脂肪间充质干细胞移植上调肝脏增殖细胞核抗原表达促进肝细胞的再生

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.011

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2690-2695.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.011

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脂肪间充质干细胞移植上调肝脏增殖细胞核抗原表达促进肝细胞的再生

史光军¹，张亚东²，胡音音³，谭雪莹¹

¹青岛大学附属青岛市市立医院，山东省青岛市 266000；²青岛大学医学院，山东省青岛市 266071；³温州医科大学，浙江省温州市 325000

修回日期:2017-01-13 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 谭雪莹，博士，主管技师，青岛大学附属青岛市市立医院，山东省青岛市 266000
作者简介:史光军，男，1966年生，山东省潍坊市人，汉族，2005年华中科技大学同济医学院毕业，博士，主任医师，硕士生导师，主要从事肝胆胰腺外科专业及相关研究。
基金资助:
山东省医药卫生科技发展计划(2015WS0324)

Human adipose-derived mesenchymal stem cells promote liver cell regeneration by up-regulating the expression of proliferating cell nuclear antigen

Shi Guang-jun¹, Zhang Ya-dong², Hu Yin-yin³, Tan Xue-ying¹

¹Qingdao Municipal Hospital, Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China; ²Medical School of Qingdao University, Qingdao 266071, Shandong Province, China; ³Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, Zhejiang Province, China

Revised:2017-01-13 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Tan Xue-ying, M.D., Technician in charge, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China
About author:Shi Guang-jun, M.D., Chief physician, Master’s supervisor, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China
Supported by:
the Medicine & Health Science and Technology Development Plan of Shandong Province, No. 2015WS0324

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脂肪间充质干细胞：是一类具有多向分化潜能、免疫调控功能和自主更新能力的干细胞，其取材方便、来源广泛、免疫原性较低，而且增殖速度快、血清选择性较低，近来有研究发现脂肪间充质干细胞移植可明显改善肝衰竭大鼠的肝功能，降低病死率，说明其在肝组织再生领域中具有巨大潜能。
增殖细胞核抗原：是一种分子质量为36 ku的酸性胞核蛋白，其作为DNA聚合酶的推动因子，能与多种蛋白结合，参与细胞凋亡、增殖周期调控、DNA修复等过程，是DNA复制复合体的重要成分，研究发现在变性或衰老细胞中增殖细胞核抗原表达明显降低。因此，增殖细胞核抗原表达可作为反映细胞增殖情况的良好指标。

摘要
背景：脂肪间充质干细胞能够改善肝衰竭大鼠肝功能，在组织工程和细胞移植领域具有重要研究价值。
目的：通过观察人脂肪间充质干细胞治疗肝衰竭大鼠的疗效，探讨其可能的相关生物学机制。
方法：将肝衰竭模型大鼠随机分为模型组、脂肪间充质干细胞组，分别通过尾静脉注射生理盐水或DAPI标记的人脂肪间充质干细胞(3.0×10⁶个)。细胞移植后1，3，7 d，生化法检测各组大鼠血清肝功能，细胞移植后3 d，ELISA法检测血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素10水平，苏木精-伊红染色观察肝组织病理学变化，Western blot检测大鼠肝组织内增殖细胞核抗原表达。
结果与结论：①人脂肪间充质干细胞经尾静脉途径移植后可迁移至大鼠肝、肺组织；②细胞移植后1，3 d，脂肪间充质干细胞组大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平较模型组显著降低(P < 0.05)；③细胞移植后3 d，脂肪间充质干细胞组大鼠血清白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平较模型组显著降低(P < 0.05)；④脂肪间充质干细胞组大鼠肝组织变性、坏死减轻；⑤脂肪间充质干细胞组增殖细胞核抗原蛋白表达较模型组显著上调；⑥结果表明，人脂肪间充质干细胞可明显抑制炎性反应，上调增殖细胞核抗原蛋白表达，促进肝细胞再生及肝功能恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0002-6926-2354(史光军)

关键词: 干细胞, 移植, 人脂肪间充质干细胞, 肝衰竭, 炎性反应, 肝再生, 增殖细胞核抗原

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) can improve the liver function of rats with liver failure, which illustrates the important research value in the field of tissue engineering and cell transplantation.
OBJECTIVE: To evaluate the therapeutic potential of human ADMSCs in heart failure rats and to discuss the possible biological mechanisms involved.
METHODS: Heart failure rats were randomized into model and ADMSCs groups, which were given normal saline or DAPI-labeled human ADMSCs (3.0×10⁶) via the tail vein. At 1, 3, 7 days after transplantation, we detected the biochemical indexes for liver function in rats. At 3 days after transplantation, the serum levels of cytokines, such as tumor necrosis factor α and interleukin-10, were detected, the histomorphological changes in the liver were observed by hematoxylin-eosin staining, and the protein expression of proliferating cell nuclear antigen was detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: We found that human ADMSCs could migrate to the liver and lung tissues in rats after the transplantation via the tail vein. At 1 and 3 days after transplantation, the levels of serum alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase were significantly reduced in the ADMSCs group as compared with the model group (P < 0.05); furthermore, the secretion of tumor necrosis factor α and interleukin-10 was significantly suppressed at 3 days after cell transplantation (P < 0.05). The results of hematoxylin-eosin staining indicated a significant improvement in liver degeneration and necrosis. The expression of proliferating cell nuclear antigen protein in the ADMSCs group was significantly up-regulated compared with the model group. To conclude, human ADMSCs can inhibit the inflammatory reaction and up-regulate the expression of proliferating cell nuclear antigen, to promote the regeneration of liver cells and the recovery of liver function.

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Liver Failure, Acute, Proliferating Cell Nuclear Antigen, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

史光军，张亚东，胡音音，谭雪莹. 脂肪间充质干细胞移植上调肝脏增殖细胞核抗原表达促进肝细胞的再生[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2690-2695.

Shi Guang-jun, Zhang Ya-dong, Hu Yin-yin, Tan Xue-ying. Human adipose-derived mesenchymal stem cells promote liver cell regeneration by up-regulating the expression of proliferating cell nuclear antigen[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2690-2695.

图/表（结果） 3

2.1 脂肪间充质干细胞的生长形态及鉴定结果 通过显微镜观察接种细胞呈悬浮生长，呈椭圆形，1 d后可见部分细胞贴壁生长，逐渐形成集落，2 d后细胞呈梭样改变，集落大量形成，2周后细胞达到80%以上融合，胞核增大。细胞传代后较早出现贴壁生长，形态较均一，每3 d传代1次，脂肪间充质干细胞生长形态见图1，流式细胞仪检测结果显示细胞表面低表达CD34、HLA-DR，高表达CD105、CD90，见图2。

2.2 肝功能指标及炎性水平 肝衰竭模型建立后，大鼠肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平较正常对照组显著升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，细胞移植后1，3 d，脂肪间充质干细胞组大鼠肝功能改善明显，相同时间点肝功能情况均好于模型组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3；脂肪间充质干细胞组血清炎症相关因子白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平较模型组显著下降，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.3 各组大鼠肝组织形态学表现及细胞在大鼠体内迁移情况 肝衰竭模型建立后，显微镜下观察到大量肝细胞广泛水肿、水样变性，大量炎性细胞浸润，局部坏死严重，细胞移植后3 d，脂肪间充质干细胞组大鼠肝细胞水肿减轻，肝组织形态学基本恢复正常，较模型组大鼠有明显改善(图5)。细胞移植后12 h，即可见DAPI标记的脂肪间充质干细胞迁徙分布于肝脏组织、肺组织，以肺部为主(图6)。

2.4 PCNA蛋白表达 Western blot结果显示，造模后大鼠肝脏PCNA表达受到明显抑制，细胞移植后3 d，脂肪间充质干细胞组大鼠肝组织PCNA表达显著上调，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年7月至2016年4月在青岛市市立医院肝胆外科细胞移植实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 脂肪组织 青岛市市立医院肝胆外科35-50岁肥胖女性手术中丢弃的脂肪组织，已签署知情同意书，实验已通过青岛市市立医院伦理委员会批准。

1.3.2 实验动物 选取清洁级6周龄健康雄性SD大鼠58只，体质量为180-200 g，来源于青岛即墨市动物中心，实验过程中对动物的处理措施符合动物伦理学委员会标准。

1.3.3 主要试剂和仪器 α-MEM培养基、胎牛血清(Hyclone公司)；胶原蛋白酶Ⅰ(Sigma公司)；流式细胞仪(美国BD公司)；大鼠白细胞介素10、肿瘤坏死因子α ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物公司)；兔抗大鼠增殖细胞核抗原(PCNA)多克隆抗体、小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体(上海拜力生物科技有限公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司371型)；倒置相差显微镜(日本Nikon公司)；荧光显微镜及彩色照相系统(上海豫光仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的分离、培养 取健康人皮下脂肪组织，制作脂肪抽提液，PBS洗涤3-5次，以去除血细胞及杂质，加入0.1% Ⅰ型胶原酶，37 ℃消化1 h，2 500 r/min离心10 min，去除脂肪层，200目筛网过滤，所获得的细胞悬液继续以2 500 r/min离心5 min，吸取细胞沉淀，PBS洗涤2次，经吹打制成单细胞悬液，加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液，接种于25 cm²培养瓶，置于体积分数为5% CO₂、37 ℃饱和湿度培养箱中进行原代培养，2 d后于倒置显微镜下观察细胞生长状态，去除未贴壁的细胞，更换培养基，此后每天于倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况并拍摄照片，根据细胞生长速度控制换液频率。当细胞达到80%以上融合时，进行1︰2传代培养。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的鉴定 取第3代人脂肪间充质干细胞，用0.25%胰酶+0.02% EDTA消化成细胞悬液，收集细胞，用含体积分数为2%胎牛血清的PBS冲洗3次，制备成细胞浓度为1×10⁹ L^-¹的细胞悬液，EP管分装，加入由FITC标记的小鼠抗人CD105、CD90、HLA-DR、CD34单抗，暗室孵化约15 min，流式细胞仪检测表面分子标记。

1.4.3 建立肝衰竭模型 健康雄性SD大鼠58只，随机选取18只为正常对照组，其余40只大鼠按照2.0 g/kg的剂量标准，一次性腹腔注射D-氨基半乳糖以建立肝衰竭模型，随机分为模型组18只和脂肪间充质干细胞组22只(其中4只用于观察DAPI标记脂肪间充质干细胞移植后12 h体内分布情况)，单笼饲养，防止相互撕咬，给予自由饮食并注意保暖。造模成功的标准：大鼠精神萎靡，反应迟缓，血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量升高。

1.4.4 DAPI标记脂肪间充质干细胞 选取第3代人脂肪间充质干细胞，PBS洗涤2次，用质量浓度为5 g/L的DAPI染液30 μL染核，最终标记质量浓度为100 mg/L，置于37 ℃孵育30 min，荧光显微镜观察染色情况，PBS冲洗数次以去除残余DAPI染液，造模后24 h，将染色成功的脂肪间充质干细胞经尾静脉途径移植入肝衰竭大鼠体内，荧光显微镜观察其迁移分布情况。

1.4.5 脂肪间充质干细胞移植 肝衰竭模型建立后24 h，采用七氟烷吸入麻醉，将大鼠固定于无菌操作台，常规消毒尾静脉周围组织，热水湿敷以充分扩张血管，脂肪间充质干细胞组经尾静脉注入人脂肪间充质干细胞(数量约3×10⁶个)，模型组以同样方法注入等量生理盐水。

1.4.6 肝功能指标及炎症相关因子测定 细胞移植后1，3，7 d，每个时间点各组分别处死6只大鼠，取下腔静脉血液，生化法检测血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平；细胞移植后3 d，ELISA法检测血清炎症相关因子白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平。

1.4.7 苏木精-伊红染色及快速冰冻切片观察 细胞移植后3 d，取各组大鼠肝右叶固定区域肝组织，行苏木精-伊红染色观察病理形态学变化。细胞移植后12 h，取4只脂肪间充质干细胞组大鼠，收集大鼠肝、肺组织行快速冰冻切片，荧光显微镜下观察脂肪间充质干细胞分布情况。

1.4.8 Western blot检测肝组织PCNA表达 细胞移植后3 d，选取大鼠固定区域肝组织，提取总蛋白，分别将上样后的总蛋白加入上样槽内，同时加入适量Mark蛋白以作参照。80 V电泳30 min，继续120 V电泳1 h，切割所需胶带，切取1 cm×7 cm大小的PVDF膜，按照“夹心饼”结构与胶带一起放入转膜盒中，冰浴环境下200 mA转膜2.5 h，BSA封闭2.5 h，TBST充分洗脱3次，加入PCNA兔抗人单克隆抗体(1︰500)孵育，4 ℃过夜，TBST充分洗脱，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG作为二抗孵育1 h，TBST洗脱后进行化学显影，选取GAPDH作为内参对照蛋白。

1.5 主要观察指标 ①人脂肪间充质干细胞的生长形态；②流式细胞仪检测脂肪间充质干细胞表面分子标记(CD34、HLA-DR，CD105、CD90)；③血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α水平；④苏木精-伊红染色观察肝组织形态学变化；⑤Western blot检测肝脏PCNA表达；⑥DAPI示踪观察脂肪间充质干细胞体内迁移情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件分析，各项数据以x(_)±s表示，组间比较运用方差分析和t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

脂肪间充质干细胞最早是由Zuk等^[6]从抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中分离、培养得到，是一类具有多向分化潜能的干细胞。Banas等^[7-8]研究发现，将脂肪间充质干细胞移植到急性肝损伤大鼠体内，其血氨、谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平逐渐降低并趋于正常，表明脂肪间充质干细胞对受损肝脏产生了明显修复作用。实验采用D-氨基半乳糖腹腔注射法构建肝衰竭大鼠模型，经尾静脉途径移植脂肪间充质干细胞，通过对肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶的动态观察，发现脂肪间充质干细胞组大鼠肝功能明显好于模型组，随后进行肝组织苏木精-伊红染色观察形态学变化，结果进一步证实了脂肪间充质干细胞移植能够显著改善肝衰竭大鼠肝功能，抑制肝细胞变性、坏死。

Ranganathet等提出间充质干细胞转录组、分泌组和蛋白质组的概念，强调了其分泌相关蛋白及细胞因子从而发挥组织再生作用的重要意义^[9]。肝损伤导致的局部内环境变化有利于干细胞的定向迁移^[10]，趋化因子SDF-1与其受体CXCR4组成的SDF-1/CXCR4信号通路参与细胞内信号转导，进而影响细胞的趋化、运动等功能^[11]。有学者将DIR标记的胚胎干细胞通过脾脏移植途径注入急性肝衰竭模型小鼠体内，移植后1 d，通过红外成像技术发现干细胞在肝组织内大量聚集^[12]，随后在14 d左右的时间内逐渐消失。作者实验结果显示，采用腹腔注射D-氨基半乳糖可成功构建急性肝衰竭大鼠模型，该方法可操作性强，可以较好地模拟肝脏损伤，脂肪间充质干细胞在移植后12 h即可归巢至受损肝脏，说明脂肪间充质干细胞通过外周血移植途径能够顺利到达肝组织并发挥生物学效应。

急性肝衰竭的本质过程是大量肝细胞的变性、坏死，继而引发系统性炎症反应导致多脏器衰竭^[13]，实验通过炎症相关因子检测与组织形态学观察，旨在验证脂肪间充质干细胞对肝衰竭大鼠炎性反应的免疫调控功能。研究发现，间充质干细胞可明显下调肝衰竭大鼠体内的炎性反应，对损伤肝脏产生保护作用^[14-18]。肿瘤坏死因子α在肝损伤所致的氧化应激过程中具有重要作用，可以作为反映机体炎性水平的灵敏指标之一^[19]，白细胞介素10是一种多功能负性调节因子，适量增多能够下调炎症反应，拮抗如肿瘤坏死因子α等炎性递质的作用，在全身炎症反应代偿期中发挥组织保护作用，然而又有研究报道高剂量白细胞介素10对机体细胞、体液免疫功能具有明显刺激作用^[20]，提示机体病理状态的差异以及白细胞介素10浓度的高低对其生物学作用可能具有不同的影响。实验结果显示，肝损伤大鼠体内炎性水平较正常组明显增高，移植后3 d，脂肪间充质干细胞组大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素10水平显著低于模型组，脂肪间充质干细胞组大鼠肝组织苏木精-伊红染色结果显示细胞变性、坏死明显减轻，炎性浸润程度降低，说明脂肪间充质干细胞移植能够明显下调肝衰竭大鼠的免疫应答反应，减轻肝组织炎性损伤，促进肝功能恢复，同时也提示白细胞介素10适当升高对机体有利，浓度过高可能会加重组织的炎性损伤。

研究发现细胞衰老、变性、坏死与基因表达密切相关^[21]，细胞增殖调控基因如细胞周期素CyclinD、增殖细胞核抗原PCNA、P21、P16等，在真核细胞有丝分裂、细胞再生、增殖周期调控等方面具有重要作用^[22]。P21为抑癌基因表达产物，能够通过竞争性结合PCNA，抑制其与DNA聚合-δ的结合，阻断DNA复制过程；P16通过抑制HEK293细胞活化增殖，抑制细胞周期转变，促进细胞变性坏死^[23]。PCNA是一种分子质量为36 ku的酸性胞核蛋白，其作为DNA聚合酶的推动因子，能与多种蛋白结合，参与细胞凋亡、增殖周期调控、DNA修复等过程，是DNA复制复合体的重要成分，研究发现在变性、衰老细胞中PCNA表达明显降低^[24]。因此，PCNA的含量可以作为反映细胞增殖情况的良好指标。基因水平研究发现肝细胞再生在脂肪间充质干细胞治疗肝衰竭过程中发挥着重要作用^[25]，在大鼠肝缺血再灌注损伤模型及药物诱导的肝衰竭模型中，研究人员同样证实了脂肪间充质干细胞对于肝细胞有丝分裂和肝组织再生的有益作用^[26-28]。

实验重点检测脂肪间充质干细胞移植对于肝细胞PCNA表达的影响。肝衰竭时由于大量肝细胞变性、坏死，模型组大鼠肝组织PCNA表达较正常组明显下调，细胞移植后3 d，Western blot结果显示，脂肪间充质干细胞组PCNA蛋白表达较模型组显著上调，说明除免疫调节作用外，脂肪间充质干细胞还可以通过基因水平上调PCNA表达，促进肝细胞再生，这为进一步研究脂肪间充质干细胞分子机制奠定了重要基础。

实验尚有诸多不足之处，如模型组、脂肪间充质干细胞组大鼠DAPI示踪观察干细胞体内迁移情况的时间过短，证明脂肪间充质干细胞迁徙能力的证据相对缺乏；在血清炎症相关因子检测的时间点选取方面有待完善和补充；此外，脂肪间充质干细胞组上调PCNA表达、促进肝细胞再生的信号转导通路并未具体阐明，这些问题尚待进一步探索和论证。总体来说，脂肪间充质干细胞移植治疗肝衰竭具有广阔的发展前景和重要的临床意义，其归巢至受损肝组织后，能够下调机体炎性反应，减轻肝损伤，通过复杂信号通路作用于细胞增殖调控基因，上调PCNA表达，促进肝细胞再生。

脂肪间充质干细胞移植上调肝脏增殖细胞核抗原表达促进肝细胞的再生

Human adipose-derived mesenchymal stem cells promote liver cell regeneration by up-regulating the expression of proliferating cell nuclear antigen

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