青藤碱对大鼠骨髓来源树突状细胞分化成熟的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.019

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (21): 3394-3399.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.019

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

青藤碱对大鼠骨髓来源树突状细胞分化成熟的影响

黄江波¹，罗志刚¹，高红强²，刘利¹，何群君¹，李建军¹，言彩红¹，龙向阳¹

¹南华大学附属第二医院，湖南省衡阳市 421001；²湖南省儿童医院，湖南省长沙市 410007

修回日期:2017-06-21 出版日期:2017-07-28 发布日期:2017-08-02
通讯作者: 罗志刚，教授，硕士生导师，南华大学附属第二医院，湖南省衡阳市 421001
作者简介:黄江波，男，1969年生，2004年中南大学毕业，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事泌尿外科疾病基础和临床相关研究。现工作单位为湖南中医药大学第二附属医院。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81273754)

Sinomenine effects on differentiation and maturation of rat bone marrow-derived dendritic cells

Huang Jiang-bo¹, Luo Zhi-gang¹, Gao Hong-qiang², Liu Li¹, He Qun-jun¹, Li Jian-jun¹, Yan Cai-hong¹, Long Xiang-yang¹

¹the Second Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China; ²Hunan Provincial Children’s Hospital, Changsha 410007, Hunan Province, China

Revised:2017-06-21 Online:2017-07-28 Published:2017-08-02
Contact: Luo Zhi-gang, Professor, Master’s supervisor, the Second Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China
About author:Huang Jiang-bo, M.D., Associate chief physician, Master’s supervisor, the Second Affiliated Hospital, University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81273754

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
树突状细胞：体内最主要的抗原呈递细胞，根据其成熟程度的不同分为成熟树突状细胞和未成熟树突状细胞。树突状细胞可因其成熟状态的不同而分别具有免疫应答和免疫耐受功能。目前的研究观点认为成熟树突状细胞诱导免疫应答反应，未成熟树突状细胞诱导免疫耐受。
青藤碱：是从中药防己科植物青风藤中提取的一种生物碱单体，具有镇静、镇痛、镇咳、抗心律失常、抗炎和免疫抑制等药理作用，临床上主要用于类风湿性关节炎等各种风湿病以及心律失常的治疗。近年来随着对其免疫抑制作用研究的逐步深入，青藤碱也应用于移植免疫研究。

摘要
背景：利用未成熟树突状细胞诱导供体特异性免疫耐受有可能成为防治器官移植排斥反应的重要途径。
目的：探讨青藤碱对大鼠来源骨髓树突状细胞体外分化及成熟的影响。
方法：取大鼠股骨、胫骨骨髓来源树突状细胞的前体细胞，经粒-巨噬细胞集落刺激因子及白细胞介素4作用诱导出未成熟树突状细胞，第7天加入脂多糖刺激成熟，在刺激未成熟树突状细胞成熟时，分为对照组和低、中、高不同剂量的青藤碱处理组，作用48 h后收获树突状细胞，倒置相差显微镜观察细胞形态学特征，流式细胞仪检测细胞表型CD80、RT1B的表达，ELISA 检测培养上清白细胞介素12水平，混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞活化的能力。
结果与结论：①倒置显微镜下观察，对照组可见细胞符合成熟树突状细胞形态特性；青藤碱低剂量组可见绝大部分树突状细胞成熟；青藤碱中剂量组细胞部分悬浮，成熟度差；青藤碱高剂量组大部分细胞尚未成熟；②与对照组相比，青藤碱低、中、高剂量组CD80表达显著降低(P < 0.05)；与对照组相比，青藤碱中、高剂量组RT1B表达显著降低(P < 0.05)；③与对照组相比，青藤碱中、高剂量组培养上清中IL-12p70水平显著降低(P < 0.01)；④与对照组相比，青藤碱中、高剂量组刺激T淋巴细胞增殖的能力显著降低(P < 0.05)；⑤结果表明，青藤碱能抑制树突状细胞进一步成熟。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3718-2931(黄江波)

关键词: 干细胞, 分化, 青藤碱, 树突状细胞, 分化成熟, 免疫耐受, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It may be an important approach to avoiding organ transplant rejection by utilizing immature dendritic cells to induce donor-specific immunologic tolerance.

OBJECTIVE: To study the effect of sinomenine on the differentiation and maturation of rat bone marrow-derived dendritic cells in vitro.

METHODS: Bone marrow-derived dendritic cells were isolated from the rat femur and tibia, and immature dendritic cells were induced by granulocyte-macrophage colony stimulating factor and interleukin-4. On day 7, lipopolysaccharide was added and the cells were cultured to generate mature dendritic cells. Cells were divided into control group and low-, middle- and high-dose sinomenine treatment groups (SNL, SNM, SNH groups). Forty hours later, dendritic cells were harvested, and cell morphology was observed by inverted phase contrast microscope. The expression of CD80 and RT1B was detected by flow cytometry. ELISA was used to detect the expression of interleukin-12. The mixed lymphocyte reaction was used to detect the ability of dendritic cells to stimulate the activation of allogeneic T lymphocytes.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under the inverted microscope, the morphology of mature dendritic cells was observed in the control group; in the SNL group most dendritic cells were visible; in the SNM group, there were partially suspended cells with poor maturation; and in the SNH group, most of the cells were not mature. (2) The expression of CD80 in the control group was significantly lower than that in the SNL, SNM and SNH groups (P < 0.05), and the expression of RT1B was significantly reduced in the SNM and SNH groups than the control group. (3) Compared with the control group, the level of IL-12p70 in the cell supernatant was significantly decreased in the SNM and SNH groups (P < 0.01). (4) The ability of dendritic cells to stimulate T lymphocyte proliferation in the SNM and SNH groups was significantly decreased compared with the control group (P < 0.05). To conclude, sinomenine can inhibit the maturation of dendritic cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Dendritic Cells, Immune Tolerance, Sinomenium, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

黄江波，罗志刚，高红强，刘利，何群君，李建军，言彩红，龙向阳. 青藤碱对大鼠骨髓来源树突状细胞分化成熟的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3394-3399.

Huang Jiang-bo, Luo Zhi-gang, Gao Hong-qiang, Liu Li, He Qun-jun, Li Jian-jun, Yan Cai-hong, Long Xiang-yang. Sinomenine effects on differentiation and maturation of rat bone marrow-derived dendritic cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(21): 3394-3399.

图/表（结果） 1

2.1 一般情况及纯化结果 培养至第7天收集所有悬浮细胞计数后发现每只大鼠平均能收集(2.0-3.0)×10⁷个未成熟树突状细胞，完全可以满足实验要求。流式细胞仪检测原代培养未成熟树突状细胞的OX62阳性表达率达到82.8%，经免疫磁珠提纯后OX62阳性表达率达到91.9%，纯度明显提高。

2.2 青藤碱对各组树突状细胞形态的影响 大鼠骨髓原代细胞经粒-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4诱导培养到第3天时可见细胞形态呈小圆形，少部分细胞呈附壁生长，连续诱导至7 d时的未成熟树突状细胞，在光镜下可观察到呈葡萄串样的细胞集落或悬浮生长，且细胞集落轻轻吹打或摇晃培养板即可脱落，细胞表面颗粒感明显，并开始出现较明显的毛刺样突起。用脂多糖+青藤碱刺激48 h后，光镜下观察各组细胞形态见图1。

2.3 青藤碱对各组树突状细胞表面分子表达的影响 与对照组相比，青藤碱低、中、高剂量组CD80表达显著降低(P < 0.05)，差异有显著性意义；与对照组相比，青藤碱中、高剂量组RT1B表达显著降低(P < 0.05)，差异有显著性意义，而低剂量组差异无显著性意义(P > 0.05，见表1)。

2.4 青藤碱对各组树突状细胞分泌白细胞介素12的影响 青藤碱干预后，4组树突状细胞培养上清液中IL-12p70水平差异有显著性意义(F=69.21，P < 0.001)；与对照组相比，青藤碱低剂量干预后的树突状细胞培养上清中IL-12p70水平差异无显著性意义(P > 0.05)；青藤碱中、高剂量干预后的树突状细胞培养上清中IL-12p70水平有所降低(P < 0.05)，差异有显著性意义，见表2。

2.5 青藤碱对各组树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖能力的影响 青藤碱干预后，4组差异均有显著性意义；与对照组相比，在不同的混合比例下，青藤碱中、高剂量组吸光度值均有显著降低(P < 0.01)，差异有显著性意义，而低剂量组吸光度值的改变差异无显著性意义(P > 0.05，见表3)。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年7月至2014年6月在杭州赫贝科技有限公司实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠3只购自杭州赫贝科技有限公司清洁动物房，SPF级，6-8周龄，体质量200-250 g，室温18-20 ℃，湿度为65%-70%，自由进食进水。

1.3.2 主要试剂及仪器 青藤碱购自湖南正清制药有限公司；OX62磁珠分选试剂盒、LS分选柱购自德国Miltenyi Biotec公司；OX62-FITC antibody、Mouse IgG1-FITC Isotype antibody购自英国 Abcam 公司；CD86-PE antibody、Mouse IgG1 k-PE Isotype antibody购自美国 eBio 公司；RT1B(OX6)-PE antibody、Mouse IgG1 k-PE Isotype antibody购自美国BD公司；粒-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4购自美国Protech公司；脂多糖、锥虫蓝、丝裂霉素C购自美国Sigma公司；ELISA试剂盒购自美国Biosource公司；淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠未成熟树突状细胞的分离与培养 从大鼠胫骨、股骨中获取骨髓液，置于离心管中，1 500 r/min离心5 min，用5 mL PBS重悬，经无菌200目筛网过滤后放入预先加入5 mL淋巴细胞分离液的离心管，2 000 r/min离心20 min。收集第二层乳白色细胞层，即大鼠骨髓淋巴细胞单核细胞，用5 mL PBS重悬细胞，1 500 r/min离心5 min，细胞计数后接种于含5 mL诱导培养基(1640培养基，含体积分数为10%胎牛血清、10 μg/L白细胞介素4和10 μg/L粒- 巨噬细胞集落刺激因子)的6孔细胞培养板，每孔2×10⁶个细胞，放入37 ℃体积分数为5%CO₂培养箱中培养。

1.4.2 未成熟树突状细胞诱导培养与免疫磁珠分选纯化 接种2 d后吸弃孔中培养液上清及悬浮细胞，向培养板中加入新的诱导培养基，继续置入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，每2 d半量换液1次，保留悬浮的细胞。连续诱导7 d后，明场光镜下拍照，倒置荧光显微镜观察细胞形态。参照相关文献，此时细胞被认为是未成熟树突状细胞^[26]。取诱导至第7天的未成熟树突状细胞进行磁珠分选。以80 μL MACS buffer重悬1×10⁷个细胞，加入20 μL anti Rat DC(OX62) MicroBeads，混匀，4 ℃孵育15 min。再加入3 mL MACS buffer，300×g，离心10 min，吸取多余MicroBeads，3 mL MACS buffer重悬细胞，置于4 ℃，以3 mL MACS buffer 润洗柱子3遍。加入标记好的细胞-磁珠样本，待溶液快要流尽时，加入3 mL MACS buffer 洗脱柱子3遍。待最后一遍洗脱液要流尽时，加入3 mL MACS buffer，以配套活塞均匀用力推出柱子中的全部液体，收集溶液，300×g，离心5 min，得分选后的未成熟树突状细胞。

1.4.3 流式细胞仪检测免疫磁珠纯化前、后未成熟树突状细胞表面OX62阳性表达率 取诱导至第7天免疫磁珠纯化前、后的未成熟树突状细胞，流式细胞仪鉴定两组细胞表面OX62阳性表达率。

1.4.4 实验分组 收集第7天免疫磁珠纯化后的未成熟树突状细胞，分为4组：①对照组：加入脂多糖 1 mg/L；②低剂量组：加入脂多糖1 mg/L +低剂量青藤碱4 mg/L；③中剂量组：加入脂多糖1 mg/L +中剂量青藤碱20 mg/L；④高剂量组：加入脂多糖1 mg/L +高剂量青藤碱100 mg/L。给药作用48 h后收集各组细胞。光镜观察细胞形态，得树突状细胞，备检测使用。

1.4.5 细胞形态学鉴定 在倒置荧光显微镜高倍视野下每日观察各组细胞形态、大小等变化，并在高倍镜下用相差显微镜进行显微摄影。

1.4.6 流式细胞仪检测树突状细胞表面因子 ①收集培养板中各组待测细胞悬液，计数1.0×10⁵个细胞，800 r/min离心5 min，弃去上清液，采用4 ℃以上的冷PBS洗涤细胞1次；②以40 g/L多聚甲醛1 mL室温固定40 min，再次以800 r/min速度离心5 min，弃去上清液。然后加入2 mL PBS重悬洗涤细胞，仍以800 r/min速度离心5 min，去上清；③再以PBS重悬细胞，冰上孵育10 min，800 r/min离心5 min，去上清；④加入100 μL含0.5%BSA和饱和剂量的标记抗体(5×10⁵个细胞/CD80剂量2.5 μL、RT1B剂量10 μL)的PBS；⑤室温避光孵育30 min；⑥孵育完毕后在每管中加入生理盐水3 mL，以1 500 r/min的速度离心5 min洗涤细胞；⑦弃去上清液，每管中加入500 μL PBS使细胞重悬，上机，流式细胞仪检测。

1.4.7 ELISA法检测各组树突状细胞的白细胞介素12分泌水平 应用ELISA法测定各组树突状细胞培养液上清的白细胞介素12分泌水平，测定方法按试剂盒说明书进行。

1.4.8 混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激T细胞的能力 ①用1 mL枪头吸取各组树突状细胞加入离心管内，离心5 min，PBS洗涤3次后去上清。以RPMI1640培养液重悬细胞，加入丝裂霉素C(终质量浓度为25 mg/L)处理，置于37 ℃含体积分数为5%CO₂培养箱中孵育30 min，用RPMI11640完全培养液洗涤3遍后，作为刺激细胞；②尼龙毛柱法分离大鼠脾脏T细胞。收集的T细胞悬液以1 500 r/min离心5 min即得反应细胞；③将细胞浓度为1×10⁹L^-¹的反应细胞加到96孔培养板中，刺激细胞与反应细胞以1︰5、1︰10、1︰20和1︰40的不同比例相混合。总体积为200 µL。此外以100 µL PBS替代树突状细胞悬液刺激T细胞来作对照组；④每组设置3个复孔。将96孔板放入37 ℃，体积分数为5%CO₂细胞孵箱中培养96 h，离心，去上清，将5 g/L的MTT 50 µL加入到各个培养孔中继续孵育4 h后离心弃除全部上清。各孔再加入二甲亚砜100 μL，酶联免疫仪检测490 nm处吸光度值，结果需取3孔平均值。

1.5 主要观察指标 ①各组细胞形态学特征；②各组树突状细胞CD80、RT1B的表达，以及培养上清中白细胞介素12水平；③各组树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞活化的能力。

1.6 统计学分析 收集实验数据，数据结果转化为计量资料以x(_)±s表示，多组间均数比较采用One way-ANOVA，低、中、高剂量青藤碱组分别与对照组比较，采用Dunnett-t 检验，利用 SPSS 16.0统计软件进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

未成熟树突状细胞能诱导同种异体淋巴细胞低反应，降低T细胞介导的细胞免疫应答，可以介导免疫耐受。在移植领域，未成熟树突状细胞诱导供体特异性免疫耐受已经表现出诱人的前景，有可能成为预防器官移植排斥反应的重要途径。因此，寻找刺激物修饰未成熟树突状细胞，使其在体内具有免疫耐受作用具有十分重要的理论与临床应用价值。课题旨在前期研究基础上探讨青藤碱对大鼠来源骨髓树突状细胞体外分化发育及成熟的影响，为研究青藤碱在未成熟树突状细胞中的免疫抑制作用机制及其在免疫移植临床应用方面提供可靠的实验依据。

OX62是大鼠骨髓树突状细胞特异性标记表面分子标志物^[26-27]，可以用于从淋巴或非淋巴组织及外周血中阴性或阳性分选树突状细胞。原代分离后，实验利用anti Rat DC(OX62)磁珠进一步分选提纯树突状细胞，以OX62这个树突状细胞特异性表达的细胞mark来鉴定树突状细胞纯度，原代培养未成熟树突状细胞的OX62阳性表达率达到82.8%，免疫磁珠分选后纯度达到91.9%。所以作者认为原代培养的纯度基本可以做为一般研究所用，磁珠分选可进一步纯化以保证结果的客观性。

树突状细胞的培养可采用多种不同组合的细胞因子，其中粒-巨噬细胞集落刺激因子及白细胞介素4是最基本的细胞因子。已有研究发现：适量的粒-巨噬细胞集落刺激因子可以诱导树突状细胞的生成，白细胞介素4可抑制培养体系中的巨噬细胞和中性粒细胞的生成，但可促进诱导树突状细胞的生成^[28-30]。实验采用粒-巨噬细胞集落刺激因子及白细胞介素4组合来诱导树突状细胞，结果证明粒-巨噬细胞集落刺激因子及白细胞介素4可以成功诱导得到树突状细胞。脂多糖能促进未成熟树突状细胞向成熟树突状细胞转化，促进成熟树突状细胞各种表面分子的表达^[31-32]。因此，实验选用脂多糖促进树突状细胞成熟，作为与不同浓度青藤碱对树突状细胞作用的对比。

成熟树突状细胞表面RT1B(即MHCⅡ类分子)可与抗原肽形成MHCⅡ-抗原肽复合物，为T淋巴细胞的活化提供第1种信号，成熟树突状细胞可高表达RT1B，而未成熟树突状细胞则低表达这类分子^[33-34]。

实验发现青藤碱中、高剂量组与对照组相比，RT1B的表达差异有显著性意义(P < 0.01)，表明青藤碱可抑制树突状细胞表达RT1B(即MHCⅡ类分子)，中、高剂量青藤碱组树突状细胞可认为处于未成熟状态。

随着树突状细胞的成熟，其表面协同刺激分子CD80的表达也有所增加，它可以为T淋巴细胞的活化提供第2种信号，未成熟的树突状细胞表面CD80表达较低，未成熟树突状细胞给T细胞提呈抗原的过程中虽可引起T细胞的增殖，但随后就会诱导T细胞的耐受^[35]。

实验发现低、中、高剂量青藤碱组与脂多糖组对比，在CD80分子表达上差异有显著性意义(P < 0.05)，表明青藤碱可抑制树突状细胞表面表达协同刺激分子CD80，青藤碱组的树突状细胞未达到成熟状态。

大量的研究表明，成熟的树突状细胞可分泌白细胞介素12，为T细胞的活化和进一步分化提供第3种信号，尚未成熟的树突状细胞分泌白细胞介素12水平明显降低^[36-37]。实验发现中、高剂量青藤碱组与脂多糖组对比，在树突状细胞分泌白细胞介素12上差异有显著性意义(P < 0.05)，表明青藤碱可抑制树突状细胞合成和分泌白细胞介素12，提示中、高剂量青藤碱可抑制树突状细胞的成熟程度。

树突状细胞的两种不同的功能状态(未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞)中，只有成熟树突状细胞才有活化初始T淋巴细胞，进一步诱导免疫反应的能力，成熟树突状细胞在混合淋巴细胞反应中起着重要的作用，具有很强的刺激T淋巴细胞增殖的能力^[38]。

实验采用混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞活化的能力，与对照组相比，在不同的混合比例下，青藤碱中、高剂量组吸光度值均有显著降低(P < 0.01)，差异有显著性意义，而低剂量青藤碱组吸光度值的改变差异无显著性意义(P > 0.05)。说明中、高剂量处理组的树突状细胞刺激T淋巴细胞增殖能力较差，尤其是高剂量青藤碱组刺激能力最低；说明中、高剂量青藤碱组的树突状细胞尚未完全成熟，青藤碱抑制了树突状细胞的成熟。

实验初步表明，青藤碱能抑制树突状细胞成熟，从而提示青藤碱可能可以诱导器官移植免疫耐受。

青藤碱对大鼠骨髓来源树突状细胞分化成熟的影响

Sinomenine effects on differentiation and maturation of rat bone marrow-derived dendritic cells

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