超声介导一氧化氮微泡辅助骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.009

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2678-2683.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.009

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超声介导一氧化氮微泡辅助骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

陈飞¹，许澎¹，乔祺¹，樊冰²，童嘉毅³，范国峰⁴

¹复旦大学附属上海市第五人民医院心内科，上海市 200240；²复旦大学附属中山医院心内科，上海市 200032；³东南大学附属中大医院心内科，江苏省南京市 210007；⁴南京大学医学院附属鼓楼医院急诊中心，江苏省南京市 210008

修回日期:2017-03-08 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 范国峰，硕士，主治医师，南京大学医学院附属鼓楼医院急诊中心，江苏省南京市 210008
作者简介:陈飞，男，1980年生，江苏省如东县人，汉族，2015年复旦大学上海医学院毕业，硕士，医师，主要从事冠心病的诊疗与研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81070265/H0222)：江苏省卫生厅青年科研课题(Q201306)；南京市医学科技发展基金(YKK16100)；上海市闵行区自然科学基金(2014MHZ037)

Ultrasound mediated nitric oxide microbubbles enhance the therapeutic efficacy of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on myocardial infarctions

Chen Fei¹, Xu Peng¹, Qiao Qi¹, Fan Bing², Tong Jia-yi³, Fan Guo-feng⁴

¹Department of Cardiology, Fifth People’s Hospital of Fudan University, Shanghai 200240, China; ²Department of Cardiology, Zhongshan Hospital of Fudan University, Shanghai 200032, China; ³Department of Cardiology, Zhongda Hospital of Southeast University, Nanjing 210007, Jiangsu Province, China; ⁴Emergency Center, Nanjing Drum Tower Hospital, the Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China

Revised:2017-03-08 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Fan Guo-feng, Master, Attending physician, Emergency Center, Nanjing Drum Tower Hospital, the Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
About author:Chen Fei, Master, Physician, Department of Cardiology, Fifth People’s Hospital of Fudan University, Shanghai 200240, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81070265/H0222; the Youth Scientific Research Project of Jiangsu Provincial Health Department, No. Q201306; the Medial Science Development Fund of Nanjing Gity, No. YKK161000; the Natural Science Foundation of Minhang District of Shanghai, No. 2014MHZ037

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
一氧化氮微泡：一氧化氮是体内重要的第二信使，在心血管系统具有调节血压、扩张血管、抑制血小板聚集和白细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞增殖等作用。但一氧化氮半衰期短、极易被氧化，影响其临床应用。通过生物工程技术构建核心为一氧化氮的功能微泡，超声作用下单个微泡在体内可释放1.7 fmol一氧化氮，扩张血管、增加血流的效应可持续2.0-3.0 h。
干细胞移植治疗心肌梗死效果差可能与下列因素有关：合并心血管危险因素的冠心病患者的干细胞数量、迁移、黏附、增殖和分化能力下降；移植干细胞心肌内归巢数量少，移植细胞心肌内存活并分化的数量更少。

摘要
背景：多项实验研究发现，超声联合微泡干预能够增强干细胞移植治疗心肌梗死后心力衰竭的效果，具有良好的应用前景。但超声介导一氧化氮微泡经冠脉移植骨髓间充质干细胞治疗大型动物心肌梗死是否具有同样的效果仍不明确。
目的：探讨超声介导一氧化氮微泡与冠脉移植骨髓间充质干细胞治疗家猪心肌梗死的有效性及可能机制。

方法：①密度梯度离心法分离、培养、鉴定家猪骨髓间充质干细胞，CM-Dil体外标记骨髓间充质干细胞；②经介入法球囊封堵猪左冠状动脉前降支成功建立24只家猪心肌梗死模型，随机分为PBS组、骨髓间充质干细胞组、超声介导声诺维微泡组、超声介导一氧化氮微泡组(n=6)。于造模后1周进行如下干预：PBS组经冠脉注射10 mL PBS，骨髓间充质干细胞组将骨髓间充质干细胞(约1×10⁷)用10 mL PBS稀释后经冠脉缓慢注射；超声介导声诺维微泡组经冠脉注入声诺维微泡0.1 mL/kg，同时超声干预(1 MHz、2 W/cm²)2 min，然后将骨髓间充质干细胞(约1×10⁷)用10 mL PBS稀释后经冠脉缓慢注射；超声介导一氧化氮微泡组移植方法及条件同超声介导声诺维微泡组，仅将声诺维微泡换作一氧化氮微泡；③干预后48 h随机处死每组各3只家猪，取梗死区心肌组织作冰冻切片，计数比较各组缺血心肌内荧光标记阳性骨髓间充质干细胞。4周后对每组剩余家猪行M型心脏超声观察比较各组左心室收缩功能。心功能检测结束后处死所有家猪，取梗死区心肌组织行石蜡切片及苏木精-伊红染色，计数比较各组心肌缺血区的毛细血管密度。

结果与结论：①与超声介导声诺维微泡组及骨髓间充质干细胞组比较，超声介导一氧化氮微泡组CM-Dil阳性骨髓间充质干细胞数增多，差异有显著性意义(P < 0.05)；②与超声介导声诺维微泡组、骨髓间充质干细胞组及PBS组比较，超声介导一氧化氮微泡组左室射血分数值有显著改善，差异有显著性意义(P < 0.05)；③与超声介导声诺维微泡组、骨髓间充质干细胞组及PBS组比较，超声介导一氧化氮微泡组平均毛细血管密度显著增多，差异有显著性意义(P < 0.05)；④结果表明，超声介导一氧化氮微泡与冠脉移植骨髓间充质干细胞联合治疗可以改善家猪急性心肌梗死后的左心收缩功能，可能与超声介导一氧化氮微泡促进骨髓间充质干细胞向心肌缺血区归巢以及局部血管生成有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID:0000-0002-2635-6019(范国峰)

关键词: 干细胞, 移植, 骨髓间充质干细胞, 心肌梗死, 超声, 一氧化氮微泡, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Recent experimental studies have found ultrasound mediated microbubbles potentiate stem cell therapy in myocardial infarction (MI)-induced heart failure, indicating a good application prospect. But whether ultrasound mediated nitric oxide (NO) microbubbles also have the same effect in the intracoronary transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) for treatment of large animals with MI is still unknown.

OBJECTIVE: To investigate the effectiveness and possible mechanism of ultrasound mediated NO microbubbles in potentiating intracoronally transplanted BMSCs homing to the infarcted area in a MI pig model.

METHODS: Density gradient centrifugation culture method was used in the isolation and cultivation of BMSCs. CM-Dil was used to label BMSCs in vitro. Twenty-four pigs were used to make MI models by blocking the left anterior descending coronary artery, and then were divided into PBS group, BMSCs group, ultrasound+microbubbles+BMSCs (MB) group, ultrasound+NO microbubbles+BMSCs (NO-MB) group(n=6 per group). In the PBS group, 10 mL of PBS was intracoronally injected. In the BMSCs group, about 1×10⁷ BMSCs were diluted in 10 mL of PBS and then intracoronally infused. In the MB group, 0.1 mL/kg sulphur hexafluoride microbubbles (Sono Vue) was intracoronally injected together with ultrasound treatment (1 MHz, 2 W/cm², 2 minutes), followed by intracoronary infusion of about 1×10⁷ BMSCs that were diluted in 10 mL of PBS. In the NO-MB group, all methods and conditions were identical to those in the MB group except only 0.1 mL/kg of Sono Vue was replaced by 0.1 mL/kg NO microbubbles. Three pigs were sacrificed in each group 48 hours after CM-Dil positive BMSCs transplantation. The labeled BMSCs were observed and counted by fluorescent microscope after frozen sectioning of the infarct area. We assessed and compared left ventricular systolic function with M-mode ultrasound among groups at 4 weeks after intervention. After cardiac function test, the rest pigs were sacrificed and capillary density in the myocardial ischemic area was counted and compared after hematoxylin-eosin staining.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The number of CM-Dil positive cells in the area of MI in the NO-MB group was much more than that in the MB group and BMSCs group with statistical significance (P < 0.05). (2) The left ventricle systolic function was significantly improved in the NO-MB group as compared with the MB group (P < 0.05). The same trend was observed between NO-MB group and BMSCs group as well as between NO-MB group and PBS group (P < 0.05). (3) The density of capillaries increased significantly in the NO-MB group compared with the MB group, BMSCs group and PBS group, respectively. To conclude, ultrasound mediated NO microbubble combined with intracoronary BMSCs transplantation can improve the left ventricular systolic function. The possible mechanism could be that ultrasound- mediated NO mocrobubbles promote the homing of transplanted BMSCs to the myocardial ischemia area as well as improve local angiogenesis.

Key words: Myocardial Infarction, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Nitric Oxide, Microbubbles, Sonication, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈飞，许澎，乔祺，樊冰，童嘉毅，范国峰. 超声介导一氧化氮微泡辅助骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2678-2683.

Chen Fei, Xu Peng, Qiao Qi, Fan Bing, Tong Jia-yi, Fan Guo-feng. Ultrasound mediated nitric oxide microbubbles enhance the therapeutic efficacy of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on myocardial infarctions[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2678-2683.

图/表（结果） 1

2.1 猪心肌梗死模型的建立及评价 球囊封堵前降支 10 min后，心电监护显示对应导联有ST段明显抬高，说明存在心肌缺血及梗死。手术18 h后取家猪血清测定肌钙蛋白I、肌酸激酶同工酶水平，肌钙蛋白I平均值为(6.356± 1.211) μg/L、肌酸激酶同工酶平均值为(2 510.215± 308.781) U/L，均明显升高。手术1周后，利用M型超声心动图检测家猪心功能，结果显示心肌梗死模型家猪左心室前壁变薄，运动减弱或运动消失。实验过程中共制作家猪心肌梗死模型28只，术后4只死亡，均为出现恶性心律失常死亡，存活率86%。

2.2 荧光标记骨髓间充质干细胞心肌内归巢情况 荧光显微镜观察各组家猪心脏冰冻切片显示，缺血区心肌内出现均匀的红色荧光颗粒为CM-Dil标记的骨髓间充质干细胞(图1-3)。计数各组缺血区CM-Dil标记阳性细胞数目，超声介导一氧化氮微泡组、超声介导声诺维微泡组及骨髓间充质干细胞组分别为(60.22±15.63)、(46.33±14.87)及(32.89±4.71)个。与超声介导声诺维微泡组及骨髓间充质干细胞组比较，超声介导一氧化氮微泡组归巢的骨髓间充质干细胞数明显增多，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 心肌梗死后心功能 移植4周后M型超声心动图检测各组左室收缩功能，各组左室射血分数值见表1。超声介导一氧化氮微泡组左室射血分数值与超声介导声诺维微泡组、骨髓间充质干细胞组及PBS组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 局部心肌毛细血管密度 100倍视野下观察超声介导一氧化氮微泡组平均毛细血管密度与超声介导声诺维微泡组、骨髓间充质干细胞组及PBS组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2013年2月至2015年3月在南京大学实验动物中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 选择三四个月龄的中国家猪28只，体质量(30±5) kg，由南京大学实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

1.3.2 主要材料、试剂及仪器 声诺维微泡(上海博莱科信谊药业有限公司)；一氧化氮微泡(江苏省生物材料与器件重点实验室)。胎牛血清(美国Hyclone公司)；纤维连接蛋白(美国Chemicon公司)；0.25%胰蛋白酶(美国Sigma公司)；淋巴细胞分离液Ficoll-Paque(天津灏洋生物公司)；CM-Dil(美国Invitrogen 公司)；荧光正置显微镜(日本Nikon公司)；倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂)；超声波治疗仪(BJS2DM-200B)(北京中西远大化玻仪器有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 家猪骨髓间充质干细胞分离培养、鉴定及标记 参考Xu等^[10]的实验方法，体外分离培养家猪骨髓间充质干细胞，经形态学观察及流式细胞仪检测CD34、CD45、CD29、CD44表达进行鉴定^[11]，取培养至第3代生长良好的骨髓间充质干细胞，经0.25%胰酶消化、离心收集细胞。CM-Dil标记：根据Invitrogen公司提供的CM-Dil说明书，用二甲基亚砜将CM-Dil配成质量浓度为2 g/L的母液，使用时将其用PBS稀释成质量浓度为1 mg/L。将培养至第3代的生长良好的骨髓间充质干细胞消化后用培养液稀释成浓度为1×10⁹ L^-¹，每毫升培养液中加入5 μL质量浓度为1 mg/L的CM-Dil染液，吹匀，37 ℃孵育5 min，4 ℃孵育15 min，离心(1 500 r/min，5 min)弃上清，PBS洗涤2次。取少量细胞涂片后荧光显微镜观察，计数5个高倍镜视野下的细胞，以荧光阳性细胞数/总细胞数计算CM-Dil标记阳性细胞比例，并拍照。

1.4.2 家猪急性心肌梗死模型制备 家猪术前禁食禁饮4 h，以氯胺酮(15 mg/kg)肌注诱导麻醉后，术中予以戊巴比妥钠静脉(10 mg/kg)维持麻醉。切开后穿刺股动脉，置入6F动脉鞘管，选用6F/JL4指引导管行左冠状动脉造影后，送入导丝至前降支远端。通过导丝将球囊导管送至左前降支中远端1/3处，以6 atm(607.95 kPa)充盈球囊预适应，持续60 min。采用心电图、心肌酶谱、超声心动图等手段评价建模成功与否。

1.4.3 实验分组与干预 24只成功造模的急性心肌梗死家猪，随机分为4组(n=6)：PBS组、骨髓间充质干细胞组、超声介导声诺维微泡组、超声介导一氧化氮微泡组。于造模后1周进行如下干预：PBS组经冠脉注射10 mL PBS，骨髓间充质干细胞组将骨髓间充质干细胞(约1×10⁷)用10 mL PBS稀释后经冠脉缓慢注射；超声介导声诺维微泡组经冠脉注入声诺维微泡0.1 mL/kg，同时超声干预(1 MHz、2 W/cm²) 2 min，然后将骨髓间充质干细胞(约1×10⁷)用10 mL PBS稀释后经冠脉缓慢注射；超声介导一氧化氮微泡组移植方法及条件同超声介导声诺维微泡组，仅将声诺维微泡换作一氧化氮微泡。

1.4.4 移植骨髓间充质干细胞的归巢情况 骨髓间充质干细胞移植24-48 h后，处死每组3只家猪，取出心脏后沿心脏短轴剖开，制成厚度约8 μm的冰冻切片，然后于荧光显微镜下观察心肌梗死及其周围区的荧光标记阳性细胞，每只动物取3张切片，每张切片计数200倍光镜下3个视野的细胞数目，取其平均值，比较各组CM-Dil阳性的骨髓间充质干细胞归巢数目。

1.4.5 移植后心功能变化 剩余家猪继续饲养，在骨髓间充质干细胞移植4周后，通过M型超声心动图测量左室舒张末期容积与收缩末期容积、室壁厚度等计算左室射血分数作为判断心功能变化的指标。

1.4.6 心肌局部毛细血管密度分析 超声检查结束后，处死各组家猪，取出心脏，沿乳头肌短轴平面剖开，行石蜡包埋、苏木精-伊红染色。先在低倍镜(×50)下观察切片以确定缺血梗死区血管密度最高处，然后在100倍光镜下计数毛细血管数，每只动物取3张切片，每张切片取3个视野，取其平均值作为平均毛细血管密度。

1.5 主要观察指标 ①猪心肌梗死模型的建立及评价；②荧光标记骨髓间充质干细胞心肌内归巢情况；③心肌梗死后心功能；④局部心肌毛细血管密度。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料数据以x(_)±s表示，组间比较行单因素方差分析，组间两两比较采用 Student Newman Keuls(S-N-K)检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

急性心肌梗死是全球范围内严重威胁人类健康的临床常见病。药物治疗和血运重建技术的不断发展，使急性心肌梗死的死亡率明显降低，但对心肌梗死后心力衰竭仍无有效的治疗手段。随着细胞生物工程技术和干细胞研究的发展，将不同组织(如骨髓、外周血、脂肪组织、心肌组织等)来源的不同类型干细胞或祖细胞(如间充质干细胞、内皮祖细胞、心肌干细胞、胚胎干细胞等)，通过不同的途径(如直接开胸，静脉注射，骨髓干细胞动员，经导管干细胞移植包括经冠脉、经心肌内膜打孔等)进行干细胞移植治疗，以期替代、修复或改善受损心肌组织的生物学功能，显示出良好的临床应用前景^[1]。但一系列动物及临床研究提示移植干细胞对心肌梗死后心功能改善效果也不肯定，在-0.2%至7.2%之间^[1]。移植干细胞治疗心肌梗死效果不佳可能和下列因素有关：①合并心血管危险因素(如年龄、吸烟、高血压、高脂血症、糖尿病等)的冠心病患者或健康志愿者，移植干细胞数量减少，迁移、黏附、增殖和分化能力均下降^[12-14]；②干细胞治疗慢性心肌梗死患者心功能改善较急性心肌梗死患者不明显^[15]，与慢性缺血组织化学趋化因子表达显著降低，不能募集有效数量的内皮祖细胞有关^[16]；③心肌内归巢的干细胞数量少，氟脱氧葡萄糖(¹⁸F-FDG)标记的干细胞经冠脉内注射后，正电子发射体层摄影显示，注射后2 h仅2.1%左右的细胞迁移到了心肌组织，而大部分细胞迁至心肌外组织，包括肝脏、脾脏、肺、膀胱、脑等，20 h后定居在心肌组织内的干细胞则更少，只有1.49%左右；④细胞迁移到梗死心肌，并在局部存活是干细胞移植发挥作用首要的、也是最关键的步骤。由于心肌梗死后发生一系列的病理改变，如缺血性损伤、缺血再灌注损伤、神经内分泌激活、炎症、氧化应激等，移植细胞存活并分化的数量少，据报道1周后仅有10%左右存活^[17]。

为此，国内童嘉毅课题组通过一系列动物实验表明，超声介导微泡能够促进猪骨髓单个核干细胞归巢至局部梗死心肌，并且远期心功能得到改善明显^[2-3]。已知一氧化氮是体内重要的第二信使，有着广泛的生理功能，在心血管系统中，一氧化氮具有调节血压、扩张血管、抑制血小板聚集和白细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞增殖等重要作用。但是，由于一氧化氮半衰期短且极易被氧化而极大的影响了临床与实验应用。最近，通过生物工程技术已成功构建核心为一氧化氮的微泡^[18]，超声介导下单个微泡在体内可释放1.7 fmol一氧化氮，远超过长度1 mm、直径50 μm的血管在100 ms间产生的一氧化氮量，其扩张血管、增加血流的效应可持续2.0-3.0 h^[19]。东南大学江苏省生物材料与器件重点实验室在国内首次成功制备一氧化氮微泡，为研究功能微泡提供了可能。已有体外研究发现，超声联合一氧化氮微泡对骨髓间充质干细胞的增殖、凋亡以及细胞周期无显著影响，作用于骨髓间充质干细胞是安全的^[7]；进一步体内实验证实，一氧化氮微泡能够促进静脉移植的骨髓间充质干细胞向大鼠心肌缺血区归巢^[8]，并改善心肌梗死后心功能，效果优于普通微泡。在此实验基础上，作者进一步探讨经冠脉移植途径，一氧化氮微泡介导骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死，能否更有效促进移植骨髓间充质干细胞向缺血心肌归巢以及对改善心肌梗死后心功能的影响。实验结果表明，超声介导一氧化氮微泡可促进经冠脉移植的骨髓间充质干细胞向心肌缺血区归巢，能够改善心肌梗死后心功能，并促进局部毛细血管生成。

实验利用CM-Dil标记骨髓间充质干细胞并经冠脉移植，荧光显微镜观察缺血心肌局部CM-Dil阳性细胞的分布以及数量，结果显示超声介导一氧化氮微泡组较超声介导声诺维微泡组及单纯移植骨髓间充质干细胞组缺血心肌区的CM-Dil阳性细胞数目增多。该结果提示，与单纯冠脉移植骨髓间充质干细胞相比较，超声联合微泡能够促进骨髓间充质干细胞向心肌缺血区的归巢，而超声联合一氧化氮微泡的这种促进作用较普通微泡更加明显。其机制可能如下：超声在声波传播方向产生辐射力，能够促进骨髓间充质干细胞向血管壁移位；当血管内存在微泡时，该辐射力可增加数10倍^[20]，而且微泡周围产生强大的环状涡流和切变力，均有利于干细胞边集数量^[21]。此外一氧化氮微泡在超声作用下迅速释放一氧化氮，使局部血管扩张，血流速度减慢，也有利于骨髓间充质干细胞边集。骨髓间充质干细胞游出指其通过血管内皮细胞层进入组织间隙，正常情况下细胞很难通过内皮层，血管壁的通透性是重要的决定因素。而超声联合微泡作用可为移植干细胞克服内皮屏障创造条件。一方面，超声微泡通过空化效应，直接引起血管内皮细胞之间间隙增宽，内皮细胞渗透性增加。实验表明，直径为503 nm的高分子聚合物在超声微泡作用下通过内皮层，扩散面积可达25 000 μm²，平均直径为89 μm，最远可达200 μm^[22]。另一方面，一氧化氮是体内活性气体分子，有广泛生理病理作用，包括调节血管舒张功能，抗血小板聚集，增加血管通透性，促进血管新生，调节其他促血管生长因子功能。一氧化氮微泡在超声作用下释放一氧化氮，使局部血管扩张，降解内皮层钙黏蛋白复合物，增加血管通透性，促进骨髓间充质干细胞游出^[23]。此外，超声介导微泡能够增强骨髓间充质干细胞自身迁移能力和趋化因子CXCR4基因表达^[8]。

实验应用M型超声进行左心收缩功能评价，结果发现超声介导一氧化氮微泡组的左室射血分数值依次高于超声介导声诺维微泡组、单纯静脉移植骨髓间充质干细胞组及PBS组，差异有显著性意义。结果说明超声介导一氧化氮微泡干预骨髓间充质干细胞移植能显著改善心肌梗死后心功能，且这种改善作用较普通微泡更加明显。考虑可能与以下两方面有关：①超声联合一氧化氮微泡干预后骨髓间充质干细胞归巢增加。目前认为骨髓间充质干细胞改善心功能的可能机制是其与宿主细胞之间建立了电-机械藕合直接参与心肌收缩；抑制心脏重构；通过旁分泌等作用对心脏功能进行调节，抑制心肌细胞凋亡、心肌纤维化；促进血管生成，改善心肌血流灌注等^[24-26]。实验发现超声联合一氧化氮微泡作用能有效促进骨髓间充质干细胞归巢至心肌缺血区，推测其改善心功能的机制可能与移植干细胞归巢数量增加有关；②超声联合一氧化氮微泡干预后局部毛细血管生成增加：超声介导的微泡破坏增效骨髓间充质干细胞移植改善心肌梗死后心功能已有相关文献报道^[6]，可能是通过促进血管再生、分泌细胞因子及抑制心室重构等来改善心功能，其中认为血管新生是主要的机制之一，实验观察局部毛细血管密度也支持该机制。

实验存在一定局限性：如经超声微泡作用后体内骨髓间充质干细胞的活性，骨髓间充质干细胞移植后是否分化为有收缩功能的心肌细胞、促进血管新生改善心肌血供及骨髓间充质干细胞移植后机体的安全性等没有进一步观察；另外实验观察例数较少，其效果还应进一步扩大样本量。可以预见，通过加强分子生物学、物理化学等新技术在超声及对比剂微泡中的应用，不断深入对超声介导微泡的机械作用和生物学效应的研究，优化超声参数，明确最佳微泡和移植细胞数量，超声微泡辅助干细胞移植一定能够成为一种新的治疗缺血性心血管疾病的有效方法。

超声介导一氧化氮微泡辅助骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死

Ultrasound mediated nitric oxide microbubbles enhance the therapeutic efficacy of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation on myocardial infarctions

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