神经干细胞神经分化示踪中GFAP启动子驱动荧光报告系统的价值

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.015

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (21): 3370-3375.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.015

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神经干细胞神经分化示踪中GFAP启动子驱动荧光报告系统的价值

陈京^1，2，余伟华³，李付贵¹

中山大学附属中山医院，¹肿瘤研究所，²分子诊断中心，广东省中山市 528403；³中山大学干细胞与组织工程研究中心，广东省广州市 510080

修回日期:2017-06-07 出版日期:2017-07-28 发布日期:2017-08-02
通讯作者: 李付贵，博士，副主任检验师，中山大学附属中山医院肿瘤研究所，广东省中山市 528403
作者简介:陈京，女，1982年生，湖北省天门市人，汉族，2010年中山大学中山医学院毕业，硕士，主管技师，主要从事干细胞及分子诊断工作。
基金资助:
广东省自然科学基金(2014A030310013)；中国博士后基金(2014M562244)

The value of GFAP promoter driven fluorescent reporter system in the neural differentiation tracing of neural stem cells

Chen Jing^{1, 2}, Yu Wei-hua³, Li Fu-gui¹

¹Cancer Research Institution, ²Centre for Molecular Diagnosis, Zhongshan Hospital of Sun Yat-sen University, Zhongshan 528403, Guangdong Province, China; ³Centre of Stem Cells and Tissue Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Revised:2017-06-07 Online:2017-07-28 Published:2017-08-02
Contact: Li Fu-gui, M.D., Associate chief analyst, Cancer Research Institution, Zhongshan Hospital of Sun Yat-sen University, Zhongshan 528403, Guangdong Province, China
About author:Chen Jing, Master, Technician-in-charge, Cancer Research Institution, Zhongshan Hospital of Sun Yat-sen University, Zhongshan 528403, Guangdong Province, China; Centre for Molecular Diagnosis, Zhongshan Hospital of Sun Yat-sen University, Zhongshan 528403, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2014A030310013; China Postdoctoral Science Foundation, No. 2014M562244

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
神经胶质纤维酸性蛋白：是一种Ⅲ型中间丝状蛋白，以单体形式存在。主要分布于中枢神经系统的星形胶质细胞，参与细胞骨架的构成并维持其张力强度。而星形胶质细胞是哺乳动物中枢神经系统的主要细胞类型之一，对神经元具有支持、营养和分隔等作用，也在组织损伤修复、宿主防御机制等过程中起到重要的作用。神经胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞的特异标志物。
dTomato：是一种来自水果蛋白的橙色衍生物，其分子结构具有一对发光基团，导致其亮度极强且光稳定性非常好，已广泛应用于多种组织和细胞的标记示踪。采用dTomato标记星形胶质细胞特异性标志物GFAP的启动子，不仅可以可视化地监控神经干细胞神经分化的动态过程，而且对于诱导的星形胶质样细胞的分离纯化、移植修复及神经分化小分子药物筛选平台的建立等具有重要的应用前景。

摘要
背景：神经干细胞作为近年来神经科学研究的热点，在神经系统损伤治疗方面具有广阔的应用前景，但如何获取大量纯化且特征均一的终末神经细胞是这一领域的难点。利用细胞内荧光报告系统示踪神经干细胞分化的过程，并获得纯化的单一类型终末神经细胞为这一难点的解决提供了可行的方案。
目的：探讨携带星形胶质细胞特异标志物GFAP基因的启动子驱动的荧光报告系统在神经干细胞神经分化示踪中的价值。
方法：原代分离小鼠胚胎的脑部皮质，经机械消化和吹打后悬浮培养，免疫荧光染色检测其特异标志物Nestin的表达以确定神经干细胞。再将携带pLV/Final-neo-GFAP(promoter)-dTomato载体的慢病毒感染小鼠神经干细胞，遗传霉素G418筛选14 d后获得纯化神经干细胞，然后诱导其向星形胶质细胞分化，显微镜观察细胞红色荧光(dTomato)的变化。诱导第13天采用细胞免疫荧光技术对表达红色荧光的细胞行GFAP抗体复染。
结果与结论：①原代分离获得的小鼠神经干细胞呈Nestin表达阳性；②慢病毒感染并筛选14 d后得到具有G418抗性的纯化神经干细胞；③该细胞经神经诱导分化后，显微镜下观察到红色荧光大量表达，且GFAP复染与红色荧光具有非常高的一致性；④实验成功地获得了体外表达neo-GFAP(promoter)-dTomato载体的小鼠神经干细胞，该细胞可以体外示踪GFAP基因的特异表达，为神经干细胞的定向神经分化机制、细胞移植及组织工程产品开发等研究提供了有力的工具。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1768-2696(李付贵)

关键词: 干细胞, 分化, 神经干细胞, 慢病毒, 红色荧光蛋白, 胶质纤维酸性蛋白, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cells, as a hot topic in neuroscience research, have a wide application prospect in the treatment of neurological damage, but how to obtain a large number of terminally differentiated and purified nerve cells with homogeneous features is a difficult problem in this field. The use of intracellular fluorescence reporter system to track the process of neural stem cell differentiation and obtain a single kind of terminally differentiated and purified nerve cells provides a viable option.
OBJECTIVE: To explore the value of GFAP promoter-driven fluorescence reporter system in tracing the neural differentiation of neural stem cells (NSCs).
METHODS: Cerebral cortex of mouse embryos were primarily dissociated and sent for digesting and pipetting mechanically before suspension culture, followed by immunofluorescence staining of Nestin to identify their biological characteristics. Lentivirus carrying pLV/Final-neo-GFAP(promoter)-dTomato vector was employed to infect above-mentioned NSCs, and Geneticin (G418) was used to obtain purified NSCs at 14 days. Subsequently the purified cells were induced to differentiate into astrocyte-like cells; meanwhile red fluorescence changes in cells were observed by microscopy. The red fluorescent cells were then subjected to perform immunofluorescence staining at 13 days after induction.
RESULTS AND CONCLUSION: The expression of Nestin in the isolated primary cells was strongly positive. Purified NSCs were obtained by lentivirus infection and subsequent G418 resistance selection at 14 days. After induced into astrocyte-like cells, the red fluorescence was observed in the cells under the microscope and furthermore, GFAP staining was also positive. Mouse NSCs carrying neo-GFAP(promoter)-dTomato were successfully obtained. The cells could express dTomato under the control of GFAP promoter, which provides a powerful tool for research on NSC differentiation mechanism, neural transplantation and tissue engineering product development.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Lentivirus Infections, Glial Fibrillary Acidic Protein, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈京，余伟华，李付贵. 神经干细胞神经分化示踪中GFAP启动子驱动荧光报告系统的价值[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3370-3375.

Chen Jing, Yu Wei-hua, Li Fu-gui. The value of GFAP promoter driven fluorescent reporter system in the neural differentiation tracing of neural stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(21): 3370-3375.

图/表（结果） 1

2.1 神经干细胞的形态学观察与鉴定结果 原代分离的小鼠胎脑皮质细胞在神经干细胞悬浮培养液中培养24 h，细胞悬浮生长，部分聚集成团块状，团块周边细胞折光性好。48 h后形成立体感强、折光性好且形态规则的细胞球，即神经球(Neurosphere)(图1A)^[21-22]。

用0.25%胰酶消化神经球，辅以机械吹打制成单细胞悬液，接种于包被0.1%多聚赖氨酸的6孔板。采用神经干细胞单层培养液培养，24 h后可观察到贴壁细胞边缘向外伸出发丝状突起，与邻近细胞发出的突起相互连接，交织成网状(图1B)。

细胞免疫化学法鉴定可见贴壁细胞呈Nestin染色强阳性，胞浆部位着色而胞核不着色，证实贴壁培养的细胞为神经干细胞(图2)^[23]。

2.2 慢病毒的成功包装 贴壁培养的293FT细胞密度达到90%左右时，更换无抗生素培养基，再以载体质粒和包装质粒共转染8 h，之后用新鲜培养基换液。72 h后，镜下观察到大量293FT细胞发生融合，形成多核复合体并表达强红色荧光(图3)，提示慢病毒包装成功。

2.3 慢病毒转导神经干细胞及其纯化 浓缩后的慢病毒以1×10¹⁰ L^-¹的滴度连续感染神经干细胞3次，3 d后观察到细胞生长状态稍差，部分细胞出现死亡，6-8 d后可见细胞生长状态逐渐转好并开始大量增殖。随后采用G418连续筛选14 d，获得慢病毒载体稳定表达的神经干细胞阳性细胞株。该细胞株经传代后，显微镜下仅见个别细胞有弱红色荧光表达(图4)。

2.4 慢病毒感染神经干细胞后纯化细胞的神经分化及对荧光细胞的鉴定结果 转导pLV/Final-neo-GFAP (promoter)-dTomato载体后的神经干细胞向星形胶质细胞分化过程中，镜下观察可见细胞发生一系列的变化。采用去除生长因子(表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子)的神经干细胞培养液进行培养后，随着时间延长观察到表达红色荧光的细胞数目开始增多，荧光强度大幅增强(图5 A)；荧光表达的高峰期在神经分化的第9-13天(图5B)。

在分化的第13天，利用免疫荧光染色法对表达红色荧光的分化细胞进行GFAP抗体复染，结果发现红色荧光与GFAP的绿色荧光染色的位置保持高度的一致(图6)。此结果证明，慢病毒载体转导后的神经干细胞，经过神经分化后获得的表达红色荧光的细胞就是星形胶质细胞。这一体系的成功建立，为后续的神经干细胞定向分化及GFAP的功能研究等提供了非常好的细胞工具。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年8月至2016年7月在中山大学干细胞与组织工程研究中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 C57/BL6小鼠1只，孕12.5 d，SPF级，4月龄，体质量约30 g，由中山大学实验动物中心提供。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

1.3.2 试剂和仪器 慢病毒包装系统(Invitrogen公司)；胰蛋白酶(Hyclone公司)；谷氨酰胺(L-glutamine)、氨苄青霉素、链霉素、G418、多聚赖氨酸、二甲基亚砜、核染料DAPI(Sigma公司)；乙二胺四乙酸(EDTA)(Amresco公司)；DMEM/F12、B27、肝素、非必需氨基酸(NEAA)、Neurobasal^TM、0.25%胰酶(TrypLE Select)(Gibco公司)；表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(Peprotech公司)；羊抗鼠nestin(Abcam公司)；兔抗鼠GFAP(Dako公司)；二抗Cy3羊抗兔IgG、二抗Cy3兔抗羊IgG(CST公司)；CO₂培养箱(Thermo公司)；超高速冷冻离心机(Beckman公司)；荧光显微镜BX51(Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞的分离培养

取原代神经干细胞进行悬浮培养^[11-12]：取孕12.5 d的母鼠断颈处死，然后用体积分数为75%乙醇消毒腹部，剖开腹部取出含有胚胎的子宫，置于消毒过的玻璃皿中，PBS冲洗。

在体视显微镜下剥离子宫和羊膜，取出胚胎，剥离胎膜，分离出胎脑皮质，放入离心管中，加入2 mL神经干细胞悬浮培养液(DMEM/F-12培养基加入B27(1∶50)，5 mg/L肝素，20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20 μg/L表皮生长因子，100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)，用细吸管吹打成单细胞悬液，接种到25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中。

单层培养^[13-14]：将悬浮培养的神经干细胞及培养液吸至15 mL无菌离心管，1 100 r/min离心4 min去除上清，加入0.25%胰酶和PBS，吹打成单细胞悬液，加入约8 mL PBS终止，再以1 100 r/min离心4 min去除上清，用神经干细胞单层培养液(100 mL Neurobasal^TM培养基中加入B27(1∶50)，250 μL L-Glutamine，100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)重悬，接种于包被0.1%多聚赖氨酸的6孔板，隔天换液，每3 d或4 d传代1次。

1.4.2 神经干细胞的鉴定 采用细胞免疫荧光化学法检测传代后培养两三天的神经干细胞。首先用0.01 mmol/L PBS洗涤细胞2次，10 min/次，用40 g/L多聚甲醛固定细胞20 min；再以0.01 mmol/L PBS洗涤细胞3次，10 min/次，室温下用0.01 mmol/L PBS和0.2%Triton X-100穿透胞膜30 min；体积分数为0.3%-0.5%山羊血清封闭30 min。加入一抗后4 ℃过夜孵育。第2天，用0.1 mmol/L PBS洗涤3次，10 min/次。二抗室温孵育0.5-1.0 h。0.1 mmol/L PBS洗涤3次，10 min/次。用1 mg/L DAPI复染细胞核。荧光显微镜下观察拍照。一抗为羊抗鼠nestin，所用比例为1∶500。二抗为Cy3兔抗羊IgG，所用比例为1∶100。

1.4.3 慢病毒的包装 中山大学干细胞与组织工程研究中心采用gateway技术构建并提供实验所需的携带组织特异启动子驱动荧光报告基因的慢病毒载体(pLV/Final-neo- GFAP(promoter)-dTomato)^[15-16]。

慢病毒的包装和浓缩：将上述慢病毒载体和慢病毒的包装质粒ViraPower^TM Lentiviral Packaging Mix 各4.5 mg采用脂质体Lipofectamine 2000共转入293FT细胞，进行慢病毒的包装^[17-19]。48-72 h后将含病毒的上清液收集至15 mL离心管，4 ℃、3 000 r/min条件下离心15 min，0.22 μm滤器过滤去除细胞碎片。再以4 ℃、100 000 r/min离心2 h，然后浓缩病毒，分装后存储于-80 ℃低温冰箱。

1.4.4 慢病毒感染神经干细胞 选取传代后贴壁培养的神经干细胞，换液时先加入1 mL 37 ℃预热的神经干细胞单层培养液，再加入浓缩分装的病毒悬液20 μL，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂的培养箱。8 h后将上述培养液换更为神经干细胞单层培养液。第2天重复上述步骤。连续感染3次后，采用神经干细胞单层培养液继续培养。每次实验结果均重复3次。

1.4.5 神经干细胞的纯化 连续感染神经干细胞3次后，观察细胞生长状态。待细胞状态较好时，采用300 mg/L遗传霉素G418开始筛选，连续筛选14 d^[20]。

1.4.6 纯化后神经干细胞的神经诱导分化及其鉴定 采用去除生长因子(表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子)的神经干细胞悬浮培养液对转导后纯化的神经干细胞进行神经诱导。每天观察细胞内红色荧光表达的强弱及数量的变化。再按照上述1.4.2步骤对红色荧光细胞进行免疫荧光鉴定和分析。一抗为兔抗鼠GFAP，所用比例为1∶500。二抗为Cy3羊抗兔IgG，所用比例均为1∶200。

1.5 主要观察指标 ①原代小鼠神经干细胞的形态；②小鼠神经干细胞表面标记物的表达；③慢病毒的包装和感染；④筛选和纯化后的荧光细胞的鉴定。

讨论

星形胶质细胞是哺乳动物中枢神经系统的主要细胞类型之一^[24-26]，其胞体呈星形突起状，对神经元具有支持、营养和分隔等作用，也在组织损伤修复、宿主防御机制等过程当中起到重要的作用^[27-29]。当神经系统损伤时，星形胶质细胞大量增殖且活性增强^[30]。GFAP是星形胶质细胞的细胞骨架成分和特异标志物^[31]。dTomato是一种来自水果蛋白的橙色衍生物，其分子结构具有一对发光基团，导致其亮度极强且光稳定性非常好，已广泛应用于多种组织和细胞的标记示踪^[32-34]。采用dTomato标记星形胶质细胞特异性标志物GFAP的启动子，不仅可以可视化地监控神经干细胞神经分化的动态过程，而且对于诱导的星形胶质样细胞的分离纯化、移植修复及神经分化小分子药物筛选平台的建立等具有重要的应用前景。

研究的技术难点和重点是如何将上述荧光报告系统成功导入小鼠神经干细胞。神经干细胞属于成体干细胞，难以采用线性化质粒DNA、脂质体包裹及电穿孔等方式转导基因片段，而病毒载体的感染效率则显著高于上述几种方法^[35]。目前大多数研究采用的病毒载体主要有腺病毒、反转录病毒和慢病毒等3种^[36-38]。携带外源基因片段的腺病毒无法整合至宿主染色体，因而无法获得稳定表达的细胞株。而反转录病毒只能携带片段较小的外源基因，限制了其广泛使用。以缺陷型HIV-1病毒为基础发展起来的慢病毒载体，对各类细胞均具有非常强的感染能力，且可将外源基因片段随机整合至宿主细胞染色体，此外还具有能携带较大的外源基因片段的优点^[39-40]。在本实验中，将携带neo-GFAP(promoter)-dTomato载体的慢病毒连续感染小鼠神经干细胞，随后以G418抗性筛选细胞14 d，最终获得存活的细胞，表明该细胞中已成功表达含有G418抗性的上述载体。随后在显微镜下观察发现，该细胞群体中只有极少数已自发分化的细胞表达红色荧光，而大部分细胞均未见荧光表达。

在小鼠神经干细胞神经分化诱导过程中，观察到细胞内的红色荧光表达由弱到强，逐渐增加。为了对该荧光细胞的生物学特性进行鉴定，采用GFAP抗体进行复染，可以观察到红色荧光表达的细胞，与GFAP的表达部位高度重叠，证实所获得的红色荧光细胞为星形胶质样细胞。因此可以证明，该荧光报告系统能够成功地表达于小鼠神经干细胞，且并未引起其明显的自发分化。向神经诱导分化过程中，dTomato荧光信号在细胞内逐步增强，该过程可视化地体外示踪和反映了GFAP蛋白的表达水平。

实验成功建立了可评价神经干细胞向星形胶质细胞定向分化的荧光报告系统，并采用经典的神经诱导分化方案对该系统的可行性进行了初步验证。该系统能够可视化地示踪和监控神经干细胞定向分化为星形胶质细胞的过程，对于筛选神经分化相关小分子化合物和修复神经损伤等都具有非常重要的意义。实验不足之处是所获得的星形胶质样细胞并未能进行神经功能方面的鉴定和研究，因此这也成为下一步亟待开展和完善的工作。

神经干细胞神经分化示踪中GFAP启动子驱动荧光报告系统的价值

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