后形成钙离子超载、内质网蛋白质转运和分泌障碍，从而使PDIA3表达上调。再灌注12 h后神经元内PDIA3表达减少且运动神经元明显减少，故其表达降至最低。随时间进展PDIA3表达又逐渐增加，于再灌注48 h恢复至6-12 h水平。整个变化过程中，灰质中部中间神经元表达量始终高于前角运动神经元。脊髓后角体积较小神经元表现出对诱导因素反应敏感的特点，即缺血后即刻调高表达。

Yamauchi等^[31-32]研究表明前角运动神经元的易损性与其内质网的应激反应相关。作为内质网腔中重要的分子伴侣PDIA3，其表达增加既能降低内质网应激压力又可确保内质网蛋白的正确折叠。在脊髓缺血再灌注损伤发生时大量异常未折叠或错误折叠的蛋白质出现于神经元内产生细胞毒性^[33-34]，而PDIA3能减少此类蛋白积聚来保护神经元。亦有研究表明脊髓缺血再灌注损伤使前角运动神经元产生的未折叠蛋白质多于中间神经元^[35]。所以本研究推测前角运动神经元易损的原因之一可能是PDIA3表达相对不足。而相关研究证实PDIA3高表达不仅能够保护神经细胞对抗羊搔痒症相关朊毒性及内质网应激介导的细胞凋亡^[36-37]，还能减少冰毒介导的细胞内活性氧增加。以上表明PDIA3多途径的神经保护作用。

然而，亦有大量研究证实PDIA3表达上调与众多疾病的发生发展息息相关。Takata等^[38]发现在肝细胞癌患者中，PDIA3的表达与肿瘤增殖有关，而细胞凋亡减少、PDIA3的表达增加同时预示着不良预后。因此，PDIA3可能是开发肝细胞癌患者新型靶向治疗的关键分子。同时，多个研究表明PDIA3上调表达对于口腔鳞状细胞癌^[39]、上皮性卵巢癌等的发展均有重要作用^[40]，相反抑制PDIA3的表达却能对皮肤恶性黑色素瘤细胞增殖和侵袭起抑制作用^[41]。这些现象均在一定程度上表明PDIA3的表达对肿瘤细胞的增值与侵袭可能存在一定促进作用。在肠易激综合征中，有研究发现PDIA3通过树突细胞介导T细胞活化，导致肥大细胞脱颗粒和内脏超敏反应的机制起到了重要作用^[42]，这也进一步说明PDIA3在氧化应激中的作用。另外，在近期一个研究中发现，PDIA3作为1，25-二羟基-维生素D3的受体，在骨形成方面具有着调节作用^[43]。

因此，PDIA3是一个有效的干预中介，所以近年来抑制PDI活性的药物研发逐渐增多^[44]。目前相应的药物主要有抗生素、巯基阻断剂、砷化合物、雌激素化合物及天然或人工合成的小分子化合物等，虽然大部分可通过不可逆性抑制PDI活性位点半胱氨酸来发挥作用，但其显著的非靶向毒性以及缺乏选择性和有效性使得特异性抑制PDI活性成为目前药物研究的难点。Trnková等^[45]发现绿茶酚能轻度抑制PDIA3的还原酶活性，具有预防多种疾病发生和保健作用。同时据报道人工合成的丙炔酸氨基甲酰甲基酰胺16 F16(3)可靶向抑制PDIA3^[46]，而万古霉素也能通过影响PDIA3与钙网蛋白间的相互作用来抑制PDI活性^[47]。而天然植物代谢产物Juniferdin^[48]和槲皮素-3-芸香糖甙被证明对PDIA3无明显抑制作用^[49]。PDI结构和功能极其复杂而有效抑制PDI的影响因素和机制尚不清楚，故PDI抑制剂对PDIA3活性的影响仍需进一步验证。

人类PDIA3蛋白目前也已能人工生产。其原理为通过酵母细胞识别和加工人类 PDIA3蛋白的天然信号肽，分泌出具有天然蛋白氨基酸序列和生物活性的重组PDIA3蛋白，利于进一步研究内质网外的 PDIA3生物学功能和进行生物学治疗^[50]。

综上所述，经过分析PDIA3表达与脊髓病理、神经功能变化的关系，再结合免疫印迹及免疫组织化学研究，表明PDIA3与脊髓缺血再灌注损伤发生发展密切相关。虽然目前具体相关机制尚不清楚，但进一步研究PDIA3在脊髓缺血再灌注损伤中作用必将为脊髓缺血再灌注损伤的诊治提供新方法和方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

建立兔脊髓缺血再灌注损伤模型PDIA3的表达变化及临床意义

Expression and clinical significance of protein disulfide-isomerase A3 in a rabbit model of spinal cord ischemia/reperfusion injury

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