肝衰竭患者血浆置换前后血清诱导脐带间充质干细胞向肝细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.006

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (17): 2659-2664.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.17.006

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肝衰竭患者血浆置换前后血清诱导脐带间充质干细胞向肝细胞的分化

王晶波¹，耿大影²，李晓迎¹，陈莉³，徐凤³，史兆章⁴

济南市传染病医院，¹三科，²中心实验室，⁴介入科，山东省济南市 250021；³济南赛尔生物科技有限公司，山东省济南市 250021

修回日期:2017-02-13 出版日期:2017-06-18 发布日期:2017-06-29
通讯作者: 史兆章，副主任医师，济南市传染病医院介入科，山东省济南市 250021
作者简介:王晶波，女，1969年生，山东省龙口市人，汉族，1992年山东医科大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事病毒性肝炎临床诊疗研究。
基金资助:
2012年度济南市科技局无资计划项目；山东省医药卫生科技发展计划项目(2014WS0006)

Hepatic failure patient’s serum before and after plasmapheresis induces the differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatic cells

Wang Jing-bo¹, Geng Da-ying², Li Xiao-ying¹, Chen Li³, Xu Feng³, Shi Zhao-zhang⁴

¹Third Department, ²Central Laboratory, ⁴Department of Intervention, Jinan Municipal Hospital for Infectious Diseases, Jinan 250021, Shandong Province, China; ³Cell Biology, Jinan 250021, Shandong Province, China

Revised:2017-02-13 Online:2017-06-18 Published:2017-06-29
Contact: Shi Zhao-zhang, Associate chief physician, Department of Intervention, Jinan Municipal Hospital for Infectious Diseases, Jinan 250021, Shandong Province, China
About author:Wang Jing-bo, Master, Associate chief physician, Third Department, Jinan Municipal Hospital for Infectious Diseases, Jinan 250021, Shandong Province, China
Supported by:
the Non-funded Project of Jinan Science and Technology Department in 2012; the Medical and Health Development Plan of Shandong Province, No. 2014WS0006

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
肝衰竭：肝脏作为人体重要器官之一，具有合成、解毒、代谢、分泌、生物转化以及免疫防御等功能，故又被称为“加工厂”。当受到多种因素(如病毒、酒精、药物等)引起的严重损害时，造成肝细胞大量坏死，导致上述功能发生严重障碍或失代偿，进而出现以凝血机制障碍和黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群，称之为肝衰竭。
脐带间充质干细胞：是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它是一类能在体外分化、增殖，具有自我更新和多向分化潜能的低免疫原性成体干细胞，能分化为多种组织细胞，现有研究已证实脐带间充质干细胞凭借其多向分化潜能可适当在体内、外条件下诱导分化为肝细胞。

摘要
背景：脐带间充质干细胞治疗肝衰竭已经取得了一定的疗效，但是肝衰竭患者的血清微环境对脐带间充质干细胞分化的影响尚未见报道。
目的：探讨慢加急性肝衰竭患者血浆置换前、后血清对脐带间充质干细胞向功能肝细胞分化的影响。
方法：采用组织块贴壁培养法获得脐带间充质干细胞并进行细胞形态及表型鉴定；取第3代脐带间充质干细胞，用含有肝衰竭患者血浆置换前、后血清的α-MEM培养基诱导培养，常规胎牛血清培养基为对照组，显微镜下观察各组细胞的形态，免疫组化检测细胞甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18的表达水平。
结果与结论：①组织块贴壁培养法能够获得大量高纯度的脐带间充质干细胞，细胞高表达CD44，CD73，CD90，CD105，不表达CD45，符合间充质干细胞的表型特征；②慢加急性肝衰竭患者血清可改变脐带间充质干细胞的形态，并诱导脐带间充质干细胞表达甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18。血浆置换后血清组3种蛋白阳性率高于血浆置换前血清组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果表明，肝衰竭患者血浆置换后血清更加有利于脐带间充质干细胞生长及向肝细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6834-8183(王晶波)

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 血浆置换, 肝衰竭, 肝细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: Umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) have made certain curative effect on hepatic failure, but little is reported on the effect of hepatic failure patient’s serum microenvironment on UC-MSCs differentiation ability.
OBJECTIVE: To investigate the effect of hepatic failure patient’s serum on the differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatic cells.
METHODS: UC-MSCs were isolated by tissue adherent method and the cell morphology and phenotype identified by microscope and flow cytometry. Alpha-MEM media with serum before/after plasmapheresis were used to culture the third generation of UC-MSCs, and regular fetal bovine serum culture medium acted as control group. Inverted microscope was used to observe the cell morphology in three groups. Immunohistochemical method was used to measure expression level of alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin 18.
RESULTS AND CONCLUSION: A great amount of high-purity UC-MSCs could be obtained using tissue adherent method, which highly expressed CD44, CD73, CD90, CD10, but did not express CD45. Hepatic failure patient’s serum could change the morphology of UC-MSCs and induce UC-MSCs to express alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin 18. The positive expression of alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin 18 was significantly increased after plasmapheresis (P < 0.05). To conclude, hepatic failure patient’s serum after plasmapheresis exert more benefits to induce UC-MSCs to differentiate into hepatic cells than that before plasmapheresis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Liver Failure, Plasma Exchange, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

王晶波，耿大影，李晓迎，陈莉，徐凤，史兆章. 肝衰竭患者血浆置换前后血清诱导脐带间充质干细胞向肝细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(17): 2659-2664.

Wang Jing-bo, Geng Da-ying, Li Xiao-ying, Chen Li, Xu Feng, Shi Zhao-zhang. Hepatic failure patient’s serum before and after plasmapheresis induces the differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatic cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(17): 2659-2664.

图/表（结果） 2

2.1 脐带间充质干细胞形态和增殖能力 接种后6-10 d可见组织块周围有成纤维样细胞爬出，2周左右细胞达到70%-80%融合。传代后，细胞呈现形态均一的长梭形、多角形，而且细胞生长迅速，一般传代两三天后即可达到80%融合，多以平行或漩涡状生长，见图1。

采用CCK-8法检测各代脐带间充质干细胞的增殖活性，可见各代细胞潜伏期均在一两天，细胞生长较缓慢，随即进入对数生长期，持续三四天后，第6天细胞进入平台期，细胞增殖缓慢。第1，3，5代细胞生长迅速，增殖较快，细胞数量也高于同期的第7代细胞，表明细胞代数越早，细胞活力越高，见图2。

2.2 脐带间充质干细胞表型 体外培养的脐带间充质干细胞高表达CD44，CD90，CD73和CD105，纯度在95%以上，不表达造血细胞标记CD45，具备典型的脐带间充质干细胞表型特征，见图3。

2.3 诱导后脐带间充质干细胞向肝细胞分化的形态变化 加入血浆置换前或置换后肝衰竭患者血清培养的脐带间充质干细胞形态发生改变，由原来的长梭形变为多边形，细胞较大而扁平，对照组细胞仍呈典型的长梭形，未发生任何变化，见图4。

2.4 诱导后甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18的表达水平 对照组细胞在培养过程中均未见3种蛋白表达；实验组诱导后甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18的表达均有显著变化，血浆置换后血清组3种蛋白表达水平明显高于血浆置换前血清组，差异有显著性意义(P < 0.05)。甲胎蛋白阳性率在培养第7天达到峰值，培养14，21 d表达变弱；白蛋白和细胞角蛋白在培养14 d时开始表达，培养21 d表达变强，见表1。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 于2012年12月至2015年12月在济南市传染病医院完成。

1.3 材料

1.3.1 主要试剂 胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)；L-谷氨酰胺和双抗溶液(Invitrogen公司)；血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、上皮细胞生长因子和血小板衍生生长因子(R&D公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；α-MEM培养基(Hyclone公司)；鼠抗人CD44-FITC、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE单克隆抗体和同型对照(BD公司)；SP免疫组织化学试剂盒(迈新公司)；鼠抗人甲胎蛋白、白蛋白、细胞角蛋白单克隆抗体(BD公司)。

1.3.2 主要仪器设备 二氧化碳培养箱(Thermo Fisher公司)；酶标仪(BIO-TEK公司)；倒置显微镜(OLYMPUS公司)；生物安全柜(Thermo Fisher公司)；流式细胞仪(EMD Millipore公司)。

1.3.3 临床资料 选取5名健康新生儿脐带(来源于山东大学齐鲁医院)，产妇身体健康，产前检查无遗传性疾病，无任何急慢性疾病和传染性疾病，抗HIV血清检测阴性及乙肝血清检测阴性，年龄在30岁以下，产妇及其家属自愿签署脐带捐献知情同意书。

选取济南市传染病医院慢加急性肝衰竭患者23例，其中男16例，女7例，年龄(40.5±12.0)岁，临床诊断均符合肝衰竭诊疗指南2012年版有关标准。研究方案已通过济南市传染病医院医学伦理委员会审核批准。采用ACH-10持续徐缓式血液净化装置，首次治疗前行单针双腔导管股静脉置管，每次置换血浆量2 500 mL，每位患者行血浆置换最少1次，最多6次，间隔时间2-4 d。收集患者首次血浆置换治疗前和治疗后的全血20 mL做后续实验。

1.4 方法

1.4.1 脐带间充质干细胞的分离培养 于超净工作台中，将获得的新生儿脐带剪成2.0-3.0 cm小段，用添加双抗的PBS多次漂洗，洗去脐带表面及血管内的血液，去除脐带外膜组织和血管，将剩余华通胶剪碎后，均匀平铺于细胞培养瓶底，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱放置24 h，补加间充质干细胞基础培养基。培养7 d后全量换液，细胞融合度达80%时传代，以后每隔两三天按照1︰3比例进行传代、扩增。

1.4.2 脐带间充质干细胞生长曲线测定 取第1，3，5，7代脐带间充质干细胞，胰酶消化收获细胞，按2×10⁷ L^-¹细胞浓度接种到96孔板中，每孔200 μL，调零孔中加入新鲜培养基200 μL，放置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中孵育。24 h后取出96孔板，每孔加入20 μL CCK-8试剂，放入培养箱中培养4 h，用全自动酶标仪(波长=450 nm)检测各孔吸光度值(各检测孔的吸光度值-调零孔的吸光度值)，绘制细胞生长曲线。

1.4.3 脐带间充质干细胞的细胞表型鉴定 收集第3代脐带间充质干细胞悬液，离心弃上清，PBS洗2遍，离心弃上清，PBS重悬细胞，每管加入2×10⁵个细胞/100 μL，分别加入鼠抗人的PE或FITC标记的单克隆抗体CD44-FITC、CD45-PE、CD73-PE、CD90-PE、CD105-PE各1 μL，充分混匀，4 ℃避光孵育30 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬并洗涤2次，离心后弃上清，PBS重悬细胞后上机检测。

1.4.4 肝衰竭患者血清的采集 使用不含抗凝剂的采血管采集肝衰竭患者不同时期的血液20 mL，2 000 r/min离心10 min，收集上层血清，56 ℃灭活30 min，取样做无菌检查后分装置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4.5 脐带间充质干细胞的诱导分化 取第3代脐带间充质干细胞，胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，以1×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于6孔培养板中(孔中预先放置多聚赖氨酸包被的无菌盖玻片)，每孔2 mL。实验分组：①对照组：常规培养基组，含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基诱导培养；②血浆置换前血清培养基组：含体积分数为20%血浆置换前血清的α-MEM培养基诱导培养；③血浆置换后血清培养基组：含体积分数为20%血浆置换后血清的α-MEM培养基诱导培养，每组设置12个培养孔。接种后2 d全量换液，以后每三四天换液1次，倒置显微镜下逐日观察细胞生长形态，并分别于培养的第7，14，21天留取适量细胞进行检测。

1.4.6 检测甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白18的表达水平 甲醛固定细胞，PBS冲洗细胞3次，5 min/次，然后按照SP免疫组织化学试剂盒说明书进行操作。甲胎蛋白和白蛋白的一抗以1︰200稀释；细胞角蛋白18的一抗以1︰50稀释，二抗稀释浓度均为1︰200，PBS代替抗体作为阴性对照。按照说明书步骤染色后，电子显微镜下观察细胞染色情况，染成黄色或棕黄色者均为阳性。每张病理图片按照上下中左右的范围选取10个视野，每个视野观察100个细胞，统计阳性细胞数，以阳性细胞百分率来表示甲胎蛋白、白蛋白或细胞角蛋白18的阳性表达率。

1.5 主要观察指标 ①脐带间充质干细胞的形态、增殖能力和表型；②血清诱导后脐带间充质干细胞的形态；③脐带间充质干细胞诱导不同时间后甲胎蛋白、白蛋白和细胞角蛋白的表达水平。

1.6 统计学分析 采用统计学软件SPSS 19.0分析实验数据，计量资料以x(_)±s表示，治疗前后比较行配对设计的t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

血浆置换是临床上用于治疗肝衰竭的一种有效方法，可帮助患者过渡到肝移植或者不需要进行肝移植。血浆置换可以暂时替代部分肝脏的功能，有效清除有害物质，减少炎症递质，减轻肝脏炎症反应，为肝细胞再生提供时间和良好的环境^[13-15]。

脐带间充质干细胞是从脐带的不同部位如华通胶、脐静脉内皮、血管及其周围组织分离得到的一种间充质干细胞^[16-18]。实验成功分离脐带间充质干细胞，应用流式细胞仪检测其细胞表面标志，细胞表面标志物CD44，CD90，CD73和CD105高表达，纯度在95%以上，而不表达造血细胞表面标志物CD45，说明具备典型的间充质干细胞表型特征。

脐带间充质干细胞不仅易于体外分离培养扩增，而且免疫原性低、不存在免疫排斥反应^[19-21]，能够诱导向成骨、软骨、神经、脂肪和肌肉等多种组织细胞分化^[22-24]。脐带间充质干细胞目前也是用于治疗肝病的一种重要细胞疗法，在临床上已经取得了一定的疗效^[25-29]。多项研究显示脐带间充质干细胞可诱导分化为肝细胞，且诱导的肝细胞样细胞与肝细胞具有相同功能^[30-41]：Lee等^[42]使用制瘤素M(oncostatin M，OSM)及肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)诱导脐带间充质干细胞分化为成熟肝细胞；碱性成纤维细胞生长因子提高小鼠骨髓细胞向肝系细胞分化效率。因此，研究血浆置换前后患者血清对脐带间充质干细胞向肝细胞分化的影响，为人工肝联合脐带间充质干细胞治疗肝衰竭提供实验数据和理论支持。实验将第3代脐带间充质干细胞分为3组：分别用含有肝衰竭患者血浆置换前、后血清的α-MEM培养基以及常规含胎牛血清的α-MEM培养基诱导培养，倒置显微镜下观察加入血浆置换前或置换后肝衰竭患者血清培养的脐带间充质干细胞形态发生改变，由原来的长梭形变为多边形，细胞较大而扁平，对照组细胞仍呈典型的长梭形，未发生任何变化。

甲胎蛋白是由肝前体细胞分泌的胞浆蛋白，随着细胞的成熟而逐渐消失，成熟肝细胞不表达甲胎蛋白，可以作为未成熟肝细胞的特异性标志^[43-45]。实验结果显示，诱导培养7 d后，血浆置换前血清组和置换后血清组均检测到甲胎蛋白的表达，14 d后表达水平明显下降。该结果印证了肝系细胞从不成熟到成熟的发展过程。白蛋白和细胞角蛋白18是成熟肝系细胞的2个标志^[46]。白蛋白也是一种胞浆蛋白，由体内成熟肝细胞分泌，广泛用于判断肝细胞功能。血浆置换后血清组的白蛋白表达随时间增长，阳性增强，21 d时达到最强，同样符合肝细胞由不成熟到成熟的生长规律。细胞角蛋白18，顾名思义，属于角蛋白的一种，同样表达于成熟的肝细胞。实验结果也证实该蛋白的表达符合肝细胞由不成熟到成熟的表达规律。以上实验结果说明血浆置换可促进脐带间充质干细胞向肝细胞分化，且在人工肝内环境改善后更能促进脐带间充质干细胞分化为成熟肝细胞。该实验结果为人工肝联合脐带间充质干细胞治疗肝衰竭提供了重要的实验依据。但是血浆置换后患者血清中是否存在促进肝细胞增殖或动员干细胞向肝细胞分化的因子，以及是否调控某些基因的表达，这还需要进一步的研究考证。

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肝衰竭内科综合治疗死亡率高达50%-90%，其治疗难点，同时也是需要把握的关键点有以下4个方面：①阻止肝细胞进一步坏死；②促进肝细胞再生；③为肝细胞再生创造良好条件；④积极预防并发症。目前，肝衰竭的治疗方案主要包括基础支持、药物、人工肝、干细胞和肝移植5种。间充质干细胞为经典干细胞疗法之一，因取材方便、无伦理限制、对供者无损伤等优势，在肝病治疗领域中有着广泛的应用前景，当前研究已证实，间充质干细胞可从以下方面发挥肝功能保护作用：①直接分化为肝细胞，发挥替代治疗作用；②通过分泌多种细胞因子来调节免疫细胞，从而抑制炎症反应；③不仅能直接诱导肝星状细胞凋亡或抑制其启动，同时分泌抗纤维化物质如肝细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子等，减少细胞外基质沉积、抑制肝纤维化形成。

临床上，间充质干细胞治疗肝衰竭的可行性和有效性已得到确切证实，目前尚需解决的问题主要是如何控制其操作条件，如移植时机、移植数量、移植途径、肝衰竭患者的内环境等，以提高临床应用效果。本研究重点分析肝衰竭患者血浆置换前、后血清对脐带间充质干细胞向功能肝细胞分化的影响，发现肝衰竭患者血浆置换后血清更加有利于脐带间充质干细胞生长及向肝细胞分化，证实血浆置换内环境改善后行脐带间充质干细胞移植可获得更好的效果。该研究是对肝衰竭患者行间充质干细胞治疗合理控制操作条件的补充，能够为提高间充质干细胞治疗效果提供依据。

肝衰竭患者血浆置换前后血清诱导脐带间充质干细胞向肝细胞的分化

Hepatic failure patient’s serum before and after plasmapheresis induces the differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatic cells

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