人脐带间充质干细胞应用于肝移植患者的观察

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.007

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2665-2671.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.007

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人脐带间充质干细胞应用于肝移植患者的观察

陈榕¹，江涛²，杨爱珍³，张冬华²，王轩¹

¹安徽医科大学解放军八一临床学院全军肿瘤中心肿瘤外科，江苏省南京市 210000；南京中医药大学附属八一医院，²全军肿瘤中心肿瘤外科，³中心实验科，江苏省南京市 210000

修回日期:2017-05-03 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 王轩，博士，教授，主任医师，安徽医科大学解放军八一临床学院全军肿瘤中心肿瘤外科，江苏省南京市 210000
作者简介:陈榕，男，1990年生，福建省福州市人，汉族，在读硕士，主要从事肝脏移植的临床和基础研究。
基金资助:
南京军区医学科技创新重点资助项目(14ZX07)

Clinical application of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in liver transplantation patients

Chen Rong¹, Jiang Tao², Yang Ai-zhen³, Zhang Dong-hua², Wang Xuan¹

¹Department of Oncological Surgery, Military Oncology Center, PLA 81st Clinical College, Anhui Medical University, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China; ²Department of Oncological Surgery, Military Oncology Center, PLA 81st Hospital, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China; ³Clinical Laboratory, PLA 81st Hospital, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China

Revised:2017-05-03 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Wang Xuan, M.D., Professor, Chief physician, Department of Oncological Surgery, Military Oncology Center, PLA 81st Clinical College, Anhui Medical University, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China
About author:Chen Rong, Studying for master’s degree, Department of Oncological Surgery, Military Oncology Center, PLA 81st Clinical College, Anhui Medical University, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Key Medical Innovation Project of Nanjing Military Region of Chinese PLA, No. 14ZX07

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
移植物免疫耐受：临床意义的移植物免疫耐受多指所移植的细胞、组织或者器官能在不使用免疫抑制剂的情况下，长期的存活和维持稳定的移植物功能。真正的耐受目前仅仅是一种理想状态，仅能达到操作耐受或者接近耐受。
调节性T细胞(Treg)：机体发挥免疫调节功能的关键性调节细胞，具有免疫抑制特性，在体内的主要作用是调节机体免疫平衡，防止免疫反应无限制扩大及抑制自身免疫反应的发生。

摘要

背景：近年来间充质干细胞的免疫调节作用可被应用于诱导机体免疫耐受研究。

目的：评估脐带间充质干细胞应用于肝移植患者的安全性和可行性。

方法：培养人脐带间充质干细胞并进行鉴定。经医学伦理委员会同意后，将总计50例患者经1∶1的比例按入组时间随机分入试验组和对照组，每组25例。试验组分别在术中门静脉灌注及术后第3天给予颈内静脉输注脐带间充质干细胞，剂量为1×10⁶/kg(制备成50 mL的细胞悬液)。两组患者均采用标准免疫抑制方案。术前，术后第3，7天，术后第1，2，3，6，12个月检测血生化、免疫功能指标，统计急、慢性排斥反应发生率，感染发生率，移植相关并发症发生率。
结果与结论：①与对照组相比，术后第3，7天试验组外周血的CD4⁺CD25⁺(调节性T细胞)细胞比例高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，CD4⁺(辅助性/诱导性T细胞)细胞比例及CD4⁺/CD8⁺ T淋巴细胞的比值低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②与对照组相比，试验组谷丙转氨酶、总胆红素水平差异无显著性意义(P > 0.05)；③试验组术后肝功能异常事件的发生率明显低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；④两组移植后相关并发症的发生率、感染发生率差异无显著性意义(P > 0.05)；⑤以上结果提示，肝移植术后静脉输注脐带间充质干细胞安全可行，早期可促进CD4⁺CD25⁺(调节性T细胞)的增殖和活化，降低CD4⁺(辅助性/诱导性T细胞)比例及CD4⁺/CD8⁺ T淋巴细胞的比值，进而改善肝移植受者免疫状态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0428-5704(陈榕)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 肝移植, CD4⁺CD25⁺调节性T细胞, 免疫功能, 免疫耐受

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, the immunoregulatory effects of mesenchymal stem cells (MSCs) can be used to induce immune tolerance.

OBJECTIVE: To evaluate the safety and feasibility of human umbilical cord-derived MSCs (hUC-MSCs) in liver transplantation patients.

METHODS: hUC-MSCs were cultured and identified. After approved by the Medical Ethics Committee, a total of 50 patients were randomly divided into experimental group and control group according to the proportion of 1:1. In the experimental group, hUC-MSCs were perfused by the portal vein during the operation and infused into the jugular vein on the 3^rd day after the operation. The injection dose was 1×10⁶/kg (prepared as 50 mL of cell suspension). Both groups received standard immunosuppressive regimens. Blood biochemistry and immune function indicators were detected preoperatively and at postoperative days 3, 7, months 1, 2, 3, 6, 12. Acute and chronic rejection rates, incidence of infection, and incidence of transplantation-related complications were recorded.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) At 3 and 7 days after the operation, the percentage of peripheral blood CD4⁺CD25⁺ cells (regulatory T cells) in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). The percentage of CD4⁺ cells (helper/inducer T cells) and ratio of CD4⁺/CD8⁺ T lymphocytes were significantly lower in the experimental group than the control group (P < 0.05). (2) There was no significant difference in postoperative alanine aminotransferase and total bilirubin levels between the two groups (P > 0.05). (3) The incidence of abnormal liver function in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05). (4) The incidence of transplantation-related complications and the rate of infection showed no significant difference between the two groups (P > 0.05). Overall, the intravenous infusion of hUC-MSCs is safe and feasible in liver transplantation patients, which in early stage can promote the the proliferation and activation of CD4⁺CD25⁺ cells (regulatory T cells), reduce the percentage of CD4⁺ cells (helper/inducer T cells) and lower the ratio of CD4⁺/CD8⁺ T cells, thereby improving the immune status in liver transplantation patients.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Liver Transplantation, Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Immune Tolerance, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈榕，江涛，杨爱珍，张冬华，王轩. 人脐带间充质干细胞应用于肝移植患者的观察[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2665-2671.

Chen Rong, Jiang Tao, Yang Ai-zhen, Zhang Dong-hua, Wang Xuan. Clinical application of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in liver transplantation patients[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2665-2671.

图/表（结果） 4

2.1 人脐带间充质干细胞培养及鉴定结果 试验组患者每次输注脐带间充质干细胞制剂时都予以留样，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原，显示CD105、CD90、CD73呈阳性表达，CD34、CD45、HLA-DR呈阴性表达，证实为脐带间充质干细胞，细胞纯度较好，见图1。

2.2 参与者数量分析 参加试验患者术后定期随访，均进入结果分析。

2.3 两组患者基本资料的比较 两组患者各项基本资料比较差异无显著性意义(P > 0.05，表1)。

2.4 免疫功能指标的改变 通过单色或多色免疫荧光染色流式细胞术分析外周血中淋巴细胞各亚群的含量，分别检测CD19⁺细胞(B淋巴细胞)、CD3⁺细胞(总T淋巴细胞)、CD56⁺细胞(NK细胞)、CD4⁺CD25⁺细胞(调节性T细胞)、CD8⁺细胞(细胞毒/抑制性T细胞)、CD4⁺细胞(辅助性/诱导性T细胞)在外周血中的比例以及外周血中CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞的比值。

通过比较得知，对照组和试验组外周血中CD3⁺细胞(总T淋巴细胞)(图2，P > 0.05)、CD8⁺细胞(细胞毒/抑制性T细胞)(图3，P > 0.05)、CD19⁺细胞(B淋巴细胞)(图4，P > 0.05)、CD56⁺细胞(NK细胞)(图5，P > 0.05)的比例差异均无显著性意义。

术后第3天，第7天试验组外周血的CD4⁺CD25⁺细胞(调节性T细胞)比例分别为(0.97±0.36)%、(0.61±0.13)%；对照组分别为(0.06±0.03)%、(0.02±0.02)%，试验组高于对照组(P均< 0.05，图6)，差异有显著性意义。

术后第3天，第7天试验组CD4⁺(辅助性/诱导性T细胞)细胞的比例分别为(33.29±3.86)%、(36.26±4.07)%，明显低于对照组(40.12±3.97)%、(41.61±3.11)%，差异有显著性意义(P均< 0.05，图7)。试验组术后第3天、第7天CD4⁺/CD8⁺T淋巴细胞的比值分别为(2.28±0.34)%、(2.01±0.32)%，明显低于对照组(3.01±0.63)%、(2.59±0.50)%，差异有显著性意义(P均< 0.05，图8)。

其他随访时间点两组患者CD4⁺CD25⁺(调节性T细胞)、CD4⁺(辅助性/诱导性T细胞)细胞的比例及CD4⁺/CD8⁺T 淋巴细胞的比值差异均无显著性意义(P > 0.05)。

2.5 移植肝功能的比较 试验组与对照组在术后随访中，肝功能指标总胆红素(图9)、直接胆红素(图10)、谷丙转氨酶(图11)、谷草转氨酶(图12)变化趋势基本相同，差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 肝功能异常事件发生率的比较 在临床上，当移植术后患者疑似出现急、慢性排斥反应时，都积极予以预防性激素冲击治疗，且未行病理穿刺活检，故无明确临床证据以证实患者是否发生排斥反应，该研究以肝功能不良事件的发生率来作为对急、慢性排斥反应发生率的补充，术后12个月随访期内试验组患者肝功能异常事件(当患者某次测定的肝功能指标较其前一次测量值增高3倍以上者考虑为一次肝功能异常事件)的发生率为4%(1/25)，明显低于对照组的24%(6/25)，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.7 相关并发症发生率的比较 术后12个月随访期内试验组相关并发症的发生率为12%(3/25)，对照组为20% (5/25)，差异无显著性意义(P > 0.05)。试验组与对照组均未发生肝动脉血栓；试验组有1例发生门静脉血栓，对照组有2例；试验组有2例发生肺部感染，对照组1例发生肺部感染；试验组有2例发生胆道并发症，对照组有3例；随访12个月内，两组患者均无恶性肿瘤发生。

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引言

材料方法

1.1 设计 临床随机对照试验。

1.2 时间及地点 于2014年7月至2017年3月在解放军八一医院肝脏移植中心完成。

1.3 对象 选择2014年7月至2016年3月在解放军八一医院肝脏移植中心实施同种异体肝移植患者，经解放军八一医院伦理委员会批准，患者个体及其家属自愿参加并在充分了解治疗方案的前提下签署“知情同意书”，总计50例患者经1︰1的比例按入组时间随机分入试验组和对照组，由于进行间充质干细胞研究，从伦理上讲，不宜进行双盲。各组年龄、性别相当。纳入标准：首次肝移植患者，性别不限。排除标准：①患者有严重的肺动脉高压或肝-肺系统的缺血，移植前肺动脉压> 35 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)；②严重的心肺功能不全；③既往有肝外恶性病变以及全身性败血症；④既往接受过器官移植(包括肝移植)；⑤有恶性肿瘤病史；⑥有传播性海绵状脑病病症和体征或家族成员患有该病；⑦需要同时接受方案不允许的药物治疗；⑧有明确药物过敏史或属过敏体质者，已知的药物或酒精滥用史；⑨意识障碍者及其他无法律行为能力或法律行为能力受限；⑩研究者认为患者不宜参加此研究的其他情况。整个研究严格按照制定的临床试验规范进行。

1.4 方法

1.4.1 间充质干细胞组织来源 脐带取自足月剖宫产健康产妇，并且产妇HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体、抗巨细胞病毒抗体等检测均阴性。产妇签署“留取脐带知情同意书”，常规结扎处理好脐带，轻轻挤净血管内的血液，然后用生理盐水把脐带冲洗干净，最后把脐带放入盛有特制保存液的容器中密封。在容器外贴上标签，注明产妇姓名、留取单位、住院号、新生儿出生时间、性别、体质量。另采集产妇静脉血5 mL。

1.4.2 脐带间充质干细胞临床制剂的制备 脐带间充质干细胞作为一种需在体外进行分离、纯化、扩增、诱导分化、冻存和冻存后的复苏等操作的异体细胞制品，由解放军八一医院中心实验科依据《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》、《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，以及《细胞移植治疗技术规范》（征求意见稿）等相关法律法规要求，按标准间充质干细胞分离、纯化和培养增殖的方法进行培养^[19]，严格控制培养过程中的每个细节，得到符合临床要求的干细胞制剂，从而确保细胞治疗的安全性和有效性。

1.4.3 脐带间充质干细胞的输注 试验组分别在术中门静脉灌注及术后第3天给予颈内静脉输注脐带间充质干细胞，剂量为1×10⁶/kg(制备成50 mL的细胞悬液)。两组患者均采用标准免疫抑制方案。

1.5 主要观察指标 每位患者都将接受12个月以上的随访。评估时间点：术前，术后第3，7天，术后第1，2，3，6，12个月。评估项目：血生化，免疫功能指标，急、慢性排斥反应发生率，感染发生率，移植相关并发症发生率(肝动脉并发症、门静脉并发症、胆道并发症)。一旦出现急、慢性排斥反应，患者无需等待访视时间节点，立即到医院就诊，并退出此次研究。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件完成。计量资料以x(_)±s表示，两组连续变量的比较应用Wilcoxon秩和检验，计数资料用χ²检验或Fisher精确检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

临床意义的移植物免疫耐受多指所移植的细胞、组织或者器官能在不使用免疫抑制剂的情况下，长期的存活和维持稳定的移植物功能。真正的耐受目前仅仅是一种理想状态，仅能达到操作耐受或者接近耐受^[20-21]。国内外研究文献已经通过动物实验证明，脐带间充质干细胞兼有免疫调节能力及诱导免疫耐受的特性。人脐带间充质干细胞的免疫调节功能可不依赖于与免疫细胞的直接或间接接触，并且与诱导免疫细胞凋亡无关，其可促进Treg细胞的增殖和活化进而发挥其免疫调节功能^[22]。Treg是机体发挥免疫调节功能的关键性调节细胞，在体内的主要作用是调节机体免疫平衡，上调Treg水平进行负性免疫调节，能抑制B淋巴细胞的增殖活化，同时抑制B细胞分泌IgG、IgA和IgM等细胞因子，进而控制炎症反应程度^[23]，防止免疫反应无限制扩大及抑制自身免疫反应的发生。CD4⁺/CD8⁺ T淋巴细胞的比值是判断机体免疫状态的敏感指标，它的下降提示机体免疫功能低下或处于免疫抑制状态。由于Treg细胞能够调节CD4⁺ T淋巴细胞亚群中起主要免疫效应的辅助性T细胞的活化增殖和细胞因子分泌^[24]，因此，作者推测脐带间充质干细胞于术后早期引起的Treg细胞增加与CD4⁺/CD8⁺比值下降之间可能存在一定的关系，即Treg细胞可能通过调节CD4⁺ T淋巴细胞主要亚群的增殖，进而影响CD4⁺ T淋巴细胞的整体含量，并导致CD4⁺/CD8⁺ T淋巴细胞比值的下降。此研究中试验组术后早期Treg细胞含量高于对照组，提示输注脐带间充质干细胞后受者处于免疫调节状态，发生排斥反应的概率降低。但是术后远期两组之间淋巴细胞亚群无明显差异，这可能与后期受者体内脐带间充质干细胞含量减少有关，因此需考虑是否增加输注次数及缩短输注间隔以达到更加理想的效果。关于肝移植后间充质干细胞输注频次及间隔时间目前尚有待摸索，需要根据间充质干细胞在体内的迁移、定植及存活的时间，结合个体，并根据患者输注后的反应及疗效观察进行及时调整，因此细胞治疗相对于传统药物治疗而言可能对个体化治疗要求更高。

动物实验研究表明间质干细胞植入原位肝移植受体内能够较为迅速地恢复受体肝功能，减轻肝组织免疫排斥反应，并有效延长其生存期^[25]。临床上，对于肝移植术后输注脐带间充质干细胞能否加快移植肝功能的恢复及减少免疫排斥反应尚未有明显证据的支持，研究结果显示两组术后肝功能的趋势相同，差异无显著性意义，但是试验组患者术后出现肝功能异常事件的发生率明显低于对照组，差异有显著性意义，这可能说明了间充质干细胞在肝移植患者术后肝功能的恢复及减少排斥反应方面有一定的改善作用。研究处于临床初步探索阶段，样本量较少，观察时间尚短，在临床方面需继续积累病例和术后随访做进一步的研究。

作者发现脐带间充质干细胞应用早期极少发生严重不良反应，与其他许多临床研究的结果相一致^[26-28]。两组患者移植相关术后并发症发生率无明显差异，两组的感染发生率相同，说明脐带间充质干细胞的免疫抑制作用是可调控的。间充质干细胞的致瘤性是其应用的最大争议点，有学者提出间充质干细胞可能导致肿瘤的发生或促进了预先存在的肿瘤的发展，他们认为间充质干细胞移植前为了获得足够数量的细胞，进行了广泛的体外扩增从而增加了基因突变的风险，最终导致恶性转化^[29]。但是也有学者提出了不同的观点，认为体外扩增出现的恶变是由于在实验室中使用的细胞株的交叉污染导致^[30]。Miura等^[31-32]实验也证实了人类间充质干细胞经过几次传代扩增后其衰老未见有明显的体外永生化的迹象。此研究中试验组患者术后随访12个月内未发现恶性肿瘤，但仍需要进行长期的随访。

目前关于间充质干细胞的临床研究都还只是短期或中期的试验结果，虽然还有许多人对以间充质干细胞为基础的细胞治疗的长期安全性及可行性持谨慎态度^[33]，但是间充质干细胞治疗已为多种严重疾患和损伤带来了治愈的生机，这些成果给相关研究以极大鼓舞，然而在肝移植及其他实体器官移植领域的转化应用却刚刚起步，随着对间充质干细胞生物特性的进一步了解，合理的理论支撑和初步临床实践，有理由期待干细胞治疗在肝移植领域乃至器官移植领域大有所为，将为诸多移植相关的瓶颈问题提供新的解决思路和策略。

结论：①人脐带间充质干细胞对肝移植患者的免疫调节作用保持在可控的范围之内，不会增加感染等并发症，未见明显致瘤性，安全性较好；②肝移植患者输注人脐带间充质干细胞后早期可促进外周血Treg细胞的增殖和活化，降低CD4⁺(辅助性/诱导性T细胞)含量及CD4⁺/CD8⁺ T淋巴细胞的比值，进而改善肝移植受者免疫状态。术后远期两组之间淋巴细胞亚群无明显差异，可能与后期受者体内人脐带间充质干细胞含量减少有关，因此需要根据间充质干细胞在体内的迁移、定植及存活的时间，结合个体，进一步探索间充质干细胞的输注频次及间隔时间；③肝移植患者输注人脐带间充质干细胞后，出现肝功能异常事件的发生率明显低于对照组，这提示间充质干细胞对肝移植患者术后肝功能恢复及减少排斥反应方面有一定的改善作用。

人脐带间充质干细胞应用于肝移植患者的观察

Clinical application of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in liver transplantation patients

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