补肾活血通络胶囊干预SD大鼠骨性关节炎滑膜及软骨细胞miR-27a的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.16.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
补肾活血通络胶囊：方中选用当归、川芎补血活血之功，为君药；鹿茸、龟板、淫羊藿、海星补肾壮阳、强筋骨，为臣药，助君药以补肾活血生骨，诸药合用，具有补益肝肾、强筋壮骨、活血通络、行气止痛之功。
MicroRNAs(miRNAs)：是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小为20-25个核苷酸。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。

摘要
背景：补肾活血通络胶囊是多年的临床验方，在治疗膝关节骨性关节炎效果明显，但是其疗效机制一直未明确。
目的：探讨补肾活血通络胶囊对SD大鼠膝关节骨性关节炎滑膜细胞miR-27a的调控作用。
方法：将采用Hulth法成功建立膝关节骨性关节炎模型的120只SD大鼠随机分为空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。空白组大鼠根据体质量予以75 mg/kg生理盐水灌胃，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠依据体质量予按34，75，140 mg/kg补肾活血通络胶囊水溶剂灌胃，2次/d，15 d为1疗程，连续灌胃2个疗程，每个疗程间间隔2 d。4组大鼠在灌胃1疗程、2个疗程后分批次取得大鼠膝关节滑膜及软骨，运用实时荧光定量PCR技术测定各组大鼠膝关节滑膜及软骨细胞miR-27a含量的表达。
结果与结论：①大体观察可见补肾活血通络胶囊干预后的大鼠膝关节骨性关节炎模型的滑膜和软骨退变程度要轻于未经补肾活血通络胶囊干预的大鼠；②实时荧光定量PCR显示空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组滑膜及软骨miRNA-27a的表达量呈升高趋势，以高剂量最高，组间对比差异有显著性意义(P < 0.05)；③结果说明，补肾活血通络胶囊可抑制大鼠膝关节骨性关节炎模型滑膜及软骨细胞miRNA-27a表达量的降低，进而减缓大鼠膝关节骨性关节炎的退变，起到保护膝关节的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

ORCID: 0000-0002-0768-6995(孙志涛)

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 骨性关节炎, 膝关节, 中药, 动物实验

Abstract:

BACKGROUND: Bushen Huoxue Tongluo Capsule, a well-known traditional prescription, exhibits remarkable treatment outcomes in knee osteoarthritis, but the underlying mechanism is not fully understood.
OBJECTIVE: To explore the regulatory effect of Bushen Huoxue Tongluo Capsule on miR-27a of synovial cells in Sprague-Dawley rats with knee osteoarthritis.
METHODS: The model of knee osteoarthritis was established in 120 Sprague-Dawley rats using Hulth method, and then these rat models were randomized into four groups, followed by given75 mg/kg normal saline (blank control group), 34 (low-dose group), 75 (medium-dose group) and 140 (high-dose group) mg/kg Bushen Huoxue Tongluo Capsule aqueous solvent via gavage according to body mass, respectively, twice daily, for consecutive 2 courses (15 days as a course) with 2 days in between. The synovium and cartilages were removed after each course, and the expression of miR-27a in the knee joint synovium and chondrocytes was determined by real-time quantitative PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Gross observation found that the degeneration of synovium and cartilage in the Bushen Huoxue Tongluo Capsule groups was milder than that in the blank control group. Real-time PCR revealed that there was an increasing trend in the expression of miRNA-27a in the synovium and cartilage in each group, especially in the high-dose group, and there was a significant difference between groups (P < 0.05). Our findings show that Bushen Huoxue Tongluo Capsule can suppress the reduced expression of miRNA-27a in the synovium and chondrocytes in rats with knee osteoarthritis, further alleviating knee degeneration and protecting the knee from damage.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Knee Joint, Drugs, Chinese Herbal, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

孙志涛，赖居易，何升华，王业广，王建，冯华龙，黄飞强. 补肾活血通络胶囊干预SD大鼠骨性关节炎滑膜及软骨细胞miR-27a的变化[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(16): 2484-2488.

Sun Zhi-tao, Lai Ju-yi, He Sheng-hua, Wang Ye-guang, Wang Jian, Feng Hua-long, Huang Fei-qiang. Effect of Bushen Huoxue Tongluo Capsule on miR-27a in the synovium and chondrocytes in Sprague-Dawley rats with osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(16): 2484-2488.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2016年1月在北京大学深圳医院中心实验室完成。

1.3 材料

实验动物：成年雄性SD大鼠120只，平均体质量(220±20) g，由广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2013-0002。

药物：补肾活血通络胶囊组成为当归、川芎；鹿茸、龟板、淫羊藿、海星，三七、血竭、丹参、炮山甲、蜈蚣、土鳖虫、地龙，冰片、人工牛黄，肉桂，以上药物均由深圳市中医院药剂科提供。

补肾活血胶囊的制备方法：上述药材由深圳市中医院药剂科加工制备，包括囊粉、囊壳，囊粉为主药，由上述中药所组成；囊壳由明胶或聚乙二醇30%-60%、甘油0.8%-2%、附加剂0.1%-0.5%和水28%-55%所组成。将所述中药粉碎成细粉，再加入冰片1份、薄荷油2份，制得。

主要实验仪器：立减压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂LDZX-50KBS)。漩涡振荡机(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)，Heraguard EC超净工作台(美国Thermo Scientific公司)，单道可调移液器(德国 Eppendorf艾本德公司)，凝胶成像分析仪 JS-5608(上海培清科技有限公司)，CFX96荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，Power Pac Basic电泳仪(美国 Bio-Rad公司)，Leica倒置显微镜(上海徕卡仪器有限公司)，分光光度计(上海元析仪器有限公司)。

主要实验试剂：miScript II反转录试剂盒凯杰 218161(上海玉博生物科技有限公司)，mi Script SYBR Green PCR检测试剂盒凯杰218073(上海玉博生物科技有限公司)，琼脂糖(西安吉诺泰生物科技有限公司)，氯仿、异丙醇(南京森贝伽生物科技有限公司)，Trizol试剂(美国Sigama)。引物miRNA-27a及内参由美国ABI公司合成。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模、分组及给药 购得的120只SD大鼠采用Hulth法建立膝关节骨性关节炎模型，SD大鼠造模前禁食12 h，依据不同体质量经腹腔注射体积分数10%水合氯醛溶液(3.5 mL/kg)，麻醉成功后，SD大鼠取仰卧位固定于操作台。双膝关节刮毛备皮后用碘伏消毒，无菌条件下于膝关节内侧作约2 cm的纵形切口，打开关节腔。将髌骨向外侧推至脱位使膝关节处于最大屈曲状态，暴露关节腔后切断右膝前交叉韧带、内侧副韧带及内侧半月板，注意保护关节软骨面，行抽屉试验阳性后彻底止血，逐层缝合。术后连续3 d肌肉注射青霉素4×10⁴U/d，第4天起每天驱赶动物奔跑30 min，其余时间任其笼内自由活动^[7]。

120只经造模4周后的SD大鼠按随机数字表随机分为空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组30只。空白组大鼠根据体质量予以75 mg/kg生理盐水灌胃，低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠依据体质量予按34，75，140 mg/kg的补肾活血通络胶囊水溶剂灌胃，2次/d，15 d为1疗程，连续灌胃2个疗程，每个疗程间间隔2 d。4组大鼠在灌胃1疗程、2个疗程后分批次处死并在无菌操作下取得大鼠膝关节滑膜及软骨组织置于液氮中保存。

1.4.2 RT-PCR与实时荧光定量PCR

RNA提取：采用RNeasy^®Lipid Tissue Mini Kit试剂盒提取软骨总RNA。将关节软骨和滑膜剪碎后置入研钵，在液氮下研磨成粉状，根据试剂盒说明书步骤逐步提取RNA，待乙醇快挥发完时，将提取的RNA加入RNase-free水溶解沉淀，待沉淀完全溶解后于-80 ℃保存，并通过琼脂糖凝胶电泳来检测总RNA的完整性。

反转录反应：采用mi Script II RT Kit (50)进行反转录反应。在冰上，用0.2 mL PCR管配置20 μL总反应体系，然后混匀，低速离心。放到带热盖的PCR仪上，反应条件：37 ℃ 60 min，95 ℃ 5min，然后-20 ℃保存反转录合成cDNA。选择的样本A₂₆₀/A₂₈₀的比值在1.8-2.0之间。反转录反应体系如下：4 μL 5*miscript hispec buffer，2 μL 10*miscript Nucleics Mix，9 μL RNase-free water，2 μL miscrpt Reverse TranscriptiaseMix，3 μL Template RNA，总反应体积为20 μL。

RT-PCR测定滑膜、软骨中mi RNA-27a的含量：采用mi Script SYBR Green PCR Kit (200)试剂，在荧光定量PCR仪上按照标准步骤进行反应。95 ℃预变5 min，一个cycle。变性15 s 94 ℃，退火30 s 55 ℃，延伸30 s 70 ℃，40个cycle。反应完成后根据结果计算2^-^??Ct值进行定量分析。PCR反应体系如下：12.5 μL 2*Quantiect SYBR Green PCR，2.5 μL 10*miscript Universal Primer，2.5 μL 10*miscript Primer Assay 27a，5 μL RNase-free water，2.5 μL Template CDNA，总反应体积为25 μL。实时荧光定量PCR反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳以进一步检测PCR反应的成功。

1.5 主要观察指标 ①大鼠滑膜及软骨变化；② miRNA-27a在大鼠软骨、滑膜组织中的表达情况。

1.6 统计学分析 计量资料实验数据结果以x(_)±s表示，采用SPSS 18.0统计分析，组间比较，正态性数据且方差齐者采用one-way ANOVA分析(LSD/SNK-q)，方差不齐者采用Dunnett T3分析；非正态性数据采用非参数检验。α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

膝关节骨性关节炎属于中国传统医学“痹证”范畴^[8]，中医认为骨痹发病机制当属肝肾亏虚，筋骨失养，夹杂风寒湿邪痹阻所致^[9]。有学者根据《张氏医通》“膝为筋之府，膝痛无有不因肝肾虚者”，提出与年老体衰、肝肾亏虚也会引起本病^[10]。肾主骨、肝主筋，肝肾亏虚则不能养骨荣筋^[11]。也有学者认为则认为，本病与血瘀也有关系，瘀血停留于经络脏腑组织之间，影响了气血的正常运行，“不通则痛”^[12]；瘀血不去，新血不生，机体得不到气血津液的正常滋润和濡养，日久则筋枯骨痿，“不荣则痛”^[13]。

该病的发病机制在现代医学研究中仍不十分清楚，临床缺乏理想的早期干预方法。目前对膝关节骨性关节炎的研究主要涉及滑膜、软骨、软骨下骨等方面^[14]，由于滑膜在膝关节骨性关节炎的早期，始终参与其病理过程，其分泌的炎症递质和软骨降解酶，参与免疫反应，介导软骨的破坏^[15]。近年来，研究发现miRNA基因调控网络参与了膝关节骨性关节炎病理生理过程，miRNA参与了细胞的新陈代谢^[16]，在细胞凋亡、分化和器官的发育过程中发挥巨大的作用^[17]。在骨关节炎的相关研究中，科研人员已经发现越来越多的miRNA与关节炎的发生有着千丝万缕的联系^[18-22]，通过大量关节炎临床样本发现，这些内源性的miRNA表达水平发生了明显的改变^[23]。由于miRNA所靶向的目的基因的不同，其发挥的作用也不尽相同，对关节炎的病情发展起着抑制作用或促进作用^[24]。其中，miR-675、miR-223、miR140等与关节炎的发生、发展密切相关^[17]，研究显示，miR-140通过抑制聚蛋白多糖酶II的合成，减少了软骨基质的分解^[25]，miR-675通过调节软骨基质中Col2A1的表达，起到修复关节软骨的作用^[26]。研究发现间充质干细胞分化为软骨细胞的过程中，miR-221表达增高可引起软骨形成抑制^[27]，进一步研究发现，miR-221通过负调节Mdm2的表达，进而抑制Slug蛋白的降解来调节软骨细胞的增殖和软骨的形成^[28]。但随着研究不断深入，研究者发现尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)及基质金属蛋白酶3是膝关节骨性关节炎病理过程中两个关键的降解酶^[29-30]，uPA可裂解Ⅳ型胶原酶，并介导细胞外基质蛋白水解，同时激活纤溶酶原或间接激活其他蛋白水解酶，降解细胞外基质及基底膜^[31]。基质金属蛋白酶3是一种基质金属蛋白酶，可降解细胞基质中的蛋白多糖及多种基质蛋白，最新研究发现uPA是基质金属蛋白酶3的始动因子之一，基质金属蛋白酶3与uPA共同作用于软骨细胞外基质使其降解，促进了膝关节骨性关节炎的发展。uPA的表达受某些特定microRNA的调控，其中调控作用最强的是miR-27a。一份研究证实，miRNA-27a在大鼠膝关节骨性关节炎模型中滑膜和软骨中表达与膝关节骨性关节炎疾病发展有相关^[32]。

实验发现通过补肾活血通络胶囊干预后的大鼠膝关节骨性关节炎模型的滑膜和软骨退变程度要轻于未经补肾活血通络胶囊干预的大鼠，且空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组滑膜及软骨miRNA-27a的表达量呈升高趋势，以高剂量最高。说明补肾活血通络胶囊能明显调控miRNA-27a的表达量。补肾活血通络胶囊是临床经验方，具有较好的临床效果，方中选用当归、川芎补血活血之功，为君药；鹿茸、龟板、淫羊藿、海星补肾壮阳、强筋骨，为臣药，助君药以补肾活血生骨，三七、血竭、丹参、炮山甲、蜈蚣、土鳖虫、地龙活血化瘀、破血消征，助君药补肾活血之功，为佐药；冰片、人工牛黄清热解毒止痛，一助君药通络止痛，二制臣药；温补过甚，为佐药，肉桂引火归元，为引经之使药，诸药合用，具有补益肝肾、强筋壮骨、活血通络、行气止痛之功。本实验研究发现补肾活血通络胶囊可抑制大鼠miRNA-27a表达量的降低，进而减缓大鼠膝关节骨性关节炎的退变，起到保护膝关节的作用，这可能是补肾活血通络胶囊作用于人体的机制之一^[33-36]，但仍需进一步的研究。

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