乳腺癌基质成纤维细胞内Caveolin-1蛋白对表皮生长因子的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.015

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (20): 3202-3207.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.20.015

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乳腺癌基质成纤维细胞内Caveolin-1蛋白对表皮生长因子的影响

肖亮，王莹，杨小军，杨军平

江西中医药大学附属医院检验科，江西省南昌市 330006

修回日期:2017-02-13 出版日期:2017-07-18 发布日期:2017-07-28
通讯作者: 杨军平，副教授，江西中医药大学附属医院检验科，江西省南昌市 330006
作者简介:肖亮，男，1982年生，汉族，江西省南昌市人，主管技师，硕士，主要从事医学检验及基础研究。
基金资助:
江西省卫计委中医药科研课题(2015A032)；江西省教育厅科学技术研究项目(150882)

Effects of caveolin-1 on the expression of epidermal growth factor in fibroblasts co-cultured with breast cancer cells

Xiao Liang, Wang Ying, Yang Xiao-jun, Yang Jun-ping

Department of Laboratory Medicine, the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Revised:2017-02-13 Online:2017-07-18 Published:2017-07-28
Contact: Yang Jun-ping, Associate professor, Department of Laboratory Medicine, the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Xiao Liang, Master, Technologist-in-charge, Department of Laboratory Medicine, the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
the Chinese Medicine Research Project of the Health and Family Planning Commission of Jiangxi Province, No. 2015A032; the Science and Technology Project of the Education Department of Jiangxi Province, No. 150882

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Caveolin-1蛋白与乳腺癌的关系：Caveolin-1蛋白是构成细胞胞膜窖的主要结构蛋白，相对分子质量为22 000，其基因位于人类染色体的7q31.1位置，几乎存在于所有细胞中，基质细胞例如成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞中表达最为丰富。Caveolin-1蛋白是胞膜窖的信号节点，通过各种信号通路发挥重要生物学作用，且与乳腺间质成纤维细胞的转化及肿瘤的发生发展有着密切关系。
表皮生长因子与乳腺癌的关系：表皮生长因子是研究最多也是最早被确认结构的生长因子，作为一种含有53个氨基残基的单链多肽，通过激活内在的表皮生长因子受体，经一系列的信号传递，发挥复杂的生物学效应，比如调控细胞增殖、分化、凋亡等，并且与肿瘤的发生、发展关系密切。

摘要
背景：Caveolin-1是小窝蛋白中最主要的功能蛋白，参与多种细胞生物学过程，与乳腺癌的发生、发展关系密切。
目的：探讨乳腺癌基质成纤维细胞内Caveolin-1蛋白对表皮生长因子的影响。

方法：采用siRNA技术干扰成纤维细胞ESF-1内Caveolin-1蛋白的表达，QRT-PCR、Wesren-Blot 筛选和验证siRNA的最佳干扰效果，得出最佳沉默模型为ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2。①将ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞与乳腺癌BT474细胞共培养(实验组)，以单独培养ESF-1细胞、ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞为对照，培养24，48 h后，QRT-PCR检测ESF-1细胞内表皮生长因子的表达；培养48，72 h后，ELISA检测培养液内表皮生长因子的表达；②将ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2(实验组)、ESF-1(对照组)分别与乳腺癌BT474细胞共培养，以单独培养的BT474细胞为空白对照，培养24，48 h后，CKK-8法检测BT474细胞增殖。

结果与结论：①实验组ESF-1细胞内表皮生长因子mRNA表达高于ESF-1细胞组、ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞组(P<0.05)，ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞组高于ESF-1细胞组(P < 0.05)；②实验组、ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞组培养液内表皮生长因子蛋白表达高于ESF-1细胞组(P < 0.05)，实验组高于ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞组(P < 0.05)；③培养48 h，实验组、对照组细胞增殖快于空白对照组(P < 0.05),实验组快于对照组(P < 0.05)；④结果表明，干扰Caveolin-1蛋白表达能促进纤维细胞表皮生长因子的表达，且在与乳腺癌细胞共培养条件下，作用更为显著；共培养条件下，干扰成纤维细胞Caveolin-1蛋白表达能促进乳腺癌细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0003-3095-9522(杨军平)

关键词: 组织构建, 组织工程, 乳腺癌, 成纤维细胞, Caveolin-1, 表皮生长因子, siRNA

Abstract:

BACKGROUND: Caveolin-1, as the most important functional protein in caveolae, is involoved in a variety of cell biological processes, and is closely related to the occurrence and development of breast cancer.

OBJECTIVE: To explore the effect of caveolin-1 on epidermal growth factor (EGF) in fibroblasts after co-cultured with breast cancer cells.

METHODS: Caveolin-1 expression in fibroblast lines ESF-1 was interfered with siRNA, and the optimal effect was determined through QRT-PCR and western blot assay. (1) The optimal silencing model of ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2 was obtained, which was co-cultured with breast cancer cells BT474 as experimental group, single-cultured ESF-1 and ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2 as controls. The expression level of EGF in ESF-1 was detected by QRT-PCR at 24 and 48 hours of culture; the expression level of EGF in the culture medium was detected by ELISA at 48 and 72 hours of culture. (2) ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2 (experimental group) and ESF-1 (control group) were respectively co-cultured with BT474, and single-cultured BT474 as blank control group. The proliferation of BT474 was detected by cell counting-kit 8 assay after 24- and 48-hour culture.

RESULTS AND CONCLUSION: The mRNA expression level of EGF in the experimental group was significantly higher than that in the other two groups (P < 0.05), and the EGF expression level in the ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2 group was significantly higher than that in the ESF-1 group (P < 0.05). The protein expression level of EGF was ranked as follows: experimental group > ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2 group > ESF-1 group (P < 0.05). The proliferation of BT474 cells was significantly increased after co-cultured with BT474 cells and ESF-1 siRNA Caveolin-1 cells, especially with BT474 cells (P < 0.05). Our findings suggest that Caveolin-1 siRNA can promote the expression of EGF in fibroblasts, especially co-cultured with breast cancer cells. Furthermore, caveolin-1 siRNA accelerates the proliferation of breast cancer cells after co-cultured with fibroblasts.

Key words: Breast Neoplasms, Fibroblasts, Epidermal Growth Factor, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

肖亮，王莹，杨小军，杨军平. 乳腺癌基质成纤维细胞内Caveolin-1蛋白对表皮生长因子的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(20): 3202-3207.

Xiao Liang, Wang Ying, Yang Xiao-jun, Yang Jun-ping. Effects of caveolin-1 on the expression of epidermal growth factor in fibroblasts co-cultured with breast cancer cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(20): 3202-3207.

图/表（结果） 2

2.1 ESF-1细胞Caveolin-1-siRNA基因沉默模型建立和筛选、验证

2.1.1 ESF-1细胞siRNA干扰后Caveolin-1mRNA的表达 严格按照Lipofectamine™2000瞬时转染步骤，各组分别加入相应siRNA后，24 h培养后提取总RNA，各组RNA A₂₆₀/A₂₈₀值都在2.0左右，cDNA加水稀释至一致水平，QPCR后目的基因和内参基因溶解曲线特征峰良好，证明引物的合成效果和设计特异性良好，目的基因和内参基因扩增曲线良好，证明扩增效率和cDNA质量良好。如图2所示，用2^-^??Ct方法分析QPCR实验数据，阴性对照组表达量为1，3组Caveolin-1 siRNA都能显著下调Caveolin-1 mRNA表达量(P < 0.01)，其中以Caveolin-1 SiRNA-N.2效果最为显著。

2.1.2 siRNA干扰后ESF-1细胞Caveolin-1蛋白的表达 各组蛋白稀释10倍，以BCA法测定蛋白A值，然后根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。上样量为每泳道30 μg，Western blot实验后移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影见图3A；蛋白表达Image-Pro Plus 6.0 软件计算分析后见图3B：阴性对照组的表达量为1.00，比较各组Caveolin-1的表达，3条Caveolin-1 siRNA均显著降低Caveolin-1蛋白表达量(P < 0.05)，其中CAV1-N.2干扰RNA组作用最显著，说明 siRNA-Caveolin-1 N.2完全能满足后续实验所需。

2.2 各组ESF-1细胞内表皮生长因子的表达

2.2.1 ESF-1细胞内表皮生长因子mRNA的表达 培养24，48 h后，qRT-PCR检测各组ESF-1细胞内表皮生长因子mRNA的相对表达，见图4：ESF-1细胞组、ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞组(P < 0.05)，ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞组高于ESF-1细胞组(P < 0.05)。

2.2.2 ESF-1细胞培养液内表皮生长因子蛋白的表达 培养48，72 h后，ELISA方法检测各组细胞培养液内EGF的质量浓度，见图5，实验组、ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞组培养液内表皮生长因子蛋白表达高于ESF-1细胞组(P < 0.05)，实验组高于ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞组(P < 0.05)。

2.3 siRNA干扰成纤维细胞ESF-1内Caveolin-1蛋白表达对乳腺癌细胞BT474增殖的影响培养24，48 h后，CCK-8法检测各组BT474细胞增殖情况，见图6：培养24 h，各组BT474细胞增殖情况无显著差别(P > 0.05)；培养48 h后，实验组、对照组细胞增殖快于空白对照组(P < 0.05)，实验组快于对照组(P < 0.05)。

参考文献

[1] Criscitiello C,Esposito A,Curiqliano G.Tumor-stroma crosstalk:targeting stroma in breast cancer.Curr Opin Oncol. 2014;26:551-555.

[2] Williams TM,Sotgia F,Lee H,et al.Stromal and epithelial Caveolin-1 both confer a protective effect against mammary hyperplasia and tumorigenesis: Caveolin-1 antagonizes cyclin D1 function in mammary epithelial cells.Am J Pathol. 2006;169(5):1784-1801.

[3] Savage K,Lambros MB,Robertson D,et al.Caveolin-1 is overexpressed and amplified in a subset of basal-like and metaplastic breast carcinomas:a morphologic, ultrastructural, immunohistochemical, and in situ hybridization analysis.Clin Cancer Res.2007;13:90-101.

[4] Liedtkeg C,Kersting C,Burger H,et al.Caveolin-1 expression in bengin and malignant lesions of the breast.World J Surg Oncol.2007;5:110.

[5] Anwar SL,Wahyono A,Aryandono T,et al.Caveolin-1 in Breast cancer:single molecule regulation of multiple key signaling pathways.Asian Pac J Cancer Prev.2015;16:6803-6812.

[6] Drab M,Verkade P,Elger M,Kasper M,et al.Loss of caveolae,vascular dysfunction, and pulmonary defects in Caveolin-1 gene-disrupted mice.Science.2001;293: 2449-2452.

[7] Razani B,Woodman SE,Lisanti MP.Caveolae: from cell biology to animal physiology.Pharmacol Rev.2002;54: 431-467.

[8] Scherer PE,Lewis RY,Volonte D,et al.Cell-type and tissue-specific expression of caveolin-2. Caveolins 1 and 2 co-localize and form a stable hetero-oligomeric complex in vivo.J Biol Chem.1997;272(46):29337-29346.

[9] Mercier I,Jasmin JF,Pavlides S,et al.Clinical and translational implications of the caveolin gene family: lessons from mouse models and human genetic disorders.Lab Invest.2009;89: 614-623.

[10] Quest AF,Lobos-González L,Nuñez S,et al.The caveolin-1 connection to cell death and survival.Curr Mol Med.2013; 13(2):266-281.

[11] Boscher C,Nabi IR.Galectin-3-and phospho-caveolin-1 dependent outside-in integrin signaling mediates the EGF motogenic response in mammary cancer cells.Mol Biol Cell. 2013；24:2134-2145.

[12] Thomas NB,Hutcheson IR,Campbell L,et al.Growth of hormone-dependent MCF-7 breast cancer cells is promoted by constitutive caveolin-1 whose expression is lost in an EGF-R-mediated manner during development of tamoxifen resistance.Breast Cancer Res Treat.2010;119(3):575-591.

[13] Shi XY,Xiong LX,Xiao L,et al.Downregulation of caveolin?1 upregulates the expression of growth factors and regulators in co?culture of fibroblasts with cancer cells.Mol Med Rep. 2016;13(1):744-752.

[14] 石小玉,肖亮,熊丽霞,等.Caveolin-1-siRNA对与乳腺癌细胞共培养的成纤维细胞自噬体表达影响的研究[J].中国细胞生物学学报,2015,37(3):212-220.

[15] Sloan EK,Ciocca DR,Pouliot N,et al.Stromal cell expression of Caveolin-1 predicts outcome in breast cancer.Am J Pathol. 2009;174:2035-2043.

[16] Williams TM,Medina F,Badano I,et al.Caveolin-1 gene disruption promotes mammary tumorigenesis and dramatically enhances lung metastasis invivo: role of Cav-1 in cell invasiveness and matrix met alloproteinase (MMP-2/9) secretion.J Biol Chem.2004;279: 51630-51646.

[17] Hayashi K,Matsuda S,Machida K,et al.Invasion activating Caveolin-1 mutation in human scirrhous breast cancers. Cancer Res.2001;61:2361-2364.

[18] Goetz JG,Lajoie P,Wiseman SM,et al.Caveolin-1 in tumor progression: the good,the bad and the ugly.Cancer Metastasis Rev.2008;27:715-735.

[19] Lock R,Debnath J.Extracellular matrix regulation of autophagy. Curr Opin Cell Biol.2008;20:583-588.

[20] Fiucci G,Ravid D,Reich R,et al.Caveolin-1 inhibits anchorage-independent growth, anoikis and invasiveness in MCF-7 human breast cancer cells.Oncogene.2002;21: 2365-2375.

[21] Engelman JA,Wykoff CC,Yasuhara S,et al.Recombinant expression of Caveolin-1 in oncogenically transformed cells abrogates anchorage-independent Growth.Biol Chem.1997; 272:16374-16381.

[22] Glait C,Ravid D,Lee SW,et al.Caveolin-1 controls BRCA1 gene expression and cellular localization in human breast cancer cells.FEBS Lett.2006;580:5268-5274.

[23] Lanuti M,Liu G,Goodwin JM,et al.A functional epidermal growth factor(EGF) polymorphism,EFG serum levels,and esophageal adenocarcinoma risk and outcome.Clin Cancer Res,2008,14:3216-3222.

[24] Kim J,Kong J,Chang H,et al.EGF induces epithelial- mesenchymal transition through phospho-Smad2/3-Snail signaling pathway in breast cancer cells.Oncotarget.2016.doi: 10.18632/oncotarget.13116.[Epub ahead of print]

[25] Kainulainen V,Sundwall M,Maatta JA,et al.A natural ErbB4 isform that does not activate phosphoinositide 3-kinase mediates proliferation but not survival or chemotaxis.J Biol Chem.2000;275:8641-8649.

[26] Shlessinger J.Cell signaling by receptor tyrosine kinases.Cell. 2002;103:211-225.

[27] Mouneimne G,Desmarais V,Sidani M,et al.Spatial and temporal control of cofilin activity is required for directional sensing during chemotaxis.Curr Biol.2006;16:2193-2205.

[28] Chan AY,Raft S,Bailly M,et al.EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells.J Cell Sci. 1998;111:199-211.

[29] Wang W,Eddy R,Condeelis J.The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis.Nat Rev Cancer.2007;7: 429-440.

[30] Al Moustafa AE,Achkhar A,Yasmeen A.EGF-receptor signaling and epithelial-mesenchymal transiton in hunman carcinomas.Front Biosci(Schol ED).2012;4:671-684.

[31] Boccaccio C,Luraqhi P,Comoqlio PM.MET-mediated resistance to EGFR inhibitors:an old liaison rooted in colorectal cancer stem cells.Cancer Res.2014;74:3647-3651.

[32] Luan TY,Zhu TN,Cui YJ,et al.Expression of caveolin-1 is correlated with lung adenocarcinoma proliferation, migration, and invasion.Med Oncol.2015;32(7):207.

[33] Moreno-Càceres J,Caja L,Mainez J,et al.Caveolin-1 is required for TGF-β-induced transactivation of the EGF receptor pathway in hepatocytes through the activation of the metalloprotease TACE/ADAM17.Cell Death Dis.2014;5: e1326.

[34] Yu XW,Lin S,Du HZ,et al.Synergistic combination of DT-13 and topotecan inhibits human gastric cancer via myosin IIA-induced endocytosis of EGF receptor in vitro and in vivo.Oncotarget.2016;7:32990-3003.

[35] Agelaki S,Spiliotaki M,Markomanolaki H,et al.Caveolin-1 regulates EGFR signaling in MCF-7 breast cancer cells and enhances gefitinib-induced tumor cell inhibition.Cancer Biol Ther.2009;8915:1470-1477.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年11月至2015年2月在江西中医药大学附属医院完成。

1.3 材料 人表皮成纤维细胞CCC-ESF-1购自于中科院基础医学研究所，编号为No.3111C0001-CCC000108；人乳腺导管癌细胞BT474购自于中科院上海生命科学院细胞中心，编号为No.TCHu143；Transwell小室(0.4 μm)购自于Fisher Scientific公司；总RNA(高纯)快速提取试剂盒购自于Generay公司；反转录试剂盒Fast Quant RT Kit(with gDNase)购自于TIANGEN公司；qPCR试剂IQ SYBR Green Supermix购自Bio-Rad公司；Lipofectamine 2000试剂、DMEM-H培养基购自于GIBCO公司；Caveolin-1 siRNA套装、Caveolin-1引物、表皮生长因子引物购自上海吉玛生物公司；Caveolin-1 Antibody购自Santa Cruz公司；Human EGF ELISA Kit购自R&D Systems公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁公司。

1.4 实验方法

1.4.1 ESF-1细胞Caveolin-1-siRNA基因沉默模型建立和筛选、验证 取对数生长期的ESF-1细胞，均匀铺呈于6孔板内，每孔约2×10⁸ L^-1，加入DMEM-H培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱内(湿度95%左右)培养，实验分为空白对照组、转染试剂对照组、阴性对照组、CAV1-N.1 干扰RNA1组、CAV1-N.2干扰RNA2组、CAV1-N.3干扰RNA3组，严格按照Lipofectamine™2000试剂说明书及《推荐试剂的量和体积》进行实验转染，转染后培养24 h，qRT-PCR检测Caveolin-1 mRNA的转录，筛选出最合适的Caveolin-1-siRNA；转染后培养48 h，Western blot检测Caveolin-1蛋白表达，对刷选出最合适的Caveolin-1- siRNA进行验证，并用于以下实验。Caveolin-1上游引物为：5’-ACA TCT CTA CAC CGT TCC CAT-3’；下游引物为：5’-TGT GTG TCC CTT CTG GTT CTG-3’。

1.4.2 细胞共培养模式 通过具有通透性的悬挂小室，将BT474和ESF-1细胞分别接种于上下室，使细胞相互影响，达到非接触式共培养的目的(图1)。ESF-1细胞内表皮生长因子表达检测：取对数生长期ESF-1-CAV1-N.2细胞(实验组)，接种于悬挂小室下室；取对数生长期的BT474细胞，接种于悬挂小室上室，均匀铺呈于6孔板内，每孔约2×10⁸ L^-1，以单独培养的ESF-1细胞、ESF-1-CAV1-N.2细胞为对照；培养或共培养24，48 h后，qRT-PCR检测ESF-1细胞内表皮生长因子mRNA的表达，表皮生长因子上游引物为5' CAA AAC GCCGAAG ACT TACC 3'；下游引物为5' GAC CAT CCA GAG CCA GACAC 3'；培养48，72 h，ELISA方法检测细胞培养液内表皮生长因子质量浓度。

CCK-8法检测乳腺癌细胞增殖：取对数生长期的BT474细胞，接种于悬挂小室下室；取对数生长期的ESF-1细胞(对照组)、ESF-1-CAV1-N.2细胞(实验组)，分别接种于悬挂小室上室，均匀铺呈于6孔板内，每孔约2×10⁸ L^-1，以单独培养的BT474细胞为空白对照组。培养24，48 h后，CCK-8法检测BT474细胞增殖。

1.5 主要观察指标 培养24，48 h后，QRT-PCR检测ESF-1细胞内表皮生长因子的表达；培养48，72 h后，ELISA检测培养液内表皮生长因子的表达；培养24，48 h后，CKK-8法检测BT474细胞增殖。

1.6 统计学分析 实验数据处理使用 SPSS Statistics 17.0软件统计包，实验结果用x(_)±s表示；采用t 检验分析及多重方差分析两组别之间差异，P < 0.05为差异有显著性意义；PCR数据采用 Bio-Rad CFX Manager 软件分析。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

虽然近来乳腺肿瘤微环境已成为乳腺癌研究的新热点，但有关Caveolin-1基因(被普遍认为是候选抑癌基因)与乳腺癌的研究还较少。实验利用共培养及siRNA技术，探索了乳腺成纤维细胞ESF-1内Caveolin-1蛋白对表皮生长因子表达及乳腺癌BT474细胞增殖的影响。

Caveolin-1 是小窝蛋白中最主要的功能蛋白，参与多种细胞生物学过程^[15-16]，并与乳腺癌的发生、发展关系密切^[17-18]。据乳腺癌患者统计数据表明，约16%的乳腺癌患者可见Caveolin-1基因的表观遗传学改变^[19]。在肿瘤微环境中转化的成纤维细胞内可见Caveolin-1表达明显减少^[20]，并且重表达Caveolin-1后可见某些转化特性的反转^[21]；研究还表明，过表达Caveolin-1蛋白能抑制乳腺癌细胞的增殖扩散，基质金属蛋白酶2的活性及乳腺癌细胞非依赖性集落的形成^[22-23]；同时，Caveolin-1还能调节乳腺癌易感基因BRAC1的表达，发挥抑癌作用^[24]。

表皮生长因子是研究最多也是最早被确认结构的生长因子，作为一种含有53个氨基残基的单链多肽，通过激活内在的表皮生长因子受体，经一系列的信号传递，发挥复杂的生物学效应，比如调控细胞增殖、分化、凋亡等，并且与肿瘤的发生、发展关系密切^[25-26]；现在研究表明，在肿瘤环境中，表皮生长因子与表皮生长因子受体及其他受体共同结合后，发生二聚化，使内在酪氨酸激酶磷酸化，激活下游信号分子介导细胞趋化运动，加速肿瘤的迁移^[27-28]，而且表皮生长因子还能诱导肌动蛋白的聚合，影响肿瘤细胞的迁移^[29-31]；表皮生长因子还与表皮成纤维细胞转化密切相关，能够影响乳腺成纤维细胞内波形蛋白、纤连蛋白、肌动蛋白等的表达，导致细胞失去极性，胞间连接破坏、胞内肌动蛋白骨架重组等一系列的改变，降低细胞黏附能力，影响肿瘤的发生发展^[32-33]。相关研究还表明，Caveolin-1蛋白也能通过调控表皮生长因子及其受体的表达，影响肿瘤的发生、发展，但Caveolin-1对肿瘤的促进作用或是抑制作用与肿瘤类型相关。在肺腺癌中，过表达的Caveolin-1蛋白能够调控表皮生长因子及其受体的活性，促进肿瘤细胞的增殖及侵袭^[34]；在肝癌中，Caveolin-1能通过表皮生长因子/表皮生长因子受体信号通路，能促进肿瘤的发生^[35]；在胃癌中，Caveolin-1可介导内吞表皮生长因子受体作用，促进表皮生长因子受体的泛素华降解，抑制表皮生长因子/表皮生长因子受体下游信号通路，促进细胞凋亡作用；在乳腺癌中，Caveolin-1能够抑制表皮生长因子/表皮生长因子受体信号通路的活化，影响肿瘤的发生发展^[11]。

实验利用合成的3组Caveolin-1小干扰RNA(siRNA)，通过Lipofectamine™2000试剂转染成纤维细胞ESF-1，然后从mRNA及蛋白水平筛选、验证，成功的建立了成纤维细胞ESF-1的Caveolin-1 siRNA干扰模型，完全可用于后续研究。

为了探讨在与乳腺肿瘤细胞共培养环境中，抑制成纤维细胞Caveolin-1蛋白的表达，对成纤维细胞内表皮生长因子表达的影响，研究利用细胞共培养技术，采用Caveolin-1-siRNA转染成纤维细胞ESF-1，检测细胞表皮生长因子的表达，结果显示，与ESF-1细胞单独培养相比，ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞组内表皮生长因子的mRNA、蛋白水平表达均升高。实验结果说明，Caveolin-1蛋白表达与表皮生长因子存在关联，而且是负相关，与国外相关报道的实验结果一致^[11^，^35]；另与ESF-1-Caveolin-1 SiRNA-N.2细胞组比较，实验组中ESF-1细胞内mRNA表达显著增高，说明与乳腺肿瘤细胞共培养也能促进ESF-1细胞内表皮生长因子mRNA的表达，具体原因仍待进一步阐明。

研究还利用CCK-8法检测了各组乳腺癌BT474细胞增殖情况，实验结果显示培养24 h，各组BT474细胞增殖情况无显著差别(P > 0.05)，这可能因为细胞培养时间过短，作为贴壁生长的乳腺癌BT474细胞，大部分还未进入对数增殖期；培养48 h后，相较于空白对照组及对照组，实验组内BT474细胞增殖明显(P < 0.05)，说明在与乳腺癌共培养环境中，下调成纤维细胞内Caveolin-1蛋白的表达能促进与之共培养乳腺癌细胞的增殖。

综上所述，研究成功建立了乳腺癌与成纤维细胞的共培养模型并成功筛选出Caveolin-1 siRNA模型；同时实验结果还显示抑制Caveolin-1蛋白能促进表皮生长因子的表达，下调成纤维细胞内Caveolin-1蛋白的表达能促进与之共培养乳腺癌细胞的增殖。这为后续研究Caveolin-1蛋白与成纤维细胞的转化提供了坚实基础，也为研究Caveolin-1蛋白与乳腺癌的关系提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

乳腺癌基质成纤维细胞内Caveolin-1蛋白对表皮生长因子的影响

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[1]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[2]	李琴, 毛双法, 李敏, 程基焱. 石斛多糖保护中波紫外线损伤成纤维细胞的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1228-1233.
[3]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[4]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[5]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[6]	陈晓旭, 罗雅馨, 毕浩然, 杨琨. 脱细胞支架制备及其在组织工程和再生医学中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 591-596.
[7]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[8]	沈佳华, 付勇. 基于石墨烯的纳米材料可否在干细胞领域应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 604-609.
[9]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[10]	李辉, 陈良龙. 植骨材料在脊柱结核治疗中的应用与特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 626-630.
[11]	高仓健, 杨振, 刘舒云, 李浩, 付力伟, 赵天元, 陈威, 廖志垚, 李品学, 眭翔, 郭全义. 静电纺丝技术在肩袖损伤修复中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 637-642.
[12]	何云影, 李玲婕, 张舒淇, 李雨舟, 杨生, 季平. 聚丙烯酸/琼脂糖三维培养构建细胞球的方法[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 553-559.
[13]	何冠宇, 徐宝山, 杜立龙, 张同星, 霍振鑫, 申力. 天然丝素蛋白构建仿生取向微通道纤维环支架[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 560-566.
[14]	关健, 贾燕飞, 张葆鑫, 赵国中. 4D生物打印在组织工程的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 446-455.
[15]	刘家利, 索海瑞, 杨翰, 王玲, 徐铭恩. 填充结构对3D打印聚己内酯支架力学性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 10(16): 2612-2617.