人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养：组织块法的优化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.018

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (21): 3388-3393.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.018

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人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养：组织块法的优化

金宇林，吴洁莹，陆琰，陈劲松，李发涛，唐婕，刘东，梁绮华，李焱，汤雪薇，谢闺娥，吴韶清

广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心，广东省广州市 510623

修回日期:2017-06-12 出版日期:2017-07-28 发布日期:2017-08-02
通讯作者: 吴韶清，硕士，主任技师，硕士生导师，广州市妇女儿童医疗中心，广东省广州市510623
作者简介:金宇林，男，1974年生，江西省丰城市人，汉族，2000年江西医学院毕业，硕士，副主任医师，主要从事间充质干细胞临床应用的相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81102248)；广东省医学科研基金(B2010274)；广东省科技计划项目(2014A020 212027)；广州市妇女儿童医疗中心儿科研究所基金(YIP-2016-014)

Isolation and cultivation of human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells: optimization of the tissue explants method

Jin Yu-lin, Wu Jie-ying, Lu Yan, Chen Jin-song, Li Fa-tao, Tang Jie, Liu Dong, Liang Qi-hua, Li Yan, Tang Xue-wei, Xie Gui-e, Wu Shao-qing

Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510623, Guangdong Province, China

Revised:2017-06-12 Online:2017-07-28 Published:2017-08-02
Contact: Wu Shao-qing, Master, Senior technologist, Master’s supervisor, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510623, Guangdong Province, China
About author:Jin Yu-lin, Master, Associate chief physician, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, Guangzhou 510623, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81102248; the Medical Research Foundation of Guangdong Province, No. B2010274; the Science and Technology Project of Guangdong Province, No. 2014A020212027; the grant from Guangzhou Institute of Pediatrics/Guangzhou Women and Children’s Medical Center, No. YIP-2016-014

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人胎盘绒毛膜：构成胎盘的胎儿部分，占胎盘主要部分。晚期囊胚着床后，滋养层细胞迅速分裂增殖，内层为细胞滋养层细胞，是分裂生长的细胞；外层为合体滋养细胞，是执行功能的细胞，由细胞滋养细胞分化而来。滋养层内面有一层细胞称胚外中胚层，与滋养层共同组成绒毛膜。
组织块法：将组织块剪成微小碎块，接种于培养瓶中，贴壁后加入细胞培养液培养，细胞从贴壁的组织块边缘缓慢爬出，直至爬满整个培养瓶，由于贴壁细胞没有经过酶消化，细胞受损伤较少，但也导致细胞分散度不高，爬出缓慢，耗时较长。

摘要
背景：关于人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养方法的研究很多，但是如何简便、快捷获得大量原代培养间充质干细胞的问题尚未解决。
目的：探讨优化人胎盘绒毛膜间充质干细胞体外分离培养组织块法的最佳方法。
方法：无菌条件下，取正常足月剖宫产胎盘绒毛膜，用匀浆器处理组织块，采用组织块法贴壁分离培养人胎盘绒毛膜间充质干细胞，经初次培养的组织块进行再次接种培养。

结果与结论：用电动匀浆器处理人胎盘绒毛膜省时省力，组织分散度和去除红细胞效果好。初次培养和再次培养获得细胞的平均时间分别为(17.73±1.14) d和(10.03±1.30) d。每个Φ100 mm培养皿获得的原代细胞分别为(6.97±0.98)×10⁵个和(13.82±1.44)×10⁵个。获得的贴壁细胞呈典型的成纤维细胞形态，呈平行或漩涡状生长，高表达CD90、CD73、CD105，而CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR为阴性。细胞可向成骨、成脂方向诱导分化。结果表明优化的方法能够简便、快捷地处理人胎盘绒毛膜组织，获得大量的原代间充质干细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9731-9506(吴韶清)

关键词: 干细胞, 培养, 间充质干细胞, 细胞培养, 胎盘, 绒毛膜, 组织块法, 优化, 匀浆器, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There are a lot of studies on isolation and culture methods of human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells (hpcMSCs), but how to simply and efficiently harvest a large amount of primary MSCs has not been resolved.

OBJECTIVE: To optimize the tissue explants method of isolating and culturing hpcMSCs in vitro.

METHODS: Human placental chorionic villi were collected from full-term deliveries under aseptic condition and isolated by electric homogenizer. hpcMSCs were prepared by tissue explants method. The fluid and tissue of the primary culture flask and douching normal saline of the initial culture were centrifuged and prepared for secondary culture.
RESULTS AND CONCLUSION: It saved time and effort to treat human placental chorionic villi with electric homogenizer, with good effects on tissue dispersion and removal of red blood cells. The average time of cell acquisition in initial culture and secondary culture was (17.73±1.14) and (10.03±1.30) days, respectively. The yields of primary cultured cells in initial culture and secondary culture were (6.97±0.98)×10⁵ and (13.82±1.44)×10⁵ per Φ100 mm culture dish, respectively. The adherent cells showed fibroblast-cell-like shape, which were in parallel or circinate arrangement. Highly expressed CD73, CD105 and CD90 could be detected in the third generation of hpcMSCs, but CD34, CD45, CD14, CD19 and HLA-DR were negative. Following induction, alizarin red staining and oil red O staining produced a strong reaction in cells. In a word, the optimized method is a simple and efficient method for obtaining a large amount of primary hpcMSCs.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Placenta, Chorion, Mesenchymal Stem Cells, Cell Culture Techniques, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

金宇林，吴洁莹，陆琰，陈劲松，李发涛，唐婕，刘东，梁绮华，李焱，汤雪薇，谢闺娥，吴韶清. 人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养：组织块法的优化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3388-3393.

Jin Yu-lin, Wu Jie-ying, Lu Yan, Chen Jin-song, Li Fa-tao, Tang Jie, Liu Dong, Liang Qi-hua, Li Yan, Tang Xue-wei, Xie Gui-e, Wu Shao-qing. Isolation and cultivation of human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells: optimization of the tissue explants method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(21): 3388-3393.

图/表（结果） 1

2.1 原代人胎盘绒毛膜间充质干细胞细胞形态、获得时间和细胞得率 镜下观察人胎盘绒毛膜间充质干细胞贴壁生长。初次培养的细胞，1周后，就能够看到极少数成纤维样细胞从组织块上爬出来，在第10天能够看到细胞呈旋涡状生长(图1A)，形态均一，获得细胞的平均时间为(17.73± 1.14) d，每个Φ100 mm培养皿获得原代细胞为(6.97± 0.98)×10⁵个。再次接种培养的细胞，在第10天能够看到组织块上爬出的细胞较多(图1B)，获得细胞的平均时间为(10.03±1.30) d，每个培养皿获得原代细胞为(13.82± 1.44)×10⁵个。结果表明，2种接种情况下，接种培养的细胞形态无明显差异，获得时间上，再次接种培养的细胞收获时间快，差异有显著性意义(P=0.000 < 0.05)；获得细胞数量上，再次接种培养获得细胞约初次培养的2倍，差异有显著性意义(P=0.000 < 0.05)。达到90%融合度的细胞形态为长梭形成纤维细胞状，呈平行或漩涡状生长(图1C)。

2.2 人胎盘绒毛膜间充质干细胞免疫表型分析 流式细胞术检测第3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞，表面标记抗体CD90、CD105、CD73的表达率分别(98.54±0.21)%，(99.62±0.12)%，100%，均高于95%，而CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR检测为阴性，表达率分别为(0.82± 0.25)%，(1.22±0.27)%，(1.15±0.14)%，(0.11±0.09)%，(1.21±0.31)%，均低于2%，见图2。

2.3 人胎盘绒毛膜间充质干细胞增殖能力分析 CCK-8法绘制第3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞的生长曲线，1-2 d间充质干细胞增殖不明显；3-5 d细胞进入对数生长期，细胞增殖加速；6-7 d细胞进入平台期，生长缓慢，见图3。

2.4 人胎盘绒毛膜间充质干细胞诱导分化潜能分析 第3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞经成骨、成脂分化培养基诱导4周后，油红O染色可见胞浆内脂滴染成红色(图4A)，而茜素红染色，可见红色矿化沉着物(图4B)。说明人胎盘绒毛膜间充质干细胞在体外特定环境下具有向成骨细胞或脂肪细胞分化的潜能。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年3月至2016年7月在广州市妇女儿童医疗中心脐血库完成

1.3 材料

胎盘标本：经广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准，征得产妇和家属同意书面知情同意的情况下，在广州市妇女儿童医疗中心产科取剖宫产健康足月的新生儿胎盘30个，胎盘无老化钙化，孕妇的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、梅毒等传染性感染性疾病检测为阴性。

主要试剂及仪器：StemPro MSC SFM CTSTM、0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶、Collagenase Type Ⅱ、成骨、成脂诱导分化试剂盒购自美国Gibco公司；Rnase-Free Dnase购自美国Promega公司；CCK-8检测试剂盒购自日本同仁公司；流式单抗CD45、CD34、CD90、CD105、CD73、CD14、CD19、HLA-DR及同型对照购自美国BD公司；细胞茜素红染色试剂盒购自中国纽杰美公司；油红O染色试剂盒购自南京建成研究所；手持电动匀浆器购自美国PRO Scientific公司；倒置相差显微镜购自日本NIKON公司；流式细胞仪购自美国BD公司；二氧化氮培养箱购自德国Labotect公司；细胞计数板购自上海市求精生化试剂仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 人胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离、培养 将胎盘加入500 mL生理盐水，取绒毛膜，剪成1 cm左右长条块，用生理盐水反复冲洗，去残留血液，称质量，匀浆至0.1-0.3cm³，生理盐水洗，匀浆至0.1-0.5 mm³；500 r/min离心5 min，去上清液，沉淀物按照每5 g胎盘绒毛膜组织接种一个Φ100 mm培养皿的份量接种于4个培养皿，把培养皿倒置于饱和湿度、37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱中1 h。然后轻轻加入培养液培养7 d，更换新鲜培养基，15 d时，倒置显微镜下观察到有比较多的间充质干细胞长出时，倒出培养基并用生理盐水冲洗培养皿，更换新的培养基，把冲洗的生理盐水、倒出后的培养基及其中的组织块，1 500 r/min离心5 min，沉淀按照首次培养时方法进行再次接种。待细胞生长到80%-90%融合状态时，用胰蛋白酶消化传代，用锥虫蓝活染检测细胞活率，用细胞计数板计数细胞数。

1.4.2 人胎盘绒毛膜间充质干细胞表面标记物检测 取第3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞，调节细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，用流式抗体CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR、CD90、CD105、CD73和相应的同型对照各10 μL标记，混匀后避光室温孵育30 min，用PBS洗涤2次(1 500 r/min离心5 min)，重悬后用流式细胞仪进行检测和分析。

1.4.3 CCK-8检测细胞增殖活性在96孔板上，设置7组，每组7孔，每孔加入培养至第3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞1 000个，置于饱和湿度、37 ℃、体积分数为5%CO₂的培养箱中培养，连续7 d每隔24 h，用CCK-8试剂盒检测1组细胞，酶标仪检测吸光度值(激发波长450 nm)，绘制生长曲线。

1.4.4 成骨、成脂诱导分化检测 参照文献[8-9]和试剂盒说明书，取第3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞，接种于24孔培养板，当细胞长到80%融合度时，换成骨培养基(含胎牛血清20 mL、谷氨酰胺2 mL、地塞米松20 μL、β-磷酸甘油2 mL和抗坏血酸400 μL)或成脂诱导培养基(含胎牛血清20 mL、谷氨酰胺2 mL、胰岛素400 μL、IBMX 200 μL、吲哚镁锌200 μL和地塞米松200 μL)，培养4周后，分别用茜素红染色试剂盒或油红O染色试剂盒染色，倒置显微镜观察。

1.5 主要观察指标 ①人胎盘绒毛膜间充质干细胞的形态、获得的时间和细胞数；②人胎盘绒毛膜间充质干细胞的免疫表型；③人胎盘绒毛膜间充质干细胞的增殖能力；④人胎盘绒毛膜间充质干细胞的诱导分化能力。

1.6 统计学分析 用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，计量资料用x(_)±s表示，两样本均数比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

1976年，Friedenstein等^[1]首先分离培养出间充质干细胞，该细胞来源于中胚层，具有支持造血系统，分化能力强，倍增时间短，免疫调节作用和低下免疫原性的特性，是一种理想的种子细胞和基因治疗的载体^[18-21]。

目前，使用的间充质干细胞主要为骨髓来源^[22-23]，该来源间充质干细胞具有方便、快捷的优势，可是具有其缺陷：①人体骨髓中的间充质干细胞含量极少。每1×10⁴-1×10⁵个单个核细胞中约含有1个间充质干细胞，能取得的原代细胞数量有限，并随着年龄增长其扩增、分化能力和细胞数量出现明显下降趋势；②细胞取得需要入侵式操作，供者有不适感，不易接受，同时也存在一定风险；③病毒感染机会大。胎盘绒毛膜间充质干细胞是一种能替代骨髓间充质干细胞, 可弥补骨髓间充质干细胞缺陷，并具有一定优越性。胎盘绒毛膜间充质干细胞有如下优势：①取材几乎不受限制。胎盘为“废弃”物，只要在正常分娩的健康产妇知情同意的基础上，都能够提供胎盘。供者无痛苦，污染机会少；②胎盘绒毛膜间充质干细胞更加原始，免疫原性更低，获得的原代间充质干细胞数量大；③不涉及社会、伦理及法律方面的更多争论。因此绒毛膜间充质干细胞受到临床转化应用领域的广泛关注^[14^，^24-39]。然而，胎盘绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法耗时费力，过程繁琐易污染，是绒毛膜间充质干细胞使用上的障碍^[40]。目前，绒毛膜间充质干细胞分离培养方法主要有组织块法和酶消化法，其中酶消化法成本高，操作比较繁琐，污染机会大，而且酶消化时间长，容易损伤细胞，影响细胞的活性和传代。普遍认为组织块贴壁培养法优于胰蛋白酶消化法^[5-6]。传统的组织块法需剪取胎盘小叶至1 mm³大小，并以1 cm间距铺排到培养皿中，这个过程中需要消耗较多的时间和人力^[41]。

实验以手持电动匀浆器处理绒毛膜组织，省时省力，且费用较低。整个过程裸眼可见，可及时调整处理程度，不用担心处理过度，导致细胞全部破碎。用手持匀浆器处理胎盘绒毛膜，避免了用剪子把绒毛膜组织剪成微小组织块所消耗的人力和时间，既不浪费标本，而且也增加了组织培养量，为提高原代间充质奠定基础；而且用匀浆器处理后，组织块变得很薄而且微小，增加了组织块的分散度，提高了接种面积。本次实验中5 g绒毛膜完全能够接种满一个Φ100 mm培养皿。同时，接种前的沉淀为浆糊状，组织块相互粘连，使得加入培养基后不易漂浮，贴壁效果好。

胎盘来源间充质干细胞广义上主要分2种来源：胎盘血间充质干细胞和胎盘组织间充质干细胞。由于胎盘组织具有独特、复杂的解剖结构，其内有大量交错的血管网络及结缔组织，因此传统意义上的分离提取间充质干细胞大部分是来自于胎盘血。同时，胎血中大量红细胞的存在，阻止原代间充质干细胞的有效贴壁，减少原代间充质干细胞的数量或培养不成功^[17^，^42]。实验用匀浆器处理绒毛膜至0.1-0.3 cm³大小时，进行冲洗，能够去除大部分胎血，处理至0.1-0.5 mm³大小时，再一次低速离心，使得胎血细胞保存在上清液中，有效去除了胎血细胞，整个过程简便，不用增加新的试剂和处理程序，减少了污染可能，使得本研究人胎盘绒毛膜间充质干细胞主要来源于绒毛膜组织，均一性较好。

实验中，收集初次培养后的组织和冲洗液进行再培养，提高了组织的利用率，提高了细胞的获得率。初次培养的细胞和再次培养的细胞的收获时间和原代细胞数差异有显著性意义(P=0.000 < 0.05)，初次培养收获时间长，原代细胞数量少，可能细胞从组织里面爬出来比较耗时，而且体外培养中细胞需要一个适应过程。而再次培养时，可能培养体系中具有某些初次培养中细胞分泌的因子，促使细胞生长，同时，组织经过浸泡后变得松软使得细胞容易爬出来。而本研究还在再次培养后进行第3次培养，培养效果不理想，贴壁细胞少，收获期限长，可能是活跃的细胞已经爬出，而长时间的未贴壁，对细胞本身就是一种伤害，所以收获时间延长^[43-44]。

因此，改良现有的胎盘源间充质干细胞分离培养体系，建立方便、快捷地分离方法，提高原代胎盘源间充质干细胞的细胞获得数量，并具有稳定的间充质干细胞质量。是目前和今后一个重要的领域，也是间充质干细胞研究发展的基础。

综上所述，在传统组织块法的基础上改良了胎盘源绒毛膜间充质干细胞的分离培养体系，该体系简便、快捷、易于短时间内获得大量原代胎盘源绒毛膜间充质干细胞的优点，为建立临床级胎盘源绒毛膜间充质干细胞库奠定基础，可以为组织工程提供足够的、质量稳定可靠的间充质干细胞。

人胎盘绒毛膜间充质干细胞分离培养：组织块法的优化

Isolation and cultivation of human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells: optimization of the tissue explants method

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