硫化氢通过缺氧诱导因子1α促进张应力下骨髓间充质细胞的成骨

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.001

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (21): 3281-3286.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.001

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硫化氢通过缺氧诱导因子1α促进张应力下骨髓间充质细胞的成骨

蒋校文，张翼，范晓升，陈彦泽

郴州市第一人民医院口腔科，南华大学转化医学研究所，湖南省郴州市 423000

修回日期:2017-04-26 出版日期:2017-07-28 发布日期:2017-08-02
通讯作者: 蒋校文。郴州市第一人民医院口腔科，南华大学转化医学研究所，湖南省郴州市 423000
作者简介:蒋校文，男，1981年生，汉族，2010年四川大学华西口腔医学院毕业，副主任医师，目前主要从事牵张成骨的机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81301651)；郴州市第一人民医院重点项目(N2015-006)

Hydrogen sulfide promotes the osteogenesis of bone marrow mesenchymal cells through hypoxia-inducible factor-1 alpha under tensile stress

Jiang Xiao-wen, Zhang Yi, Fan Xiao-sheng, Chen Yan-ze

Department of Stomatology, the First People’s Hospital of Chenzhou & Institute of Translation Medicine, University of China South, Chenzhou 423000, Hunan Province, China

Revised:2017-04-26 Online:2017-07-28 Published:2017-08-02
Contact: Jiang Xiao-wen, Department of Stomatology, the First People’s Hospital of Chenzhou & Institute of Translation Medicine, University of China South, Chenzhou 423000, Hunan Province, China
About author:Jiang Xiao-wen, Associate chief physician, Department of Stomatology, the First People’s Hospital of Chenzhou & Institute of Translation Medicine, University of China South, Chenzhou 423000, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81301651; the Key Project of the First People’s Hospital of Chenzhou, No. N2015-006

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
牵张成骨的特性：牵张成骨是一种内源性骨组织工程技术，是通过将骨骼切开，在切骨线两侧安放特制的牵张器，经过一定的延迟期后(5-7 d)，缓慢牵张切骨间隙(1.0-1.5 mm/d)，使切骨间隙不断增宽，并激发机体组织再生的潜力，在牵张间隙内不断形成新生骨组织，同时使骨骼周围的肌肉、神经、血管、皮肤等同期延长，从而达到延长骨骼的目的。
缺氧诱导因子1：即低氧诱导因子1，普遍存在于人和哺乳动物细胞内，常氧下也有表达，但合成的缺氧诱导因子1蛋白很快即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解，只有在缺氧条件下缺氧诱导因子1才可稳定表达。

摘要
背景：有研究表明，硫化氢信号能够促进牵张成骨，而具体机制尚不清楚。
目的：观察硫化氢气体信号在促进张应力下大鼠骨髓间充质细胞成骨分化过程中与缺氧诱导因子1α的关系。
方法：应用四点弯曲细胞加力装置系统，对体外分离培养的大鼠骨髓间充质细胞施加2 000 μstrain的单一周期张应力，同时通过使用工具药物改变加力单元中硫化氢及缺氧诱导因子1α的含量水平，加力后检测成骨标志物的变化。
结果与结论：①细胞成骨：外源性硫化氢信号能够促进张应力下大鼠骨髓间充质细胞成骨，而抑制加力单元缺氧诱导因子1α的表达则会减弱硫化氢信号的促进成骨作用；②结果说明：硫化氢信号系统可能通过缺氧诱导因子1α促进张应力下大鼠大鼠骨髓间充质细胞成骨作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2701-9583(蒋校文)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 硫化氢, 缺氧诱导因子, 骨髓间充质细胞, 张应力, 大鼠, 成骨, GYY4137, YC-1, 牵张成骨, 四点弯曲, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Hydrogen sulfide signaling has been proved to promote distraction osteogenesis; however, the underlying mechanism remains unclear.

OBJECTIVE: To evaluate the relationship between hydrogen sulfide and hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) during the osteogenesis of rat bone marrow mesenchymal cells under tensile stress.
METHODS: 2 000 μ strain was loaded on the in vitro cultured rat bone marrow mesenchymal cells by a four-point bending apparatus, and hydrogen sulfide donor or HIF-1α inhibitor was adopted in the tensile unit. Subsequently, the levels of osteogenic markers were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Exogenous hydrogen sulfide signaling could promote the osteogenesis of rat bone marrow mesenchymal cells under tensile stress. However, this promotion was obviously eliminated when the endogenous HIF-1α expression was inhibited. These results show that hydrogen sulfide signaling system promotes the osteogenesis of rat bone marrow mesenchymal cells under tensile stress probably through HIF-1α.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Hydrogen Sulfide, Hypoxia-Inducible Factor 1, alpha Subunit

中图分类号:

R318

蒋校文，张翼，范晓升，陈彦泽. 硫化氢通过缺氧诱导因子1α促进张应力下骨髓间充质细胞的成骨[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3281-3286.

Jiang Xiao-wen, Zhang Yi, Fan Xiao-sheng, Chen Yan-ze. Hydrogen sulfide promotes the osteogenesis of bone marrow mesenchymal cells through hypoxia-inducible factor-1 alpha under tensile stress[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(21): 3281-3286.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] 胡静.颌骨牵张成骨的临床及基础研究[J].中华口腔医学杂志, 2005,40(1):10-12.

[2] Jiang XW, Zou SJ, Ye B, et al. bFGF-Modified BMMSCs enhance bone regeneration following distraction osteogenesis in rabbits. Bone. 2010;46(4):1156-1161.

[3] 冯桂娟,郑科,宋冬惠,等.Runt相关基因2修饰的骨髓间充质干细胞促进兔下颌骨牵张成骨的研究[J].华西口腔医学杂志,2016, 34(2):125-129.

[4] Kitoh H, Kitakoji T, Tsuchiya H, et al. Transplantation of marrow-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma during distraction osteogenesis-a preliminary result of three cases. Bone. 2004;35(4):892-898.

[5] Kitoh H, Kitakoji T, Tsuchiya H, et al. Transplantation of culture expanded bone marrow cells and platelet rich plasma in distraction osteogenesis of the long bones. Bone. 2007;40(2): 522-528.

[6] Schiller JR, Moore DC, Ehrlich MG. Increased lengthening rate decreases expression of fibroblast growth factor 2, platelet-derived growth factor, vascular endothelial growth factor, and CD31 in a rat model of distraction osteogenesis. J Pediatr Orthop. 2007;27(8):961-968.

[7] Li G, Bouxsein ML, Luppen C, et al. Bone consolidation is enhanced by rhBMP-2 in a rabbit model of distraction osteogenesis. J Orthop Res. 2002;20(4):779-788.

[8] 赵芮,李汶洋,胡静.乳铁蛋白对牵张成骨促进作用的研究[J].口腔医学研究,2016,32(2):249-252.

[9] 高怡,黄培镇,李悦,等.骨碎补总黄酮对牵张成骨过程中骨形态发生蛋白-2和转化生长因子-β1表达的影响[J].广州中医药大学学报, 2016,33(5):679-683.

[10] Chan CW, Qin L, Lee KM, et al. Low intensity pulsed ultrasound accelerated bone remodeling during consolidation stage of distraction osteogenesis. J Orthop Res. 2006;24(2): 263-270.

[11] 娄腾飞,韩培.促进牵张成骨因素研究进展[J].国际骨科学杂志, 2016,37(4):242-246.

[12] 邓次妮,沈潞华.一氧化氮合酶/一氧化氮系统与心血管疾病[J].心血管病学进展,2007,28(4):603-606.

[13] 张志纯,刘启明,李曦光.一氧化氮合酶在兔下颌骨牵张成骨过程中的表达[J].中国口腔颌面外科杂志,2005,5(1):61-65.

[14] 周诺,廖妮,韦山良,等.一氧化氮合酶在犬下颌骨牵张成骨过程中的表达和意义[J].华西口腔医学杂志,2009,27(6):676-680.

[15] 吴巍,姚欣欣,李咏梅,等.一氧化氮供体在牵张成骨中对骨形成速率的影响[J].北华大学学报(自然科学版),2016,17(1):62-65.

[16] 康凯,姜洪池.气体信号分子硫化氢与疾病[J].中国普外基础与临床杂志,2009,16(2):170-173.

[17] 蒋校文,张翼,范晓升,等.硫化氢信号系统在张应力下大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的变化[J].北京口腔医学,2015, 23(1):21-24.

[18] 蒋校文,张翼,范晓升,等.张应力下大鼠骨髓间充质细胞成骨分化过程中硫化氢信号系统的作用[J].实用医学杂志, 2015,31(20): 3291-3294.

[19] Jiang XW, Chen YZ, Lu K, et al. GYY4137 promotes bone formation in a rabbit distraction osteogenesis model: a preliminary report. J Oral Maxillofac Surg. 2015;73(4): 732.e1-e6.

[20] Jiang XW, Zhang Y, Fan XS, et al. The effects of hypoxia-inducible factor (HIF)-1α protein on bone regeneration during distraction osteogenesis: ananimal study. Int J Oral Maxillofac Surg. 2016;45(2):267-272.

[21] Liu X, Pan L, Zhuo Y, et al. Hypoxia-Inducible Factor-1α is involved in the pro-angiogenic effect of hydrogen sulfide under hypoxic stress. Biol Pharm Bull. 2010;33(9):1550-1554.

[22] Bir SC, Kolluru GK, McCarthy P, et al. Hydrogen sulfide stimulates ischemic vascular remodeling through nitric oxide synthase and nitrite reduction activity regulating hypoxia- inducible factor-1α and vascular endothelial growth factor- dependent angiogenesis. J Am Heart Assoc. 2012;1(5): e004093.

[23] 胡明珠,周波,盛琼,等.PI3K/Akt /Sirt1信号通路介导硫化氢后处理对大鼠缺血心肌的保护作用[J].中国药理学通报,2016,32(2): 268-273.

[24] 杨海扣,于水,米琰,等.外源性硫化氢后处理对大鼠心肌缺血/再灌注损伤线粒体通透性转换孔的影响[J].中国药理学通报,2010, 26(7):944-947.

[25] 徐钢,季永,汪莉,等.内源性硫化氢参与缺血后处理减轻离体大鼠心脏缺血/再灌注损伤[J].中国药理学通报,2008,24(7):910-914.

[26] He JF, Xie ZJ, Zhao H, et al. Immunohistochemical and in-situ hybridization study of hypoxia inducible factor-1alpha and angiopoietin-1 in a rabbit model of mandibular distraction osteogenesis. Int J Oral Maxillofac Surg. 2008;37(6):554-560.

[27] 姚青,李筠,张鹏,等.缺氧诱导因子1和缺氧诱导因子2:结构、功能及调节[J].生命科学,2011,23(6):753-761.

[28] 赵光宗,方军,丁刚,等.拉喹莫德抑制成骨细胞中缺氧诱导因子2α的表达及其功能[J].中国组织工程研究,2016,20(7):917-924.

[29] Budde MW, Roth MB. Hydrogen sulfide increases hypoxia-inducible factor-1 activity independently of von Hippel-Lindau tumor suppressor-1 in C. elegans. Mol Biol Cell. 2010;21(1):212-217.

[30] 陈娣,潘昊,李醇文,等.硫化氢对心肺复苏后大鼠心肌缺氧诱导因子α的影响[J].中华急诊医学杂志,2011,20(7):687-691.

[31] 陶蓓蓓,张彩彩,刘姝媛,等.低氧诱导因子1参与常氧条件下硫化氢促血管内皮细胞迁移的作用[J].生理学报, 2012,64(2):129- 134.

[32] Edelmayer M, Al-Habbal D, Pensch M, et al. Effect of prolyl hydroxylase inhibitor-loaded collagen barrier membranes on osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. J Biomater Appl. 2017. doi: 10.1177/0885328217702563.

[33] Böhm AM, Dirckx N, Maes C. Recruitment of osteogenic cells to bone formation sites during development and fracture repair - German Version. Z Rheumatol. 2016;75(3):316-321.

[34] Stegen S, van Gastel N, Eelen G, et al. HIF-1α Promotes Glutamine-Mediated Redox Homeostasis and Glycogen-Dependent Bioenergetics to Support Postimplantation Bone Cell Survival. Cell Metab. 2016; 23(2):265-279.

[35] Zhang T, Xie J, Sun K, et al. Physiological oxygen tension modulates soluble growth factor profile after crosstalk between chondrocytes and osteoblasts. Cell Prolif. 2016; 49(1):122-133.

[36] Kuroyanagi G, Otsuka T, Yamamoto N, et al. Mimosine suppresses the PGF2α-induced synthesis of osteoprotegerin but not interleukin-6 in osteoblasts. Int J Mol Med. 2016;37(2): 533-541.

[37] Cui M, Kanemoto S, Cui X, et al. OASIS modulates hypoxia pathway activity to regulate bone angiogenesis. Sci Rep. 2015;5:16455.

[38] Huang J, Liu L, Feng M, et al. Effect of CoCl2 on fracture repair in a rat model of bone fracture. Mol Med Rep. 2015; 12(4):5951-5956.

[39] Chen NX, O'Neill KD, Allen MR, et al. Low Bone Turnover in Chronic Kidney Disease Is Associated with Decreased VEGF-A Expression and Osteoblast Differentiation. Am J Nephrol. 2015;41(6):464-473.

[40] Xing Y, Wang R, Chen D, et al. COX2 is involved in hypoxia-induced TNF-α expression in osteoblast. Sci Rep. 2015;5:10020.

[41] Quinlan E, Partap S, Azevedo MM, et al. Hypoxia-mimicking bioactive glass/collagen glycosaminoglycan composite scaffolds to enhance angiogenesis and bone repair. Biomaterials. 2015;52:358-366.

[42] Johnson RW, Schipani E, Giaccia AJ. HIF targets in bone remodeling and metastatic disease.Pharmacol Ther. 2015; 150:169-177.

[43] Liu XD, Cai F, Liu L, et al. MicroRNA-210 is involved in the regulation of postmenopausal osteoporosis through promotion of VEGF expression and osteoblast differentiation. Biol Chem. 2015;396(4):339-347.

[44] Peng J, Lai ZG, Fang ZL, et al. Dimethyloxalylglycine prevents bone loss in ovariectomized C57BL/6J mice through enhanced angiogenesis and osteogenesis. PLoS One. 2014; 9(11):e112744.

[45] Kawao N, Tamura Y, Okumoto K, et al. Tissue-type plasminogen activator deficiency delays bone repair: roles of osteoblastic proliferation and vascular endothelial growth factor. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2014;307(3): E278-E288.

[46] Regan JN, Lim J, Shi Y, et al. Up-regulation of glycolytic metabolism is required for HIF1α-driven bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(23):8673-8678.

[47] Kusumbe AP, Ramasamy SK, Adams RH. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone. Nature. 2014;507(7492):323-328.

[48] Zhao G, Liu Y, Fang J, et al. Dimethyl fumarate inhibits the expression and function of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α). Biochem Biophys Res Commun. 2014;448(3): 303-307.

[49] Liu X, Tu Y, Zhang L, et al. Prolyl hydroxylase inhibitors protect from the bone loss in ovariectomy rats by increasing bone vascularity. Cell Biochem Biophys. 2014;69(1):141-149.

[50] Dirckx N, Van Hul M, Maes C. Osteoblast recruitment to sites of bone formation in skeletal development, homeostasis, and regeneration. Birth Defects Res C Embryo Today. 2013;99(3): 170-191.

[51] Dorjgochoo T, Zheng Y, Gao YT, et al. No association between genetic variants in angiogenesis and inflammation pathway genes and breast cancer survival among Chinese women.Cancer Epidemiol. 2013;37(5):619-624.

[52] Wan C, Gilbert SR, Wang Y, et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1α pathway accelerates bone regeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105(2):686-691.

引言

牵张成骨(distraction osteogenesis，DO)是通过对切开具有成骨能力的骨段施加特定大小和频率的牵张力，从而使牵张间隙硬组织生成并同时达到拉伸软组织目的的内源性组织工程，已经成为肢体长骨和颅颌面骨发育不全、缺损重要的治疗手段^[1]。但是牵张成骨在临床上仍存在如：治疗周期过长、感染、成骨不良等诸多并发症限制其在临床上的广泛运用^[1]。近年来国内外学者通过基因转染、细胞移植、生长因子、中药、超声等多种手段促进牵张成骨^[2-10]，取得了一定的实验室结果，但能够广泛运用在临床上还有比较遥远的距离^[11]。就其关键原因可能还是牵张成骨过程是一个既不同于胚胎成骨发育，又不完全等同于骨折修复的过程，特定的牵张力是如何控制牵张成骨这一复杂过程的分子机制还不清楚，因此牵张成骨的机制完善仍是解决牵张成骨广泛运用问题的关键。

气体递质是内源性气体信号分子，包括一氧化氮、一氧化碳和硫化氢(H₂S)，近来研究发现小分子信号气体参与多种生理及病理过程。目前气体递质在牵张成骨过程中的表达变化及作用机制研究研究较少。一氧化氮是第一个被确定的气体信号分子。在多种哺乳动物细胞中，L精氨酸和氧气在多种一氧化氮合成酶的氧化催化下产生一氧化氮。一氧化氮生物学效应的发现是一次革命，使人类第一次认识到气体也可作为重要细胞信号分子^[12]。在牵张成骨中，一氧化氮的研究较多，有学者通过兔及犬下颌骨牵张成骨模型均发现下颌骨牵张成骨过程中一氧化氮合酶在不同时期具有不同的表现，提示一氧化氮信号系统对牵张成骨的新骨生成具有一定的调节作用^[13-14]。吴巍等^[15]在兔下颌骨牵张成骨过程中进一步使用一氧化氮供体发现能够促进牵张成骨新骨生成。H₂S是被第3个发现的气体信号分子，这种臭鸡蛋味道的气体能在哺乳动物细胞内产生，制造H₂S的关键酶包括胱硫醚γ裂解酶、胱硫醚β合成酶和3巯基丙酮酸硫转移酶。L半胱氨酸、同型半胱氨酸和这些分子的衍生物是产生H₂S代谢过程的原料^[16]。本课题组前期首次通过四点弯曲细胞加力装置体外实验及活体动物实验研究发现小分子信号气体H₂S在牵张成骨过程中具有重要的作用，而且使用外源性H₂S信号能够促进牵张成骨。而H₂S信号系统促进牵张成骨的具体机制尚不清楚^[17-19]。实验课题组在兔下颌骨牵张成骨模型中同时发现使用缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)蛋白也能够促进牵张成骨新骨生成^[20]。有学者在血管内皮细胞模型中的研究中发现H₂S通过调节缺氧诱导因子激活下游信号通路发挥生物功能^[21-22]。

因此实验提出假设，在牵张成骨过程中，H₂S小分子信号体系是否通过激活缺氧诱导因子来促进成骨。为了验证这一假设实验选用四点弯曲细胞加力装置对大鼠骨髓间充质细胞(bone marrow mesenchymal cell，BMMC)施加特定大小张应力，同时使用缺氧诱导因子工具药物改变细胞单元的缺氧诱导因子1α水平，来研究缺氧诱导因子1α在H₂S促进牵张成骨的过程中的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 2015年9月至2016年2月在南华大学转化研究所完成。

1.3 材料 健康2月龄雄性SD大鼠，体质量250-350 g，由南华大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(湘) 2010-0006。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠骨髓骨髓间充质细胞的分离和培养 无菌条件下取出双侧股骨和胫骨，用培养基冲出骨髓，离心弃去脂肪层后吹打制成细胞悬液，加入Percoll分离液(美国Gibco公司)后离心后吸取界面细胞层，用含体积分数5%胎牛血清的PBS洗涤细胞3次后弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的LG-DMEM培养基(美国Gibco公司)吹成细胞悬液。最终所获细胞接种于培养瓶内，培养箱内培养2 d 后更换培养基，倒置显微镜下观察当细胞融合浓度达70%-80%时，用体积分数0.25%的胰蛋白酶消化细胞传代，选用第3代细胞进行下一步实验。

1.4.2 细胞加力 选择生长良好的细胞以1.5×10⁵/cm²的浓度接种于特制的塑料培养板上^[1]，继续培养24 h后，在特制培养皿内以单一周期张应力加力60 min(通过四点弯曲系统(成都电子科技大学)对细胞培养板施加频率为 0.5 Hz 的垂直力，使培养板位移为1 mm，即张应力为2 000 μ strain，对应细胞变形量分别为0.2%。随机分为4组，每组8孔，其中第1组为空白对照组，仅予以加力；第2组为缺氧诱导因子1α抑制剂组，加入缺氧诱导因子1 α抑制剂(YC-1)使其培养单元终浓度为80 μmol/L；第3组为H₂S供体组，加入GYY4137，使其培养单元终浓度为4 mmol/L；第4组为缺氧诱导因子1α抑制/H₂S供体组，是在第3组的基础上加入YC-1，使其培养单元终浓度为80 μmol/L。培养2 h后收集培养液及细胞进行下一步检测。

1.4.3 细胞计数 培养24 h后弃去培养皿中液体，取出培养板，PBS 清洗后，胰酶消化，收集培养板上细胞，离心后制备成细胞悬液后锥虫蓝色后计数板上计数，并换算成细胞数量。

1.4.4 H₂S相对含量检测通过敏感硫电极方法建立标准硫离子曲线。收集加力结束后培养皿中培养液及细胞移入反应瓶(10 mL锥形瓶，瓶底中央约有直径1 cm、高0.8 cm的中央孔)，再加入1 mol/L的HCl共0.5 mL使检测物中的H₂S释放，反应瓶中央孔内加入1 mol/L的NaOH 0.5 mL以吸收释放H₂S，迅速封口，37 ℃水浴摇床孵育4 h，取中央孔液体用敏感硫电极测定溶液中H₂S相对含量^[17]。

1.4.5 碱性磷酸酶测定 将加力后2 h 培养板上的细胞PBS 洗涤、胰酶消化，与3 mL带血清培养基混匀，离心弃上清，再加入2 mL PBS经过混匀离心弃上清，最后加入90 μL PBS液收集细胞。将细胞反复冻融3次，利用碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成)检测其450 nm波长下碱性磷酸酶活性，结果以U/mg表示，即得到该样本每毫克冻融蛋白所含的碱性磷酸酶活性。

1.4.6 骨钙素测定 使用试剂盒中标准品450 nm波长下测量后计算出标准曲线的直线回归方程。收集加力后2 h培养皿内1 mL培养液离心后收集上清，酶标包被板中入待测样本10 μL，再加样本稀释液40 μL后37 ℃温育30 min，弃液洗板后加入酶标工作液50 μL，37 ℃温育30 min后弃液加入显色剂，37 ℃避光显色15 min后检测其450 nm波长下吸光值，通过方程计算出培养液内骨钙素相对浓度。

1.4.7 Ⅰ型胶原氨基端前肽(PINP)测定 使用试剂盒(科瑞美，北京)中标准品450 nm波长下测量后计算出标准曲线的直线回归方程。收集加力后2 h培养皿内1 mL培养液离心后收集上清，酶标包被板中入待测样本5 μL，再加样本稀释液45 μL后，再加入PINP生物素室温温育30 min，弃液洗板后加入酶标工作液150 μL，室温温育30 min后弃液加入显色剂，避光显色30 min后加入终止液后检测其450 nm波长下吸光值，通过方程计算出培养液内PINP相对浓度。

1.4.8 Real time-PCR测定 收集培养板上加力后2 h细胞，参照Trizol试剂盒(Gibco，纽约，美国)说明书提取细胞细胞总RNA；用紫外分光光度计测量其浓度; 采用反转录试剂盒(TaKaRa，大连，中国)在BioRad 1 000^TM上反转录成cDNA，再以第1链cDNA 为模板，采用SYBR GreenⅠ染料进行实时荧光定量RT-PCR反应。

实验以GAPDH 为内参基因，PCR 反应所用的上游引物为5’-CTT CGT CAG CGT CCT ATC AGT TC-3’，下游引物为5’-CAG CGT CAA CAC CAT CAT TCT G-3’。分析成骨细胞转录因子2 (runt-related transcription factor 2，Runx2) mRNA 相对表达量，其上游引物为5’-TAT GAC TCT ACC CAC GGC AAG T-3’，下游引物为5’-ATA CTC AGC ACC AGC ATC ACC-3’。PCR扩增条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，共40个循环。目的基因的相对含量表达为Runx2与对应组GAPDH测量值的比值。

1.4.9 Western Blot检测缺氧诱导因子1α蛋白表达 加力结束后立即收集培养板上的细胞利用细胞裂解液得到总蛋白，以牛血清为标准品，利用BCA蛋白定量试剂盒(美国Gibco公司)建立标准曲线，计算总蛋白浓度，取总蛋白为20 μg行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，脱脂奶粉封闭后一抗(兔抗鼠缺氧诱导因子1α多克隆抗体，1∶500；英国Abcam公司)孵育过夜后二抗(羊抗兔lgG，1∶500；武汉博士德公司)37 ℃孵育1 h后置于自动成像仪暗匣中加显影液，计算机扫描收集图像。

1.5 主要观察指标 各组H₂S、碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅰ型胶原氨基端前肽(PINP)、Runx2、缺氧诱导因子1α的检测结果。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0软件对实验数据进行统计学分析，结果以x(_)±s表示，组间数据采用单因素方差分析和LSD检验比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

H₂S信号分子在在牵张成骨中的研究罕见报道，但是通过前期的实验背景和实验的结果发现其在牵张成骨过程中起着一定的作用。作为被发现的第3种小分子信号气体，H₂S一直是心血管系统研究的明星分子^[23-25]。实验前期通过大鼠骨髓间充质细胞的体外四点弯曲实验发现H₂S信号参与了张应力下成骨分化的过程，还证明H₂S信号系统的减弱可能是过大牵张力下成骨能力减弱的原因之一^[17-18]。同时发现通过GYY4137这一新型H₂S供体能够持续释放H₂S，并能够促进牵张成骨^[19]。因为牵张成骨的过程属于一种乏氧状态，研究发现在牵张成骨动物模型中持续表达缺氧诱导因子^[26]，实验在兔下颌骨牵张成骨过程总使用重组缺氧诱导因子蛋发现其能够促进成骨^[20]。同时，有学者在内皮细胞体外实验中发现，H₂S气体是通过缺氧诱导因子发挥其成血管作用。因此，实验猜想，在牵张成骨过程中，H₂S信号系统也是通过促进缺氧诱导因子促进成骨。为了证明该假说，实验选用了四点弯曲加力装置创造张应力环境，同时使用大鼠骨髓间充质细胞这一牵张成骨中重要的作用细胞作为研究对象，通过使用工具药物改变细胞加力环境中的H₂S及缺氧诱导因子的表达，同时检测加力单位细胞或培养基的碱性磷酸酶、骨钙素、Runx2及PINP等成骨相关指标的变化，进一步丰富牵张成骨的分子机制。碱性磷酸酶及Runx2是早期成骨分化的成骨标志，骨钙素及PINP是成骨晚期。实验结果发现在无外源性H₂S信号表达下，抑制加力单元中缺氧诱导因子的表达，减弱了成骨矿化能力；施加外源性H₂S信号后能够促进细胞的早期及晚期成骨矿化能力，这与实验前期的实验结果相吻合；而缺氧诱导因子抑制剂减少了单元目的蛋白的表达，同时明显减弱了外源性H₂S信号促进牵张成骨的能力。该结果提示缺氧诱导因子可能是H₂S信号促进张应力下成骨过程中重要的靶点。

既往的研究发现H₂S能够调节缺氧诱导因子的表达。缺氧诱导因子是能够应答细胞内氧气浓度的降低而对多种基因进行调控的转录因子家族，与生物体的生长、发育及一些疾病的发病机理都存在着密切的关系^[27-28]。对缺氧诱导因子的研究主要集中在缺氧诱导因子α，哺乳动物一共存在3种缺氧诱导因子α亚基(缺氧诱导因子1α，2α，3α)，其中缺氧诱导因子1α研究较多。H₂S能够增加缺氧诱导因子活性^[29]。Liu等^[21]研究发现，在低氧环境下H₂S可以通过上调缺氧诱导因子和血管内皮生长因子来促进鼠脑毛细血管内皮细胞的增殖迁移。Bir等^[22]在基因敲除小鼠模型中进一步证实，H₂S上调缺血组织和内皮细胞缺氧诱导因子的表达和功能是通过调整组织中的一氧化氮代谢来实现。陈娣等^[30]对心肺复苏后大鼠心肌细胞研究发现H₂S能够上调缺氧诱导因子水平。同时，陶蓓蓓等^[31]在常氧培养条件研究发现，H₂S能够呈剂量和时间依赖性地显著提高缺氧诱导因子1α的蛋白水平，并且对缺氧诱导因子1α mRNA水平有快速、持久的提高作用。

缺氧诱导因子1α在调节成骨-血管耦连过程中起着重要作用^[32-51]。Wan等^[52]利用基因敲除和药物途径在小鼠牵张成骨模型中证实，缺氧诱导因子通路是骨修复过程中调节成血管和成骨所必需的，通过激活缺氧诱导因子通路可以促进牵张成骨。由于牵张成骨的动物实验过程周期较长，受到的干扰因素较多，而气体分子的研究又具有一定的难度，导致小分子信号气体在牵张成骨中的研究少之又少。实验通过四点弯曲加力装置模拟牵张成骨模型，也是首次研究H₂S信号系统在张应力下成骨过程中的变化，实验发现使用缺氧诱导因子抑制剂后，加力单元缺氧诱导因子1α 蛋白有明显表达下降，同时成骨指标均反映出在原来H₂S供体作用下增强的成骨能力明显被削弱，从该层面说明缺氧诱导因子是H₂S信号下游的重要靶点。

由于小分子信号气体没有直接的标记物，在活体内很难直接定量定位研究，目前在牵张成骨的研究中罕见报道，既往的研究主要是以其限速酶最为研究对象，实验首次直接研究小分子信号气体在张应力下模拟牵张成骨的体外模型中的表达变化，具有一定的先进性。实验仍有一定的缺陷，选择体外实验的原因是体内实验干扰因素较多，难以控制，但体外实验不能替代复杂的体内环境。因此，H₂S-缺氧诱导因子信号传导在牵张成骨过程中的具体关系仍需要下一步体内更加缜密的实验内容来验证。

通过上述体外实验实验首次初步探讨了缺氧诱导因子与小分子气体H₂S在张应力下大鼠骨髓间充质细胞成骨分化中的关系，结果提示H₂S信号可能通过缺氧诱导因子促进张应力下细胞成骨能力，有利于完善牵张成骨分子机制及为牵张成骨筛选治疗药物提供一定的理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

硫化氢通过缺氧诱导因子1α促进张应力下骨髓间充质细胞的成骨

Hydrogen sulfide promotes the osteogenesis of bone marrow mesenchymal cells through hypoxia-inducible factor-1 alpha under tensile stress

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[1]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[2]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[3]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[4]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[5]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[6]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[7]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[8]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[9]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[10]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[11]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[12]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[13]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.
[14]	熊挺淋, 应梦慧, 张丽莎, 张晓刚, 杨燕. 诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1063-1067.
[15]	王新民, 刘飞, 许杰, 白玉玺, 吕剑. 髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1074-1079.